MALDI-TOF MS技術快速檢測產(chǎn)KPC酶肺炎克雷伯菌的研究

田俊華， 邵平揚， 陳 蕾， 李麗娜， 陸斌斌， 顧敏燕， 彭佳媛

(嘉興市第一醫(yī)院 檢驗科， 浙江 嘉興 314000)

肺炎克雷伯菌為條件致病菌，廣泛存在于水、土壤等環(huán)境中，同時也容易定植在住院患者的呼吸道和腸道部位，引發(fā)患者院內(nèi)獲得性感染[1].近年來肺炎克雷伯菌在全球范圍內(nèi)廣泛傳播，已成為嚴重的公共衛(wèi)生威脅之一，受到臨床醫(yī)生的極大關注.我國細菌耐藥監(jiān)測網(wǎng)數(shù)據(jù)顯示，肺炎克雷伯菌對碳青霉烯類藥物的平均耐藥率為7.6%，個別地區(qū)肺炎克雷伯菌對碳青霉烯類藥物的耐藥率達20.0%[2].肺炎克雷伯菌對碳青霉烯類藥物耐藥的重要原因是菌株產(chǎn)生碳青霉烯酶(klebsiella pnuemoniaecarbapenemase，KPC)[3]，因此快速鑒別產(chǎn)KPC酶肺炎克雷伯菌是控制肺炎克雷伯菌耐藥性擴散的關鍵環(huán)節(jié).本文采用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS)檢測產(chǎn)KPC酶肺炎克雷伯菌，該技術具有快速鑒別的優(yōu)點.

1 材料與方法

1.1 菌株

從臨床血液、尿液、痰液標本中分離肺炎克雷伯菌，采用美國BD公司Phoenix-100全自動鑒定藥敏分析儀對菌株的各種生化反應進行鑒定，完成鑒定的肺炎克雷伯菌菌株于-80 ℃保存?zhèn)溆?

1.2 藥敏試驗

采用美國BD公司Phoenix-100全自動鑒定藥敏分析儀對肺炎克雷伯菌進行藥敏試驗.抗菌藥物包括阿米卡星、亞胺培南、美羅培南、頭孢他啶，頭孢吡肟、氨曲南、哌拉西林/他唑巴坦.依據(jù)美國臨床和實驗室標準協(xié)會(CLSI)M100標準判讀藥敏試驗結果[4].以銅綠假單胞菌(ATCC27853)、大腸埃希菌(ATCC25922)為質(zhì)控菌株.

1.3 KPC檢測[5]

采用改良Hodge試驗檢測肺炎克雷伯菌菌株產(chǎn)KPC的能力.將大腸埃希菌ATCC 25922菌液均勻涂布于MH平板上，在平板中心貼美羅培南紙片(10 μg/片)；取3～5個待測菌株菌落，從紙片邊緣向外劃直線，劃線長度不小于20～25 mm，放于35 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)16～20 h；若待測菌株向平板中央生長，則為產(chǎn)KPC酶菌株，反之為不產(chǎn)KPC酶菌株.以肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1705為陽性質(zhì)控菌株，肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1706為陰性質(zhì)控菌株.

1.4 質(zhì)譜檢測

將待測菌株接種于鄭州人福博賽生物技術公司提供的血平板上，35 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h，取適量待測菌落涂布于檢測靶板，加入質(zhì)譜樣品處理基質(zhì)溶液，嚴格按照廠家操作說明，采用法國生物梅里埃VITEKS質(zhì)譜儀采集待測菌株的質(zhì)譜峰圖.儀器參數(shù)為線性正離子模式，采集區(qū)間為2 000～20 000(m/z).采用BioExplorer軟件進行質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析.

1.5 統(tǒng)計學方法

應用SPSS22.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，計數(shù)資料以百分率表示，組間比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義.

2 結 果

2.1 肺炎克雷伯菌的藥敏試驗

27株不產(chǎn)KPC酶肺炎克雷伯菌對阿米卡星、亞胺培南、美羅培南、頭孢他啶，頭孢吡肟、氨曲南和哌拉西林/他唑巴坦7種藥物敏感；38株產(chǎn)KPC酶肺炎克雷伯菌藥敏結果見表1，結果顯示，產(chǎn)KPC酶肺炎克雷伯菌對亞胺培南、美羅培南、頭孢他啶、頭孢吡肟、氨曲南和哌拉西林/他唑巴坦的耐藥率為100.0%，提示產(chǎn)KPC酶肺炎克雷伯菌的耐藥性較高.

表1 產(chǎn)KPC酶肺炎克雷伯菌的耐藥率

2.2 產(chǎn)KPC酶肺炎克雷伯菌和不產(chǎn)KPC酶肺炎克雷伯菌的質(zhì)譜檢測

產(chǎn)KPC酶肺炎克雷伯菌的質(zhì)譜圖(202#菌株部分)見圖1；不產(chǎn)KPC酶肺炎克雷伯菌的質(zhì)譜圖(2#菌株部分)見圖2.圖1和圖2顯示，產(chǎn)KPC酶肺炎克雷伯菌與不產(chǎn)KPC酶肺炎克雷伯菌的質(zhì)譜峰位置不同.

依據(jù)38株產(chǎn)KPC酶肺炎克雷伯菌和27株不產(chǎn)KPC酶肺炎克雷伯菌的質(zhì)譜圖，分析不同質(zhì)荷比(m/z)的質(zhì)譜峰在2類肺炎克雷伯菌中出現(xiàn)的頻率，結果見表2.

表2 產(chǎn)KPC酶菌株與不產(chǎn)KPC酶菌株的質(zhì)譜峰分布頻率

由表2可知，產(chǎn)KPC酶菌株和不產(chǎn)KPC酶菌株的7個質(zhì)譜峰的分布頻率有統(tǒng)計學差異(P<0.01)，這些質(zhì)譜峰的質(zhì)荷比(m/z)分別是2 070.27、2 183.65、2 209.78、2 225.73、8 309.74、8 369.67和8 372.50.質(zhì)荷比為8 309.74處的質(zhì)譜峰診斷產(chǎn)KPC酶肺炎克雷伯菌的敏感度為68.4%，特異性為100%；質(zhì)荷比為2 209.78處的質(zhì)譜峰診斷產(chǎn)KPC酶肺炎克雷伯菌的敏感度為84.2%，特異性為96.3%；質(zhì)荷比為8 309.74 和2 209.78處的質(zhì)譜峰聯(lián)合診斷產(chǎn)KPC酶肺炎克雷伯菌的敏感度為89.5%，特異性為96.3%.

3 討論與結論

目前臨床上常用的細菌藥敏試驗檢測方法主要有紙片法、稀釋法、E-test法等.這些方法一般需要將細菌培養(yǎng)8～18 h，因此無法滿足臨床對細菌藥物敏感性快速鑒定的需求，不利于及時指導臨床合理用藥.MALDI-TOF MS是一種新興的軟電離質(zhì)譜技術，其樣本制備簡捷，只需1～2個細菌純菌落，無須蛋白提純，2～3 min即可獲得檢測結果.MALDI-TOF MS檢測技術效率高、準確性好、成本低，被廣泛應用于細菌、真菌、分枝桿菌等微生物的快速鑒定[6-7].

近年來，MALDI-TOF MS技術也被用于檢測細菌的耐藥性，檢測原理是：與敏感菌株相比，耐藥菌株MALDI-TOF MS檢測圖譜會出現(xiàn)峰值坐標位置移動、峰值缺失或增加和特定峰值強度改變，利用軟件對足夠數(shù)量的耐藥菌株圖譜進行分析，可以構建出耐藥菌株質(zhì)譜圖譜數(shù)據(jù)庫.將MALDI-TOF MS檢測樣本菌株得到的圖譜與耐藥菌株質(zhì)譜圖譜數(shù)據(jù)庫進行比對，即可判斷其耐藥性或區(qū)分耐藥菌株亞種[8].國外學者報道[9]，MALDI-TOF MS能夠鑒別甲氧西林耐藥金黃色葡萄球菌(methicillin-resistance staphylococcus aureus，MRSA)和甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌(methicillin-sensitive staphylococcus aureus，MSSA).另有學者發(fā)現(xiàn)[10]，MRSA和MSSA在500～3 500(m/z)內(nèi)存在差異，其中2個特征峰有鑒別意義，能夠用于快速區(qū)分MRSA和MSSA，單個標本鑒別耗時約10 min，臨床應用前景良好.本研究發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)KPC酶肺炎克雷伯菌和不產(chǎn)KPC酶肺炎克雷伯菌在1 900～8 500(m/z)范圍內(nèi)存在多個不同質(zhì)荷比的質(zhì)譜峰，質(zhì)荷比為8 309.74和2 209.78處的質(zhì)譜峰聯(lián)合診斷產(chǎn)KPC酶肺炎克雷伯菌的敏感度為89.5%，特異性為96.3%，提示應用MALDI-TOF MS技術可以快速檢測產(chǎn)KPC酶肺炎克雷伯菌，這為肺炎克雷伯菌耐藥性監(jiān)測提供了一種快速監(jiān)測的方法，值得推薦臨床應用.