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    熒光探針法研究蘆丁與DNA 的相互作用

    2020-10-22 08:04:42喬春玉張重越朱傳勇
    化學(xué)與粘合 2020年2期
    關(guān)鍵詞:熔點蘆丁常數(shù)

    喬春玉,張重越,閆 鵬*,朱傳勇

    (1,黑龍江工程學(xué)院 材料與化學(xué)工程學(xué)院,黑龍江 哈爾濱 150050;2,黑龍江中醫(yī)藥大學(xué) 附屬第一醫(yī)院 病理科,黑龍江 哈爾濱 150040)

    前 言

    DNA 是一種重要的遺傳物質(zhì),也是許多藥物小分子在生物體內(nèi)發(fā)生作用的靶點,它特定的雙螺旋結(jié)構(gòu)是識別小分子與其作用的重點研究對象。近年來,藥物小分子與DNA 相互作用研究得到了廣泛的關(guān)注[1~2]。藥物分子與DNA 作用機(jī)理的研究對于闡明藥物分子對DNA 的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄過程的影響以及DNA 靶向藥物分子設(shè)計提供重要的參考信息。

    蘆?。ńY(jié)構(gòu)見圖1)又稱為蕓香甙,維生素P,紫槲皮甙,路丁,路通等。是廣泛存在于植物中的黃酮醇配糖體,是淡黃色或淡綠色針狀結(jié)晶或結(jié)晶粉末。其藥用價值也很高,如槐米中的蘆丁,能降低血管的脆性、改善血管的通透性、降低血脂和膽固醇,用于防治老年高血壓和腦溢血。本文以溴化乙錠(EB,結(jié)構(gòu)見圖2)做為探針,利用光譜法對蘆丁(rutin)與DNA 的結(jié)合機(jī)制進(jìn)行了研究。

    圖1 蘆丁的結(jié)構(gòu)式Fig. 1 The molecular structure of rutin

    圖2 EB 的結(jié)構(gòu)式Fig. 2 The molecular structure of EB

    1 實驗部分

    1.1 試劑

    鮭魚精DNA,溴化乙錠,蘆丁。除非特殊注明,本實驗所用的DNA 為雙螺旋DNA,試劑均為分析純。

    1.2 儀器

    RF-5301 PC 熒光光度計,GBC Cintra 10e 紫外- 可見光譜儀,烏氏黏度計,pHS-3C 數(shù)字酸度計,電子恒溫水浴鍋。

    1.3 實驗方法

    采用紫外法研究DNA 的熔點曲線,監(jiān)測DNA、以及DNA- 蘆丁的最大紫外吸收峰,實驗中每隔2~5℃記錄一次讀數(shù)。

    按照選定的濃度比,在含有DNA-EB 的溶液中,加入適量的蘆丁,配制一系列含有不同濃度的蘆丁而DNA-EB 溶液的濃度保持不變的分析試液,分別測定溶液在15℃,25℃,35℃和45℃的熒光光譜。

    固定DNA 的濃度,將不同濃度的蘆丁加入到溶液中,測定蘆丁對DNA 黏度的影響。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 DNA 熔點的研究

    實驗采用紫外法研究DNA 的熔點曲線。通過加熱的方法使DNA 變性,當(dāng)雙螺旋結(jié)構(gòu)失去一半時的溫度稱為該DNA 的熔點,用Tm 表示。DNA 發(fā)生變性時,表現(xiàn)為增色效應(yīng)。當(dāng)達(dá)到Tm 時,DNA 分子內(nèi)50%的雙鏈結(jié)構(gòu)打開,即增色效應(yīng)達(dá)到一半時的溫度。

    圖3 蘆丁不存在和存在的情況下DNA 的熔點變化曲線Fig. 3 The melting curves of DNA in the absence of rutin(a)and in the presence of rutin(b).

    實驗分別測定了DNA、DNA- 蘆丁的熔點,如圖3 所示。通常小分子與DNA 相互作用能夠影響其熔點Tm,其中嵌入式作用能使DNA 的雙螺旋結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定,Tm 會增加5~8℃,但是非嵌入作用不能使熔點溫度有明顯的增加[3]由圖3 可以看出,當(dāng)向DNA 溶液中加入蘆丁后,DNA 體系的熔點溫度明顯增加。由此,我們可以判斷蘆丁與DNA 的結(jié)合作用是嵌入式的的結(jié)合。

    2.2 熒光性質(zhì)的研究

    實驗首先測定了一組含一定濃度EB 而不同濃度DNA 溶液的熒光強(qiáng)度,結(jié)果如圖4 所示。由圖可見,溶液的熒光強(qiáng)度隨著DNA 的加入逐漸增強(qiáng),并且當(dāng)DNA 的加入量達(dá)到一定值時,體系的熒光強(qiáng)度不再增加,這表明EB 與DNA 的結(jié)合已經(jīng)趨于飽和。

    圖4 EB 的熒光強(qiáng)度隨DNA 濃度的增加而增加Fig. 4 The fluorescence intensity of EB with the increasing concentration of DNA

    圖5 蘆丁存在時DNA-EB 的熒光光譜Fig. 5 The fluorescence spectra of DNA-EB in the presence of rutin

    在選定的實驗條件下,分別測定DNA-EB 體系在加入蘆丁前后的熒光譜圖,結(jié)果見圖5。由圖可以看到,隨著蘆丁濃度增大,DNA-EB 溶液的熒光強(qiáng)度逐漸減弱,說明蘆丁與DNA-EB 發(fā)生相互作用并形成新的復(fù)合物。根據(jù)猝滅機(jī)理可將熒光猝滅分為動態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅兩種,猝滅常數(shù)隨溫度升高而減小的為靜態(tài)猝滅,反之則為動態(tài)猝滅[4]。

    為了判斷反應(yīng)的猝滅機(jī)理,我們先假設(shè)蘆丁對DNA-EB 體系的猝滅過程是動態(tài)猝滅,那么其作用過程遵循 Stern-Volmer 方程[5]:

    F0和F 分別是猝滅劑加入前后熒光物質(zhì)的熒光強(qiáng)度;Kq(單位:L·mol-1·s-1)是雙分子猝滅過程的速率常數(shù);τ0是沒有猝滅劑存在下熒光分子的平均壽命,對于一般物質(zhì)而言,τ0≈10-8s;[Q]是猝滅劑的濃度;Ksv(單位:L·mol-1)是Stern-Volmer 猝滅常數(shù)。

    圖6 是在不同溫度下,蘆丁猝滅DNA-EB 體系熒光的Stern-Volmer 曲線。由圖可見,Ksv值隨溫度的升高降低了,這說明蘆丁對體系熒光強(qiáng)度的猝滅不是動態(tài)猝滅。另外,通過計算得到25℃時蘆丁的Kq是 3.89×1012L·(mol·s)-1,遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于動態(tài)猝滅最大碰撞猝滅速率常數(shù) 2.0×1010L·(mol·s)-1[6],這進(jìn)一步表明蘆丁對DNA-EB 體系的熒光猝滅不是由于動態(tài)碰撞,而是源于兩者之間形成了復(fù)合物,即靜態(tài)猝滅過程。

    圖6 在15℃(a), 25℃(b), 35℃(c)and 45℃(d)時蘆丁-DNAEB 的 Stern-Volmer 曲線Fig. 6 The Stern-Volmer curves at 15℃(a), 25℃(b), 35℃(c)and 45℃(d)of rutin-DNA-EB

    圖7 蘆丁在不同溫度下1 /(F0- F)對[Q]-1 的一元擬合曲線Fig. 7 The plots of 1 /(F0-F)versus [Q]-1 for rutin at various temperatures

    利用靜態(tài)猝滅公式[7]:

    可得到不同溫度下的雙倒數(shù)Lineweaver-Burk圖,斜率KDF0-1與截距F0-1之比為KD,即熒光體與猝滅劑的解離常數(shù),進(jìn)而就可以得到結(jié)合常數(shù)KA(KA=1/KD)。

    圖7 是蘆丁與DNA-EB 體系在不同溫度下以1/(F0- F)對[Q]-1做的一元擬合。其結(jié)合常數(shù) KA列于表1 中。從表1 所示的結(jié)果可以看出,蘆丁與DNA-EB 的結(jié)合常數(shù)隨著溫度的升高而增加,這說明他們的結(jié)合是吸熱的反應(yīng)。

    表1 蘆丁與DNA-EB 在不同溫度下的結(jié)合常數(shù)Table 1 The binding constants(KA)of the rutin with DNAEB at various temperatures

    2.3 黏度實驗

    黏度法是研究小分子與DNA 作用模式的另一種最有力的實驗方法,因為它對DNA 的長度變化比較敏感[8]。一般來說,如果小分子與DNA 通過經(jīng)典嵌入方式結(jié)合時,DNA 相鄰堿基對的距離會變大以容納插入的配體,導(dǎo)致DNA 雙螺旋鏈伸長,由此使DNA 溶液的黏度增大[9];當(dāng)藥物分子以靜電、溝槽結(jié)合等非嵌入方式與DNA 作用時,DNA 溶液的黏度沒有明顯變化[10]。在25℃測定了蘆丁對DNA黏度的影響。被測液體的相對黏度按下式計算[11]:

    其中:

    η——被測溶液的相對黏度;

    t0——緩沖液流經(jīng)毛細(xì)管所需的時間;

    t——DNA 溶液流經(jīng)毛細(xì)管所需的時間。

    根據(jù) Cohen 和 Eisenberg 理論[12],以(η /η0)1/3對r 作圖,可以得到蘆丁對DNA 溶液黏度的影響,如圖8 所示。其中η0表示DNA 溶液的相對黏度,r是蘆丁與DNA 的結(jié)合比率。

    結(jié)果表明,隨著蘆丁濃度的增加,DNA 溶液的黏度增大了。這進(jìn)一步說明,這蘆丁與DNA 的方式是嵌入式的。

    圖8 蘆丁對DNA 相對黏度的影響Fig. 8 The effect on the relative viscosity of DNA in the presence of rutin

    3 小 結(jié)

    本文以EB 作為DNA 的熒光探針研究了蘆丁與DNA 相互作用的機(jī)理,通過熒光性質(zhì)的研究得到,蘆丁與DNA 的結(jié)合常數(shù)為3.72×104L·mol-1。通過熔點曲線,黏度測試驗證了蘆丁與DNA 的結(jié)合方式是嵌入式結(jié)合。

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