烏藥葉中總黃酮的含量測定及提取工藝優(yōu)選

孫 嫣 業(yè) 康 毛培江 王志安#

1 杭州市第一人民醫(yī)院 浙江 杭州 310006

2 浙江省中藥研究所有限公司 浙江 杭州 310023

烏藥，為樟科植物烏藥Lindera aggregata（Sims）Kosterm的干燥塊根，有行氣止痛、溫腎散寒的功效。烏藥作為浙江的道地藥材，使用至今已經(jīng)有一千多年的歷史，其具有良好的醫(yī)用價值。本實驗采用紫外分光光度法測定烏藥葉提取物中總黃酮含量，并對影響提取總黃酮的因素進行了考察，通過正交試驗優(yōu)選出最佳提取工藝，為中藥新藥的研發(fā)提供技術(shù)支持。

1 試劑與儀器

1.1 實驗藥品與試劑：烏藥葉干品由浙江紅石梁集團天臺山烏藥有限公司供給，于當年春季的浙江天臺地區(qū)，經(jīng)蒸（殺青）、揉捻、干燥（溫度55～60℃，時間6～7h）等工序加工制得，由浙江中藥研究所有限公司中藥資源室鑒定為樟科胡椒屬植物烏藥[Lindera aggregata（Sims）Kosterm.]的葉片（批號為20180501）；蘆丁對照品，由中國食品藥品檢定研究院提供（批號為100080-201610），純度為92.6%；95%乙醇為食品級；無水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、甲醇均為分析純；實驗用水為純化水，提取用水為飲用水。

1.2 實驗儀器：上海亞榮RE-5210A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；Shimadzu UV-2550型紫外可見分光光度計；上海精宏DKS24型電熱恒溫水浴鍋；昆山KQ-100DB型超聲波提取儀。

2 方法與結(jié)果

2.1 烏藥葉提取工藝的優(yōu)選：分述如下。

2.1.1 烏藥葉提取溶劑的選擇：前處理：烏藥葉粉碎，過20目篩。水提物：烏藥葉粗粉200g加入6倍量的水煎煮提取2次，每次1小時，提取液減壓濃縮（60℃，－0.07～－0.1Mpa）至1g生藥/ml。醇提物：烏藥葉粗粉200g加入6倍量70%乙醇回流提取2次，每次0.5小時，提取液減壓濃縮（60℃，－0.07～－0.1Mpa）至1g生藥/ml。烏藥葉水提和醇提兩種方式的固形物提取率分別為12.49%和10.67%，總黃酮提取率分別為2.21%和3.46%，說明兩種方法都可以提取總黃酮。

2.1.2 烏藥葉醇提工藝參數(shù)優(yōu)選：為了確定烏藥葉的最佳提取條件，按總黃酮提取率（%）為主要指標，以單因素實驗考察提取溶劑乙醇的濃度，實驗設(shè)置50%、70%、90%3個水平，烏藥葉粗粉200g分別加各個濃度的乙醇6倍量提取2次，每次0.5小時，提取液減壓濃縮（60℃，－0.07～－0.1Mpa）至1g生藥/ml。結(jié)果顯示，烏藥葉在70%乙醇提取固形物提取率較低，總黃酮提取率為3.46%，提取率最高。

選用L9（34）表對烏藥葉提取次數(shù)（A）（1次、2次、3次）、提取時間（B）（0.5h、1h、1.5h）、溶劑用量（C）（4倍、6倍、8倍）3個因素進行醇提正交實驗，根據(jù)各個因素均確定為3個水準。在70%乙醇提取的烏藥葉中正交實驗記錄見表1、表2，方差法結(jié)果表明：FA＞F0.05（2，2），因素A的水平變化對本次實驗結(jié)果有顯著性影響，本實驗提取工藝的最佳方案為：烏藥葉加6倍量70%乙醇提取2次，第1次1小時，第2次0.5小時，可獲得較好的提取效果。

表1 烏藥葉總黃酮乙醇提取正交實驗

表2 方差分析表

2.1.3 烏藥葉水提工藝參數(shù)優(yōu)選：選用L9（34）表對提取次數(shù)（A）（1次、2次、3次）、提取時間（B）（0.5h、1h、1.5h）、溶劑用量（C）（6倍、8倍、10倍）3個因素進行水提正交實驗，根據(jù)每個因素均確定為3個水平，按優(yōu)化的醇提工藝提取后的烏藥葉藥渣再用水作為溶劑進行提取，藥材量按最初投料量計。正交實驗記錄見表3、表4，方差法結(jié)果表明：FA＞F0.05（2，2），因素A的水平變化對實驗結(jié)果存在顯著性影響，提取工藝的最佳方案為：烏藥葉加8倍量水提取2次，第1次1小時，第2次0.5小時，可獲得較好的提取效果。

表3 烏藥葉總黃酮水提取正交實驗

表4 方差分析表

2.2 烏藥葉中總黃酮的含量測定：分述如下。

2.2.1 蘆丁標準溶液配制：精確稱取蘆丁標準品，用無水甲醇溶解并定容，配制成每毫升含蘆丁0.2mg的蘆丁標準溶液。

2.2.2 試樣處理：精密量取提取液適量，水定容至25ml。取樣0.5ml，置10ml容量瓶中，甲醇加至3.5ml，再加0.5ml亞硝酸鈉溶液（5%），混勻，室溫放置6min，再加0.5ml硝酸鋁溶液（10%），混勻，放置6min，再加5ml氫氧化鈉溶液（1%），混勻，用水定容至刻度，放置12min后，以空白溶液為參比，在波長510nm處測吸光度，按標準曲線計算供試品溶液中蘆丁的重量（mg）即得。

2.2.3 蘆丁標準曲線制備：準確吸取蘆丁標準溶液0、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5ml，分別置于 10ml容量瓶中，加甲醇至3.5ml，按2.2.2方法顯色，以空白溶液為參比，在波長510nm處測定吸光度。以吸光度作為縱坐標，質(zhì)量作為橫坐標，繪制蘆丁標準曲線。

2.2.4 烏藥葉中總黃酮測定方法學(xué)考察：①線性：在0.208～0.728mg質(zhì)量范圍內(nèi)有較好的線性關(guān)系，線性方程為y=1.022x+0.001，線性相關(guān)系數(shù)R=0.9994。②精密度：取蘆丁對照品2.5ml，按法測定吸光度，平行測定5次，計算吸光度RSD=0.21%，該方法精密度較好。③穩(wěn)定性：取同一批號烏藥葉提取物樣品1份，按方法處理后間隔一定時間測定吸光度，結(jié)果RSD為0.34%，顯示4小時內(nèi)樣品穩(wěn)定。④重復(fù)性：取同一批號的烏藥葉提取物樣品6份，檢測總黃酮含量。結(jié)果表明平均值為46.89mg/ml，RSD為0.155%，該方法重復(fù)性較好。⑤回收率：取重復(fù)性樣品，平行6份，分別加入適量對照品，按方法檢測總黃酮含量，計算回收率。結(jié)果表明回收率在95%～102%范圍，RSD＜3%，該方法準確度較好。

表5 回收率實驗

3 分析與討論

采用醇提和水提對烏藥葉進行提取研究，發(fā)現(xiàn)兩者均能提取出一定比例的總黃酮，推測黃酮類成分可能以苷類和游離狀態(tài)同時存在于烏藥葉中，經(jīng)單因素考察確定提取用乙醇濃度為70%，經(jīng)正交實驗確定本實驗選用先醇提后水提的方法，可以獲得更高的總黃酮提取率。亞硝酸鈉-硝酸鋁法為中華人民共和國藥典常用的檢測總黃酮含量的方法，通過考察該方法檢測烏藥葉總黃酮的線性、穩(wěn)定性、精密度、重復(fù)性和回收率，證明此方法簡單可靠，適合烏藥葉及其提取物的總黃酮含量檢測。