益氣活血通陽法不同配比促兔缺血心肌血管新生作用的研究

溫志浩，盧健棋，潘朝鋅，何新兵，王慶高，黃明劍，彭志林，龐 延，周宇楨，黃舒培

目前我國冠心病的一級和二級預(yù)防還做得遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠[1]，很多病人在確診冠心病時(shí)冠狀動(dòng)脈病變已經(jīng)非常嚴(yán)重，彌漫病變和多支病變不在少數(shù)，喪失了介入治療或手術(shù)治療的時(shí)機(jī)，現(xiàn)有藥物治療亦無法有效改善心肌缺血，成為目前治療的難點(diǎn)。此外，目前介入治療費(fèi)用較高，很多病人難以負(fù)擔(dān)?；谖覈鴩?，找到一種既能有效改善病人癥狀和預(yù)后，又能獲得較高衛(wèi)生經(jīng)濟(jì)學(xué)收益的辦法是非常有必要的。目前的研究重點(diǎn)集中在刺激缺血心肌血管生成方面，即促進(jìn)冠狀動(dòng)脈側(cè)支循環(huán)建立，改善缺血心肌血供。不過目前存在促血管新生作用不理想及血管新生相關(guān)副作用的研究瓶頸[2]。中醫(yī)辨證論治在促血管新生方面具有一定的優(yōu)勢，臨床研究認(rèn)為氣虛、陽虛、血瘀是引起冠心病發(fā)生發(fā)展的重要因素，既往的研究也提示益氣、通陽、活血藥對促血管新生有獨(dú)特的作用[3-4]?；诖?，本研究旨在利用高脂飲食和冠狀動(dòng)脈結(jié)扎法造成兔動(dòng)脈粥樣硬化和急性心肌梗死雙模型[5]，觀察不同組方的安心顆粒對急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)兔梗死邊緣區(qū)心肌微血管密度的影響，并同步測定動(dòng)脈粥樣硬化斑塊內(nèi)新生血管密度等副反應(yīng)指標(biāo)，從整體和微觀層次來闡述益氣活血通陽法對心肌梗死兔心臟的促血管新生作用及其副反應(yīng)的發(fā)生情況，為益氣活血通陽法促進(jìn)缺血心肌血管新生提供科學(xué)依據(jù)，并為平衡促血管新生作用和血管新生相關(guān)副反應(yīng)提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取健康雄性新西蘭兔50只，2月齡，體重2.7～3.0 kg，購自廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，動(dòng)物合格證編號(hào)：45000300000676，許可證編號(hào)：scxk(桂)2014-0002。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑及儀器 Envision試劑(HRP/Rabbit)即用型(Dako，丹麥)；CD34單克隆抗體(santacruz，美國)；醫(yī)學(xué)圖像分析軟件(申騰信息技術(shù)有限公司，上海)。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物模型制備

1.3.1.1 復(fù)制動(dòng)脈粥樣硬化動(dòng)物模型 健康雄性新西蘭兔50只，按體重隨機(jī)編入各組，每組5只。單籠飼養(yǎng)，第1周先予普通飼料喂養(yǎng)，以適應(yīng)周圍環(huán)境。后給予高脂飲食喂養(yǎng)，每只150 g/d，連續(xù)喂養(yǎng)8周，復(fù)制動(dòng)脈粥樣硬化動(dòng)物模型。

1.3.1.2 復(fù)制急性心肌梗死和動(dòng)脈粥樣硬化動(dòng)物雙模型 隨機(jī)選取高脂飲食第2周末的動(dòng)物，用3%戊巴比妥鈉30 mg/kg注入耳緣靜脈麻醉后仰臥位固定在兔臺(tái)上，氣管插管連接小動(dòng)物呼吸機(jī)，胸前區(qū)備皮、消毒、鋪巾，沿左胸骨旁線劃開皮膚后逐層鈍性分離組織，分離至肋骨層面后在胸骨旁線處剪斷第2、3肋骨，撐開器充分暴露視野，找到縱隔后小心剪開心包，將心包固定在胸壁上，找到心臟前室間溝，用3號(hào)外科縫線于前室間溝上1/3處結(jié)扎前降支血管，結(jié)扎遠(yuǎn)端心肌顏色由淡紅變蒼白，搏動(dòng)幅度減弱，30 min后剪斷結(jié)扎線，逐層關(guān)閉胸腔，待動(dòng)物恢復(fù)自主呼吸，拔除氣管插管，肌內(nèi)注射青霉素預(yù)防感染。術(shù)后第3天沿原開口開胸，觀察見心臟較前變大，搏動(dòng)明顯減弱，取出心臟，固定后行病理切片HE染色。顯示急性心肌梗死復(fù)制成功。

1.3.2 給藥方案 安心顆粒組方：紅參10 g，水蛭10 g，桂枝12 g，瓜蔞殼12 g，茯苓10 g等。紅參、水蛭用乙醇提取，其余藥物用水提取。參考基線等比增減設(shè)計(jì)法，按照7種比例(10∶0、10∶4、10∶7、10∶10、7∶10、4∶10、0∶10)稱取紅參、水蛭，按照前期經(jīng)過正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)得到的最佳提取方案進(jìn)行提取，即70%乙醇提取，每次提取1.5 h，提取3次，每次10倍量乙醇，合并乙醇提取液，回收乙醇至盡，置于蒸發(fā)皿中水浴濃縮，合并水提部分，定容后備用；安心顆粒連續(xù)給藥10周，給藥劑量按兔與人體表面積折合換算。

1.3.3 實(shí)驗(yàn)分組 空白組：正常飲食，予生理鹽水灌胃。假手術(shù)組：正常飲食，只開胸穿線，不結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支，術(shù)后給予生理鹽水灌胃。模型組：高脂飲食，行結(jié)扎前降支術(shù)后給予生理鹽水灌胃。西藥對照組：于開胸結(jié)扎冠狀動(dòng)脈后立即在結(jié)扎處周圍噴灑堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)。中藥組：亞組1～亞組7術(shù)后分別給予紅參/水蛭比例為10∶0、10∶4、10∶7、10∶10、7∶10、4∶10、0∶10的安心顆粒灌胃液。

1.4 取材 缺血心肌標(biāo)本取材：將心臟沿短軸水平橫切，于梗死邊緣區(qū)切取組織標(biāo)本，置入10%中性甲醛中固定24 h，常規(guī)石蠟包埋。動(dòng)脈標(biāo)本取材：取胸主動(dòng)脈橫截取材，常規(guī)固定包埋。

1.5 檢測 采用En Vision法[6]行CD34免疫組化染色測定CD34陽性反應(yīng)強(qiáng)度及新生血管密度，陽性反應(yīng)強(qiáng)度=陽性反應(yīng)面積/平均光密度。染色呈棕黃色為陽性，參照Kaku等[7]介紹的方法，在低倍鏡下選擇CD34標(biāo)記的新生血管密度高的區(qū)域，100倍鏡下計(jì)數(shù)3個(gè)視野，取其平均值，管腔>8個(gè)紅細(xì)胞直徑的血管不計(jì)在內(nèi)。

2 結(jié) 果

2.1 各組心肌組織不同區(qū)域新生血管密度比較 模型組和西藥對照組缺血心肌區(qū)新生血管密度大于梗死心肌區(qū)和正常心肌區(qū)(P<0.05)；在缺血心肌區(qū)，紅參與水蛭比例10∶4組與西藥對照組新生血管密度比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，優(yōu)于其他比例中藥組及模型組(P<0.05)，說明紅參、水蛭比例為10∶4能夠更有效地促進(jìn)缺血心肌區(qū)的血管新生。詳見表1。

表1 各組心肌組織不同區(qū)域新生血管密度比較 (±s) 單位：根/mm2

2.2 各組心肌組織不同區(qū)域CD34陽性反應(yīng)強(qiáng)度比較 模型組和各用藥組缺血心肌區(qū)CD34陽性反應(yīng)強(qiáng)度大于梗死心肌區(qū)和正常心肌區(qū)(P<0.05)，說明缺血心肌區(qū)的血管新生密度較為密集。在缺血心肌區(qū)，紅參與水蛭比例10∶4組與西藥對照組CD34陽性反應(yīng)強(qiáng)度比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，10∶4中藥組與西藥對照組優(yōu)于模型組(P<0.05)。詳見表2。

表2 各組心肌組織不同區(qū)域CD34陽性反應(yīng)強(qiáng)度比較 (±s)

2.3 各組主動(dòng)脈壁區(qū)CD34陽性反應(yīng)強(qiáng)度比較 各組主動(dòng)脈壁區(qū)CD34陽性反應(yīng)強(qiáng)度比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見表3。

表3 各組第10周主動(dòng)脈CD34陽性反應(yīng)強(qiáng)度比較 (±s)

3 討 論

近年來，冠心病在我國的發(fā)病率呈逐漸升高態(tài)勢[8]。隨著冠心病發(fā)病年齡的年輕化，其造成的社會(huì)經(jīng)濟(jì)和衛(wèi)生負(fù)擔(dān)也越來越大。由此，冠心病的治療受到了國內(nèi)外的廣泛關(guān)注。臨床治療指南不斷推出和更新，血運(yùn)重建治療技術(shù)不斷發(fā)展，但基于我國目前國情，許多病人仍難以承受介入治療的藥物及器械相關(guān)費(fèi)用，且部分病人由于血管條件或基礎(chǔ)病等原因無法實(shí)行介入或冠狀動(dòng)脈搭橋等血運(yùn)重建治療。因此，尋求更為經(jīng)濟(jì)的冠心病血運(yùn)修復(fù)策略是臨床實(shí)踐迫切需要的。

基于上述認(rèn)識(shí)，采取了包括蛋白治療、基因治療、細(xì)胞治療和聯(lián)合治療等方法以實(shí)現(xiàn)治療性血管再生[2]，關(guān)于血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factors，VEGFs)、成纖維細(xì)胞生長因子(fibroblast growth factors，F(xiàn)GFs)和內(nèi)皮祖細(xì)胞等研究日益增多。目前雖然很多一期試驗(yàn)得到了肯定的結(jié)論[9]，但近年的二期臨床試驗(yàn)卻沒有得到陽性結(jié)果[10]，且還暴露了包括促動(dòng)脈狹窄、形成不穩(wěn)定斑塊、促腫瘤生長、視網(wǎng)膜增生等多種副作用[11]。有科學(xué)家就此提出了“Janus Phenomenon”的概念，即具有促血管新生作用的藥物同樣具有加重動(dòng)脈粥樣硬化的作用[12]，這是治療上廣受關(guān)注的一個(gè)矛盾點(diǎn)。故尋找具有肯定促血管新生作用而沒有相關(guān)副作用的藥物，已經(jīng)成為當(dāng)今心血管研究的重大課題。

益氣通陽、活血通脈成為冠心病的重要治療法則。而進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，這些治療方法對血管新生的多個(gè)環(huán)節(jié)均有作用。有研究顯示：人參、三七提取物可促進(jìn)血管生成信號(hào)通路上VEGF R-2的表達(dá)[13]；而復(fù)方芪丹液則被發(fā)現(xiàn)能夠持續(xù)上調(diào)促VEGF、bFGF的基因與蛋白的表達(dá)，提高缺血心肌毛細(xì)血管密度[14]。近年來，許多實(shí)驗(yàn)研究證明，活血化瘀法能通過調(diào)節(jié)血脂代謝、抑制血管平滑肌增生和遷移、保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞等多個(gè)環(huán)節(jié)發(fā)揮減輕動(dòng)脈粥樣硬化病變和穩(wěn)定斑塊的作用[15-16]。由此，通過益氣藥和活血藥的合理配伍，可能會(huì)為“Janus Phenomenon”提供解決方案。

安心顆粒是全國名老中醫(yī)方顯明教授研制的驗(yàn)方，已于臨床上應(yīng)用多年，由人參、桂枝、瓜蔞、水蛭、茯苓等中藥制成，方中人參大補(bǔ)元?dú)?、安神益心為君；桂枝通陽行脈、助陽化氣，為臣藥；水蛭活血逐瘀、通脈散結(jié)；瓜蔞理氣寬胸、化痰泄?jié)?，同為佐藥；茯苓益心、脾，寧心安神，為使藥。諸藥合用共奏甘溫益氣、活血通陽之功效。前期研究表明，安心顆?？擅鞔_改善心肌缺血癥狀，減少冠心病介入術(shù)后不良心血管事件的發(fā)生[17]。實(shí)驗(yàn)研究則提示安心顆粒對大鼠心肌缺血再灌注損傷有顯著的保護(hù)作用[18]，并可抑制粥樣硬化斑塊形成[19]?，F(xiàn)代藥理研究表明，人參皂苷Rgl可動(dòng)員骨髓干細(xì)胞歸巢于缺血心肌，有效促進(jìn)微血管形成，通過上調(diào)VEGF及其受體的表達(dá)，促進(jìn)血管再生，促進(jìn)缺血心臟功能恢復(fù)[20]；瓜蔞能擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈，改善心肌缺血狀態(tài)。此外，另有研究顯示，水蛭不僅可以促進(jìn)血管新生[21]，也可降低經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療(PCI)術(shù)后再狹窄發(fā)生率[22]。

本實(shí)驗(yàn)研究利用高脂飲食和冠狀動(dòng)脈結(jié)扎法造成兔動(dòng)脈粥樣硬化和急性心肌梗死雙模型，觀察不同組方的安心顆粒對急性心肌梗死兔梗死邊緣區(qū)心肌新生微血管密度的影響，并同步測定動(dòng)脈粥樣硬化斑塊內(nèi)CD34反應(yīng)強(qiáng)度等副反應(yīng)指標(biāo)，結(jié)果提示，安心顆粒中藥干預(yù)組中，紅參與水蛭比例為10∶4中藥組可顯著增加缺血心肌區(qū)新生血管密度，10∶4中藥組CD34陽性反應(yīng)強(qiáng)度顯著高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與西藥對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。而同時(shí)在主動(dòng)脈壁區(qū)CD34反應(yīng)強(qiáng)度未見升高。故考慮益氣活血藥物的合理配比可促進(jìn)梗死邊緣區(qū)血管新生，同時(shí)未見導(dǎo)致動(dòng)脈斑塊內(nèi)血管新生的副作用。