老藥新用：基于基因表達(dá)譜和Connectivity Map對丹參酮ⅡA藥理作用的再認(rèn)識

盛 松，黃 燁，楊志旭，李 婧，徐鳳芹

丹參酮ⅡA(Tanshinone ⅡA，TanⅡA)是從唇形科中藥丹參及其同科屬植物的根分離提取得到的活性單體成分，為二萜醌類化合物。經(jīng)體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)TanⅡA主要具有抗血小板聚集、抑制血栓形成、降低血液黏度、擴(kuò)張冠狀動脈、改善心肌供血、減小心肌梗死面積等藥理作用，可以治療動脈粥樣硬化、急性冠脈綜合征等疾病[1]。目前關(guān)于TanⅡA的藥理研究主要集中在心血管方面，關(guān)于其他方面的研究較少，因此，難以全面評價(jià)Tan ⅡA的藥理作用。近年來，基于基因表達(dá)譜和Connectivity Map(Cmap)對已上市的藥物發(fā)現(xiàn)新適應(yīng)證或新用途，進(jìn)行重評價(jià)、重定用途、重新定位治療方向，已成為一個(gè)新的研究熱點(diǎn)。相對于傳統(tǒng)的藥物研究，基于已知藥物的重新定位，不僅能夠節(jié)省藥物研發(fā)的時(shí)間和成本，而且能夠擴(kuò)大藥物的應(yīng)用范圍，并對不同藥物的作用機(jī)制進(jìn)行橫向?qū)Ρ?，是一個(gè)不可或缺的藥物研究方式[2]。目前已經(jīng)有學(xué)者成功應(yīng)用Cmap驗(yàn)證了抗菌藥小檗堿可以作為組蛋白去乙?；?HDAC)抑制劑和哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)抑制劑發(fā)揮抗腫瘤作用[3]。這種成功的先例提示可以把這種方法應(yīng)用在TanⅡA藥理作用的評價(jià)和研究當(dāng)中，具體流程見圖1。

圖1 研究流程圖

1 資料與方法

1.1 GEO數(shù)據(jù)樣本獲取與預(yù)處理

1.1.1 GEO數(shù)據(jù)樣本獲取 從開源數(shù)據(jù)庫GEO(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)中檢索與TanⅡA有關(guān)的基因芯片，利用R軟件的GEOquery包下載GSE85871數(shù)據(jù)集的CEL格式文件，從中篩選得到GSM2286216、GSM2286217、GSM2286398、GSM2286399共4個(gè)MCF7細(xì)胞樣本的原始基因表達(dá)數(shù)據(jù)。MCF7細(xì)胞用MEM/EBSS培養(yǎng)基在37 ℃、5%CO2條件下的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，其中GSM2286216、GSM2286217采用10 μmol/L的TanⅡA處理12 h，GSM2286398、GSM2286399采用等濃度的二甲基亞砜(DMSO)處理12 h作為對照，基因芯片類型為[HG-U133A]Affymetrix Human Genome U133A Array，均采用GPL571芯片分析平臺。

1.1.2 數(shù)據(jù)預(yù)處理 首先使用R軟件的Affy包讀取基因芯片的原始表達(dá)值，利用穩(wěn)健多陣列平均值算法(robust multi-array average，RMA)對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，包括背景校正、Log2轉(zhuǎn)換、分位數(shù)歸一化以及數(shù)據(jù)匯總，利用RColorBrewer和AffyPLM包繪制基因表達(dá)數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化前后的密度圖。然后應(yīng)用impute包以K近鄰法(k-nearest neighbors，KNN)對缺失值進(jìn)行填補(bǔ)。最后使用annotate包對探針進(jìn)行批量注釋，轉(zhuǎn)換為基因名，對于一個(gè)基因名對應(yīng)多個(gè)探針I(yè)D時(shí)取平均值作為基因表達(dá)值，部分沒有注釋的探針予以刪除。

1.2 獲取差異基因 設(shè)置實(shí)驗(yàn)分組：TanⅡA處理組和對照組，通過Limma包使用經(jīng)驗(yàn)貝葉斯算法(empirical Bayes，eBayes)計(jì)算兩組差異表達(dá)基因的顯著性。本研究以P<0.05和|LogFC|≥1.5為閾值篩選TanⅡA的差異基因，分別使用ggplot2和pheatmap包繪制差異基因的火山圖和聚類熱圖。

1.3 基因集富集分析(gene set enrichment analysis，GSEA)與領(lǐng)頭亞群分析 參照GSEA網(wǎng)站的用戶指南(http://software.broadinstitute.org/gsea/index.jsp/)，下載并使用GSEA 3.0軟件做GSEA。從GSEA 網(wǎng)站的MsigDB數(shù)據(jù)庫中下載c2.cp.v6.2.symbols.gm作為參照基因集文件，按照default weighted enrichment statistic的方法每次重復(fù)分析1 000 次，P<0.05定義為顯著富集。領(lǐng)頭亞群(leading edge subset)是基因集中對富集作用最大的基因，尋找領(lǐng)頭亞群，能夠發(fā)現(xiàn)在多條信號通路中發(fā)揮重要生理作用的基因[4]。導(dǎo)入GSEA分析結(jié)果，應(yīng)用GSEA軟件的“l(fā)eading edge analysis”功能進(jìn)行領(lǐng)頭亞群分析，尋找基因集中差異表達(dá)不顯著卻有重要生物學(xué)意義的基因。

1.4 Cmap藥物重定位 Cmap(https://www.broadinstitute.org/cmap/)是由美國哈佛大學(xué)和麻省理工學(xué)院聯(lián)合開發(fā)的數(shù)據(jù)庫，包括1 309種經(jīng)美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準(zhǔn)作用機(jī)制已知的藥物處理人類細(xì)胞系后(不同濃度、不同時(shí)間點(diǎn))的基因表達(dá)譜，利用基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)比對Cmap中藥物分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)，用于發(fā)現(xiàn)作用相似的藥物和歸納藥物分子可能的作用機(jī)制[5]。通過Cmap進(jìn)行TanⅡA的重定位，首先將獲得的差異基因和領(lǐng)頭亞群利用Affymetrix網(wǎng)站的batch query在線工具(https://www.affymetrix.com/analysis/netaffx/batch_query.affx?netaffx=netaffx4_annot)轉(zhuǎn)換成為“Affymetrix gene chip Human GenomeU133A Array”標(biāo)準(zhǔn)探針I(yè)D，然后在Camp網(wǎng)站的“l(fā)oad signature”界面分別導(dǎo)入上調(diào)和下調(diào)基因探針I(yè)D列表，進(jìn)行藥物重定位。

1.5 差異基因聯(lián)合領(lǐng)頭亞群的基因共表達(dá)分析和疾病本體富集分析 一般認(rèn)為，共表達(dá)基因具有相似的生物學(xué)功能，基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)正是基于基因生物學(xué)功能相似性而構(gòu)建的網(wǎng)絡(luò)，通過該網(wǎng)絡(luò)可分析基因的相互作用關(guān)系，從而了解基因間相互作用脈絡(luò)及尋找核心基因。使用線上工具Coexpedia(http://www.coexpedia.org/search.php)，將分析得到的差異基因和領(lǐng)頭亞群構(gòu)建基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，尋找關(guān)鍵基因。疾病本體(disease ontology，DO)富集分析是研究目標(biāo)基因是否在某個(gè)疾病或某一類疾病中富集的一種分析方法，對于研究復(fù)雜疾病發(fā)病機(jī)制、新藥研發(fā)具有重要作用[6]。因此，本研究應(yīng)用Coexpedia的“GeneSet Analysis：Disease Ontology”功能進(jìn)一步做共表達(dá)基因DO富集分析。

2 結(jié) 果

2.1 差異基因分析結(jié)果 基于前述1.1和1.2的操作方法，利用R軟件對4個(gè)樣品(對照組2個(gè)，處理組2個(gè))的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，標(biāo)準(zhǔn)化前后各個(gè)樣品數(shù)據(jù)內(nèi)部的分布狀態(tài)見圖2，其中圖Figure A芯片數(shù)據(jù)分布較散亂，標(biāo)準(zhǔn)化后圖Figure B示在芯片間數(shù)據(jù)集中，有利于后續(xù)的分析。以P<0.05和LogFC≥1.5為閾值篩選出TanⅡA的上調(diào)基因175個(gè)，以P<0.05和LogFC≤-1.5為閾值篩選出TanⅡA的下調(diào)基因194個(gè)，差異基因共計(jì)369個(gè)。圖3的聚類熱圖展現(xiàn)了差異大小排名前25位基因的表達(dá)量情況，火山圖展示差異表達(dá)基因的分布情況。

圖2 標(biāo)準(zhǔn)化前后密度圖

圖3 差異基因聚類熱圖和火山圖

2.2 GSEA領(lǐng)頭亞群分析 選取領(lǐng)頭亞群重疊次數(shù)≥0.8×最高重疊次數(shù)，即≥10作為閾值共得到10個(gè)基因，其中細(xì)胞分裂周期基因4個(gè)(CDC25A、CDC6、CDC45、CDK2)、微小染色體維持蛋白5個(gè)(MCM7、MCM4、MCM5、MCM6、MCM2)、復(fù)制蛋白A(RPA1)1個(gè)。

2.3 Cmap分析結(jié)果 本研究以處理細(xì)胞類型相同且score≥0.85為條件，篩選得到藥物共22個(gè)(見表1)，其藥理作用涉及心血管、內(nèi)分泌、呼吸、神經(jīng)、免疫等多個(gè)系統(tǒng)，包括擴(kuò)血管、抗血小板聚集、降血脂、解熱鎮(zhèn)痛抗炎、抗菌、抗腫瘤、抗甲狀腺、免疫抑制、抗癲癇驚厥、止咳化痰、中毒解救等，提示TanⅡA可能具有與這22種藥物相同的藥理作用。

表1 Cmap分析結(jié)果(score≥0.85)

2.4 差異基因聯(lián)合領(lǐng)頭亞群的基因共表達(dá)分析和DO富集分析 得到TanⅡA差異基因和GSEA領(lǐng)頭亞群共379個(gè)，通過Coexpedia查詢并構(gòu)建共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)(見圖4)。網(wǎng)絡(luò)由258個(gè)點(diǎn)構(gòu)成，代表258個(gè)共表達(dá)基因，線代表基因之間的互作，其中每個(gè)score代表該基因與網(wǎng)絡(luò)的其余基因的共表達(dá)關(guān)系大小，score越大說明這種關(guān)系越大。選出MCM2、MCM4等13個(gè)score≥100的基因，即為核心基因(見表2)。運(yùn)用Coexpedia做共表達(dá)基因的DO富集分析，得到DO富集條目192個(gè)(P<0.05)，顯著富集條目70個(gè)(P<0.01)，DO分析前50富集條目見表3，除了心血管系統(tǒng)疾病(高血壓、心肌梗死、動脈粥樣硬化等)外，還包括多種腫瘤疾病、呼吸系統(tǒng)疾病(慢性阻塞性肺疾病、肺炎、肺動脈高壓等)、炎癥性疾病(骨關(guān)節(jié)炎、關(guān)節(jié)炎等)、內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病(2型糖尿病、增生性糖尿病視網(wǎng)膜病變等)、免疫系統(tǒng)疾病(IgA腎小球腎炎等)。

圖4 基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)

表2 基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵基因(score≥100)

表3 DO分析前50個(gè)富集條目

3 討 論

本研究通過挖掘GEO，對比TanⅡA和DMSO作用于MCF7細(xì)胞的表達(dá)譜變化，共獲得上調(diào)基因175個(gè)，下調(diào)基因194個(gè)。但是通過主觀界定閾值(如P<0.05，|LogFC|≥1.5等)篩選差異基因可能會遺漏部分差異表達(dá)不顯著卻有重要生物學(xué)意義的基因，因此，本研究又通過GSEA領(lǐng)頭亞群分析挖掘得到10個(gè)重要基因。在隨后的Cmap分析篩選得到的藥物中，抗菌類藥物有5種，即：磺胺苯吡唑、磺胺噻唑、替卡西林、替硝唑、環(huán)丙沙星，提示TanⅡA可能具有廣譜的抗感染作用，對革蘭陽性(G+)菌、革蘭陰性(G-)桿菌、厭氧菌、衣原體、原蟲均有抑制作用；COX抑制劑有2種，即吲哚美辛、白蒿酮，說明TanⅡA可能抑制COX發(fā)揮解熱鎮(zhèn)痛消炎、抗血小板作用，另外，環(huán)氧化酶-2(COX-2)在多種實(shí)體瘤中高表達(dá)[7]，選擇性的COX-2抑制劑通過COX-2依賴和COX-2非依賴途徑發(fā)揮預(yù)防和治療腫瘤的作用，可以抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，抑制血管新生并能夠增強(qiáng)化療藥物和放療的敏感性[8]。另外，去甲二氫愈創(chuàng)木酸在體外實(shí)驗(yàn)中可以抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡[9]，推測TanⅡA可能通過多種途徑抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展；烏拉地爾對突觸后膜α1受體具有阻斷作用，降低外周阻力，降低血壓；普羅布考通過加速低密度脂蛋白(LDL)分解代謝來降低血總膽固醇(TC)。最近的研究表明，普羅布考可能抑制LDL氧化和組織沉積，從而抑制動脈粥樣硬化的發(fā)生[10]，推測TanⅡA可能具有類似的心血管保護(hù)作用。此外，表1顯示，免疫抑制、抗癲癇驚厥、止咳化痰、中毒解救、抗過敏、抗甲狀腺等也是TanⅡA具有的潛在藥理作用。在基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)中(見圖4)篩選出MCM2、MCM4、MCM5、MCM7、MCM6、CDC6、CDC45、C1S、CDC25A、GAS1、CXCL12、CDK2、SNAI2這13個(gè)關(guān)鍵基因。其中MCM2、MCM4、MCM5、MCM7、MCM6參與DNA復(fù)制啟動和DNA損傷修復(fù)[11]，CDC6、CDC45參與DNA的復(fù)制啟動[12-13]，CDC25A特異性降解損傷DNA[14]，CDK2調(diào)控細(xì)胞周期[15]，SNAI2參與腫瘤細(xì)胞侵襲遷移等惡性特征的調(diào)控[16]，GAS1引起細(xì)胞周期停滯和細(xì)胞凋亡[17]，因此，上述基因的表達(dá)水平和活性異?？梢鸹蚪M不穩(wěn)定和不完整，影響惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展。C1S[17]、CXCL12[18]介導(dǎo)免疫、炎癥反應(yīng)，與多種疾病密切相關(guān)。TanⅡA主要集中在冠心病、心肌梗死、動脈粥樣硬化中，DO分析提示TanⅡA有望在治療高血壓、腫瘤、2型糖尿、肺炎、慢性阻塞性肺疾病、骨關(guān)節(jié)炎、IgA腎病等其他常見慢性病方面起到一定的作用，有望成為治療的候選藥物，并且為后期的研究提供參考依據(jù)。

綜上所述，相比傳統(tǒng)化學(xué)藥物，TanⅡA作為一種中藥提取物，具有來源廣泛、毒副反應(yīng)小、多靶點(diǎn)調(diào)節(jié)等優(yōu)點(diǎn)。因此，基于TanⅡA的藥理作用，擴(kuò)大其治療應(yīng)用范圍，具有一定的前景，但應(yīng)用于臨床仍需進(jìn)一步結(jié)合臨床療效研究，對其作用機(jī)制及藥物重定位等做深入、全面的探究分析。