菖蒲-遠(yuǎn)志藥對(duì)組分對(duì)Aβ1-42誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡和鈣離子濃度的影響

孫靈芝，艾 邸

阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)是一種常見(jiàn)的神經(jīng)退行性疾病，主要發(fā)生于老年人群，是老年癡呆最常見(jiàn)的一種類型，其主要臨床表現(xiàn)為認(rèn)知功能障礙，如記憶力減退、失語(yǔ)、失認(rèn)、視空間功能障礙等[1]。AD 的主要病理特征是腦組織神經(jīng)元細(xì)胞外β-淀粉樣蛋白(β-amyloid peptide，Aβ)聚集形成神經(jīng)炎性斑(老年斑)和腦組織神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)高度磷酸化的tau蛋白聚集導(dǎo)致神經(jīng)原纖維纏結(jié)形成[2-4]。隨著人口老齡化進(jìn)程的加劇，AD的發(fā)病率也呈逐年上升趨勢(shì)[5]。Yuan等[6]認(rèn)為細(xì)胞凋亡是引起AD病人海馬神經(jīng)元衰減的重要機(jī)制之一，且Aβ誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡是AD主要凋亡途徑[7-8]。目前，臨床上缺乏有效逆轉(zhuǎn)或者終止AD進(jìn)展的藥物。AD屬于中醫(yī)學(xué)“癡呆”“呆病”范疇?！鞍V呆”病名首見(jiàn)于明·張介賓《景岳全書·雜癥謨·癲狂癡呆》，在治療上提出“甚者宜滾痰丸”，肯定了化痰法在癡呆治療中的重要地位。清·陳士鐸《辨證錄·呆病門》提出了“呆病”病名，并分析指出“呆病之成，必有其因，大約其始也，起于肝氣之郁；其終也，由于胃氣之衰。肝郁則木克土，而痰不能化，胃衰則土制水，而痰不能消，于是痰積于胸中，盤據(jù)于心外，使神明不清，而成呆病矣”，“治其胃氣，則祛其痰涎，則呆病可愈也”。并在所著《石室秘錄》中提出“治呆無(wú)奇法，治痰即治呆”。明確提出了痰在呆病形成過(guò)程中的重要作用，并強(qiáng)調(diào)了胃氣在痰形成和轉(zhuǎn)歸中起著關(guān)鍵性的作用。

經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的實(shí)驗(yàn)研究和臨床實(shí)踐，中藥單體及其有效成分的治療效果已得到充分的肯定，且具有安全性高和副作用少的優(yōu)勢(shì)，因此，其對(duì)AD的干預(yù)機(jī)制也愈加受到關(guān)注與重視。中藥的成分及作用機(jī)制較復(fù)雜，研究相對(duì)欠缺，而中藥單體的成分較單一而具體，其研究較多而深入。近年來(lái)，越來(lái)越多的學(xué)者致力于中藥單體及其有效成分干預(yù)AD發(fā)病機(jī)制的研究。本研究提出“水虧火旺，痰迷神竅”為AD的主要病機(jī)及“瀉火補(bǔ)水，化痰開竅”法治療癡呆病的理論觀點(diǎn)，探討中藥單體石菖蒲-遠(yuǎn)志藥對(duì)組分對(duì)Aβ誘導(dǎo)的AD細(xì)胞模型PC12細(xì)胞凋亡和鈣離子濃度的干預(yù)作用，以進(jìn)一步明確其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞 大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤PC12細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 DMEM/HIGH GLOCOSE培養(yǎng)基，phosphate Buffered Saline，Hi Horse Serum，胎牛血清，Aβ1-42，胰蛋白酶(0.25%)-乙二胺四乙酸(EDTA)消化液，AnnexinⅤ/PI試劑盒，fluo3/am試劑盒。

1.3 主要儀器 CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱，超凈工作臺(tái)，高速離心機(jī)，低溫離心機(jī)，流式細(xì)胞儀，ND-1000分光光度計(jì)，熒光倒置顯微鏡，超低溫冰箱，移液器。

1.4 方法

1.4.1 PC12細(xì)胞培養(yǎng) 超凈臺(tái)內(nèi)將PC12細(xì)胞培養(yǎng)瓶中的原培養(yǎng)液吸出，加入適量0.25%胰酶消化1 min，加入完全培養(yǎng)液終止消化，重懸，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至10 mL離心管中。950 r/min離心5 min，倒掉上清液，加入磷酸緩沖鹽溶液(PBS)重懸細(xì)胞，重復(fù)離心步驟。以5%胎牛血清、5%馬血清、90%DMEM的完全培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，按1∶3比例細(xì)胞傳代，37 ℃，5%CO2條件下培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)滿后以3×105/孔密度接種于24孔板上。

1.4.2 分組及干預(yù)方法 實(shí)驗(yàn)分為α-細(xì)辛醚組、遠(yuǎn)志皂苷組、α-細(xì)辛醚聯(lián)合遠(yuǎn)志皂苷組、空白對(duì)照組。α-細(xì)辛醚組加入α-細(xì)辛醚標(biāo)準(zhǔn)品，終濃度為20 μmol/L；遠(yuǎn)志皂苷組加入遠(yuǎn)志皂苷，終濃度為 100 μmol/L；α-細(xì)辛醚聯(lián)合遠(yuǎn)志皂苷組加入α-細(xì)辛醚標(biāo)準(zhǔn)品終濃度為 10 μmol/L、遠(yuǎn)志皂苷終濃度為 50 μmol/L。PC12細(xì)胞復(fù)蘇后接種于100 U/mL 青霉素、100 mg/L鏈霉素的DMEM完全培養(yǎng)基中，置于 37 ℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2～3 d 傳代 1 次。分別用不同濃度的β-細(xì)辛醚、遠(yuǎn)志皂苷及β-細(xì)辛醚+遠(yuǎn)志皂苷將細(xì)胞預(yù)處理0 h、3 h、6 h、12 h，然后與不同濃度的Aβ1-42共孵育24 h。

1.4.3 細(xì)胞凋亡率檢測(cè) 采用Annexin Ⅴ/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡。收集細(xì)胞，PBS洗滌2遍，1×binding buffer重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至1×106/mL；取100 μL細(xì)胞懸液，加5 μL PI，5 μL異硫氰酸熒光素(FITC)，重懸細(xì)胞，25 ℃避光孵育20 min；950 r/min離心5 min，加入1 mL binding buffer重懸細(xì)胞；上機(jī)檢測(cè)，以AnnexinⅤ+/PI-記為凋亡細(xì)胞。

1.4.4 細(xì)胞鈣離子濃度測(cè)定 采用細(xì)胞流式術(shù)和鈣離子熒光探針fluo3/am檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度。收集細(xì)胞，D-Hanks液洗滌1遍，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×106/mL，每250 μL細(xì)胞懸液加入250 μL含有10 μmol Fluo3/am的D-Hanks液，37 ℃孵育45 min，孵育結(jié)束后用D-Hanks洗滌2遍，制備1 mL細(xì)胞懸液，上機(jī)檢測(cè)。激發(fā)波長(zhǎng)488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)519 nm。

2 結(jié) 果

2.1 菖蒲-遠(yuǎn)志藥對(duì)組分對(duì)Aβ1-42誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡的影響 與空白對(duì)照組比較，各藥物干預(yù)組PC12細(xì)胞凋亡率均明顯降低(P<0.01)；α-細(xì)辛醚組凋亡率低于遠(yuǎn)志皂苷組(P<0.05)；α-細(xì)辛醚聯(lián)合遠(yuǎn)志皂苷組凋亡率低于α-細(xì)辛醚組(P<0.05)。詳見(jiàn)圖1、圖2。結(jié)果顯示，菖蒲組分抗凋亡作用優(yōu)于遠(yuǎn)志組分，二者協(xié)同有顯著增效作用。

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

與空白對(duì)照組比較，＊P<0.05；與α-細(xì)辛醚組比較，#P<0.05。

2.2 菖蒲-遠(yuǎn)志藥對(duì)組分對(duì)Aβ1-42誘導(dǎo)PC12細(xì)胞鈣離子濃度的影響 與空白對(duì)照組比較，各藥物干預(yù)組PC12細(xì)胞鈣離子濃度均降低(P<0.01)；與遠(yuǎn)志皂苷組相比，α-細(xì)辛醚組鈣離子濃度降低(P<0.05)；與α-細(xì)辛醚組相比，α-細(xì)辛醚聯(lián)合遠(yuǎn)志皂苷組鈣離子濃度顯著降低(P<0.05)。詳見(jiàn)圖3、圖4。結(jié)果顯示，菖蒲組分抗凋亡作用優(yōu)于遠(yuǎn)志組分，菖蒲、遠(yuǎn)志組分聯(lián)用有顯著增效作用。

圖3 熒光探針?lè)z測(cè)鈣離子熒光強(qiáng)度

與空白對(duì)照組比較，＊P<0.05；與α-細(xì)辛醚組比較，#P<0.05。

3 討 論

Aβ誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡是AD的重要發(fā)病機(jī)制之一[7-8]，鈣離子在細(xì)胞凋亡事件中起重要作用。一方面，隨著N-甲基-D-天冬氨酸受體(NMDAR)通道開放導(dǎo)致鈣離子內(nèi)流，鈣離子結(jié)合鈣調(diào)蛋白(CaM)后連接一氧化氮合酶(NOS)的還原酶區(qū)和氧化酶區(qū)，激活NOS生成一氧化氮(NO)[9]；另一方面，在海馬神經(jīng)元中，NOS通過(guò)PSD95蛋白與NMDAR錨定在一起，提高了興奮性氨基酸信號(hào)激活NOS的效率[10]。NO可誘導(dǎo)線粒體膜電位減低或上調(diào)Bax和Bcl-XL蛋白，引導(dǎo)線粒體內(nèi)細(xì)胞色素C(Cyt-C)的釋放，啟動(dòng)Caspase細(xì)胞凋亡信號(hào)通路[11]。磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserine，PS)正常情況下位于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)，當(dāng)細(xì)胞處于早期凋亡時(shí)可轉(zhuǎn)移至細(xì)胞膜外側(cè)，AnnexinⅤ是一種鈣離子依賴性磷脂結(jié)合蛋白，能與PS特異性結(jié)合，通過(guò)細(xì)胞流式術(shù)可檢測(cè)熒光素標(biāo)記的AnnexinⅤ。PI能夠穿過(guò)凋亡細(xì)胞的細(xì)胞膜，使細(xì)胞核紅染。將AnnexinⅤ與PI結(jié)合起來(lái)可以區(qū)分早期凋亡和壞死的細(xì)胞。fluo3/am是一種檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)鈣離子熒光探針，當(dāng)穿過(guò)細(xì)胞膜與細(xì)胞內(nèi)鈣離子結(jié)合時(shí)，熒光強(qiáng)度可提高70～80倍，其平均熒光強(qiáng)度可代表鈣離子濃度水平。本研究通過(guò)AnnexinⅤ/PI雙染法和fluo3/am熒光探針檢測(cè)PC12細(xì)胞凋亡和鈣離子濃度，探討菖蒲-遠(yuǎn)志藥對(duì)組分抗凋亡的作用機(jī)制。

關(guān)于癡呆的發(fā)病機(jī)制歷代醫(yī)家均有論述。元·危亦林《世醫(yī)得效方·健忘》較早提出“健忘失事、言語(yǔ)如癡”是由“痰迷心包”導(dǎo)致；朱丹溪深入論述了痰濁致病理論，“百病中多有兼痰者，世所不知也”，“痰之為物，隨氣升降，無(wú)處不到”。傅青主在《傅青主男科·癲狂門》中進(jìn)一步提出中焦脾胃為生痰之源：“飲食入胃，不變精血，反去生痰，痰迷心竅，反生癲狂”。腎氣腎陽(yáng)虧虛，津液失于蒸化而釀生痰濁。關(guān)于腎臟與痰的形成的關(guān)系，明代醫(yī)家趙獻(xiàn)可在《醫(yī)貫·痰論》中指出：“腎虛不能制水，則水不歸源，如水逆行，洪水泛濫而為痰。”王倫亦進(jìn)一步闡述了先天腎氣和后天脾胃與痰的關(guān)系：“痰之本，水也，原于腎。痰之動(dòng)濕也，主于脾。”

菖蒲、遠(yuǎn)志是在古方和現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中用于治療癡呆的常用藥物?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》記載石菖蒲味辛，氣溫，可“開心孔，補(bǔ)五臟，通九竅，明耳目，出聲音。久服輕身，不忘，不迷惑，延年”。葉天士《本草經(jīng)解》指出“菖蒲辛溫為陽(yáng)，陽(yáng)主開發(fā)，故開心竅”。久服則“不忘不迷惑，陽(yáng)氣充而神明也”；黃元御在《玉楸藥解》中指出，“菖蒲辛烈疏通，開隧竅瘀阻，除神志迷塞”?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》記載遠(yuǎn)志“味苦，溫。主咳逆，傷中，補(bǔ)不足，除邪氣，利九竅，益智慧，耳目聰明，不忘，強(qiáng)志倍力”。李時(shí)珍《本草綱目》云：“遠(yuǎn)志入足少陰腎經(jīng)，非心經(jīng)藥也。其功專于強(qiáng)志益精，治善忘。蓋精與志，皆腎經(jīng)之所藏也。腎精不足，則志氣衰，不能上通于心，故迷惑善忘?！?/p>

黃元御在《玉楸藥解》中指出，遠(yuǎn)志“味辛，微溫，入手少陰心、足少陰腎經(jīng)。開心利竅，益智安神”?！靶辽㈤_通，治心竅開塞……補(bǔ)腎壯陽(yáng)，斂精止瀉”。李中梓在《雷公炮制藥性論》論述遠(yuǎn)志“味苦，性溫，無(wú)毒，入心腎二經(jīng)。補(bǔ)不足，除邪氣，益智慧，明耳目，寧怔忡，定驚悸，利九竅，治健忘，壯陽(yáng)道，益精氣，長(zhǎng)肌肉，助筋骨”。而葉天士在《本草經(jīng)解》中論及：“氣溫益陽(yáng)，陽(yáng)主開發(fā)，故利九竅……味苦清心，心氣光明，故益智慧。心為君主，神明出焉，天君明朗，則五官皆慧，故耳目聰明不忘也。心之所之謂之志，心靈所以志強(qiáng)”。上述醫(yī)家均明確指出遠(yuǎn)志苦入心經(jīng)，溫能滋腎，益智作用主要與溫腎陽(yáng)和清心火功效有關(guān)。凌一揆主編的《中藥學(xué)》將遠(yuǎn)志功效和適應(yīng)證概括為“寧心安神，祛痰開竅”，適用于健忘及痰阻心竅所致的精神錯(cuò)亂、神志恍惚等，與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)老年性癡呆、血管性癡呆的智能下降、精神癥狀相吻合。石菖蒲主要?dú)w心、胃經(jīng)，偏于辛散，溫胃化濕，以絕后天生痰之源；遠(yuǎn)志主要入心、腎二經(jīng)，偏于苦降，溫腎祛痰，以固先天腎陽(yáng)之本，又可清降心火，二者相須為用，共奏化痰開竅、益智安神之效。菖蒲、遠(yuǎn)志合用可見(jiàn)于醫(yī)家醫(yī)書，《圣濟(jì)總錄》將二藥組方名曰遠(yuǎn)志湯，用于治療久心痛；《備急千金要方》和《醫(yī)心方》中均載有開心散，在遠(yuǎn)志湯基礎(chǔ)上再加人參、茯苓，用于治療健忘；伍以龜板、龍骨，名曰“孔圣枕中丹”，用于治療失眠、健忘、神志恍惚。張慧等[12]用高效液相色譜法(HPLC)技術(shù)對(duì)藥對(duì)石菖蒲、遠(yuǎn)志共煎物及單味藥水煎物進(jìn)行了對(duì)比分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，α-細(xì)辛醚和細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷在共煎物中的含量高于單味藥水煎物；結(jié)合物呈現(xiàn)出與單體成分的顯著差異，且在水中的溶解性明顯優(yōu)于單體成分。得出石菖蒲、遠(yuǎn)志共煎煮過(guò)程引起α-細(xì)辛醚和細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷產(chǎn)生了理化性質(zhì)改變，促進(jìn)了有效成分的煎出。本研究發(fā)現(xiàn)石菖蒲提取物(α-細(xì)辛醚)和遠(yuǎn)志提取物(遠(yuǎn)志皂苷)對(duì)AD細(xì)胞模型PC12細(xì)胞凋亡和鈣離子濃度均有抑制作用，且石菖蒲提取物(α-細(xì)辛醚)優(yōu)于遠(yuǎn)志提取物(遠(yuǎn)志皂苷)，二者合用有顯著的增效作用。

基于歷代醫(yī)家論述及臨床觀察，本研究提出“瀉火補(bǔ)水，化痰開竅”治療AD理論，探討了菖蒲-遠(yuǎn)志藥對(duì)組分對(duì)Aβ1-42誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡和鈣離子濃度的影響，發(fā)現(xiàn)石菖蒲提取物(α-細(xì)辛醚)和遠(yuǎn)志提取物(遠(yuǎn)志皂苷)均可抑制AD細(xì)胞模型PC12細(xì)胞凋亡和鈣離子濃度，且菖蒲-遠(yuǎn)志藥對(duì)組分合用具有顯著的增效作用。