發(fā)酵溫度對(duì)蘋(píng)果酵素抗氧化性和安全性的影響

李 紅，毛繼龍，陳文靜，邱忠平，李 萍，彭傳海，李明星，湯國(guó)雄

（西南交通大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，四川 成都 610031）

酵素是以水果、蔬菜、食用中藥材等為原料，通過(guò)微生物發(fā)酵而成的一類具有保健功能的發(fā)酵制品[1]。酵素中不僅含大量氨基酸等發(fā)酵原料中的原有成分，也有較高含量的還原糖、維生素C、酚類、花色苷、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）等抗氧化物質(zhì)[2]，具有抗氧化、清除人體自由基等多種益生作用[3-4]。蘋(píng)果富含維生素C、酚類、礦物質(zhì)等多種功效物質(zhì)，是人體外源性抗氧化物質(zhì)的重要來(lái)源之一[3]。蘋(píng)果是酵素良好的原料，蘋(píng)果酵素不僅保留了蘋(píng)果中原有的有效成分，發(fā)酵過(guò)程中還會(huì)產(chǎn)生多種生物活性物質(zhì)及功效酶，可降解食物中蛋白質(zhì)等物質(zhì)，利于人體吸收，同時(shí)還有助于清除人體代謝中凋亡的細(xì)胞[5]，具有很高的實(shí)用價(jià)值。

發(fā)酵溫度通過(guò)影響微生物生長(zhǎng)代謝，進(jìn)而影響酵素中抗氧化物質(zhì)含量和抗氧化活性，是決定酵素品質(zhì)的重要因素之一。研究表明，適宜的發(fā)酵溫度是生產(chǎn)高品質(zhì)酵素的關(guān)鍵，若發(fā)酵溫度過(guò)低，微生物生長(zhǎng)代謝緩慢，SOD及各種產(chǎn)物含量較低；溫度過(guò)高，高溫會(huì)抑制微生物中酶的活性，進(jìn)而抑制微生物的生長(zhǎng)代謝，所產(chǎn)生的SOD及各產(chǎn)物量低[6]，也可能會(huì)造成發(fā)酵不徹底，且易受有害微生物的污染，進(jìn)而影響酵素的品質(zhì)[7]。目前對(duì)蘋(píng)果酵素的研究主要包括天然發(fā)酵過(guò)程中代謝產(chǎn)物、抗氧化活性的變化，短期發(fā)酵工藝對(duì)蘋(píng)果酵素抗氧化活性的影響等[8-10]，而關(guān)于發(fā)酵溫度對(duì)蘋(píng)果酵素抗氧化性和安全性的影響研究未見(jiàn)報(bào)道。本文以蘋(píng)果為發(fā)酵原料，接種本課題組自主研制的益生菌劑，研究發(fā)酵溫度對(duì)蘋(píng)果酵素品質(zhì)的影響，獲得較優(yōu)的發(fā)酵溫度，以期為蘋(píng)果酵素工業(yè)化生產(chǎn)提供一定的技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

小金蘋(píng)果，紅糖（什邡市益康食品有限公司），均為市售；益生菌劑為本項(xiàng)目組自行研制，由干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）Q16、哈伯氏乳桿菌（Lactobacillus harbinensis）QH21、屎腸球菌（Enterococcus faecium）QH19、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）QH1、釀酒酵母QH2、釀酒酵母QH18、枯草芽孢桿菌QH10、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）QH12組成，分別按質(zhì)量比2:20:35:5:15:15:3:5制成的菌劑；SOD檢測(cè)試劑盒（南京建成生物工程研究所）。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1 蘋(píng)果酵素的制備 以無(wú)菌水沖洗蘋(píng)果，切絲、陰干備用，發(fā)酵體系中蘋(píng)果:紅糖:水的質(zhì)量比為2:1:1，益生菌劑按0.5 %（m:m）接種，分別置于10，20，25，30，35 ℃培養(yǎng)箱中發(fā)酵120 d。發(fā)酵原料基本理化性質(zhì)見(jiàn)表1。

1.2.2 樣品采集 發(fā)酵結(jié)束時(shí)取發(fā)酵液50 ml，7000 r/min離心5 min，取上清測(cè)定。

1.2.3 測(cè)定方法 采用紫外分光光度法測(cè)定維生素C[11]；福林酚法測(cè)定總酚[12]；采用pH試差法測(cè)定花色苷[13]；鐵氰化鉀還原法測(cè)定還原力[14]；參考文獻(xiàn)[1]測(cè)定超氧自由基清除率、羥自由基清除率、DPPH自由基清除率；采用試劑盒測(cè)定SOD；參照（GB/T5009-2016）方法測(cè)定甲醇、甲醛[15]；采用酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定黃曲霉毒素B1[16]；參照GB 4789.3-2016測(cè)定大腸菌群數(shù)，參照GB 4789.10-2016測(cè)定金黃色葡萄球菌數(shù)，參照GB 4789.4-2016測(cè)定沙門(mén)菌[17]。每個(gè)試樣重復(fù)測(cè)定3次。

1.3 數(shù)據(jù)處理

用Excel 2010對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行基本處理，SPSS 22.0進(jìn)行主成分相關(guān)性分析、模糊數(shù)學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1 蘋(píng)果酵素的抗氧化性

2.1.1 抗氧化指標(biāo) 維生素C、總酚、花色苷、SOD等抗氧化物質(zhì)具有抑制自由基的產(chǎn)生或直接清除清除基、激活抗氧化酶體系等作用[1-2]。檢測(cè)蘋(píng)果酵素的維生素C含量、總酚含量、花色苷含量、SOD活性、還原力、羥自由基清除能力、超氧自由基清除率、DPPH自由基清除率，結(jié)果見(jiàn)表2。

由表2可見(jiàn)，發(fā)酵溫度為10～25 ℃時(shí)，隨著溫度升高，維生素C、總酚、花色苷含量增加、SOD活力升高；發(fā)酵溫度為25 ℃時(shí)，維生素C、總酚、花色苷含量、SOD活力達(dá)最大值；發(fā)酵溫度高于25 ℃時(shí)，維生素C和總酚含量、SOD活力降低。表明發(fā)酵溫度為25 ℃時(shí)蘋(píng)果酵素的抗氧化物質(zhì)含量最高。

表1 發(fā)酵原料基本理化性質(zhì)

表2 5組蘋(píng)果酵素的抗氧化指標(biāo)

發(fā)酵溫度為25 ℃時(shí)，超氧自由基清除率、羥自由基清除率、DPPH自由基清除率均高于其他各組（P＜0.01）；還原力高于其他各組（P＜0.05，P＜0.01），表明發(fā)酵溫度為25 ℃時(shí)，蘋(píng)果酵素的抗氧化活性相對(duì)較高。

2.1.2 主成分分析 對(duì)維生素C、總酚、花色苷、SOD 4種抗氧化物質(zhì)和還原力、羥自由基清除率、超氧自由基清除率、DPPH自由基清除4種抗氧化活性體系進(jìn)行主成分相關(guān)性分析，利用SPSS 22.0軟件計(jì)算相關(guān)性結(jié)果、主成分特征值、方差貢獻(xiàn)率和累積貢獻(xiàn)率，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 主成分分析載荷圖

由圖1可見(jiàn)，共提取出2個(gè)主成分，第一主成分特征值為5.98，方差貢獻(xiàn)率達(dá)74.7 %，其中影響載荷權(quán)數(shù)大小依次為SOD活力、DPPH自由基清除率、總酚含量、花色苷含量、羥自由基清除率；第二主成分特征值為1.22，方差貢獻(xiàn)率為15.2 %，各指標(biāo)所占載荷權(quán)數(shù)較??；2個(gè)主成分累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)89.9 %，其他主成分的貢獻(xiàn)率可忽略不計(jì)。其中第一主成分中總酚含量與羥自由基清除率位置近，相關(guān)性高；第二主成分中花色苷含量、SOD活力、DPPH自由基清除位置近，相關(guān)性高。表明酵素中花色苷、總酚、SOD具有一定抗氧化活性。

2.1.3 模糊數(shù)學(xué)分析 通過(guò)模糊數(shù)學(xué)分析法對(duì)5組酵素的抗氧化物質(zhì)含量和抗氧化活性體系的數(shù)據(jù)進(jìn)行無(wú)因次化處理。采用標(biāo)準(zhǔn)離差法計(jì)算權(quán)重。模糊轉(zhuǎn)化矩陣R見(jiàn)表3。通過(guò)等權(quán)和加權(quán)法分別對(duì)5組酵素的抗氧化性進(jìn)行比較，5組酵素指標(biāo)的評(píng)分結(jié)果見(jiàn)表4。

綜合分析結(jié)果取等權(quán)和加權(quán)的和，其中評(píng)分越高表示該組抗氧化性越高。由表4可見(jiàn)，5組酵素在不同發(fā)酵溫度下抗氧化指標(biāo)評(píng)判排序依次為25 ℃＞30 ℃＞20 ℃＞10 ℃＞35 ℃，即在25 ℃發(fā)酵條件下蘋(píng)果酵素的抗氧化性最高。

2.2 有害指標(biāo)

酵素在發(fā)酵過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生甲醇、甲醛等有害物質(zhì)，且易受致病微生物的污染，嚴(yán)重影響酵素品質(zhì)。本文以甲醇、甲醛、黃曲霉毒素、大腸桿菌菌群、金黃色葡萄球菌、沙門(mén)菌為有害指標(biāo)，評(píng)判酵素的安全性，5組酵素中有害指標(biāo)結(jié)果及比較結(jié)果見(jiàn)表5。

表3 模糊轉(zhuǎn)化矩陣R

表4 模糊數(shù)學(xué)分析法結(jié)果及排序

由表5可見(jiàn)，發(fā)酵溫度為10～35 ℃時(shí)，甲醇和甲醛含量隨發(fā)酵溫度升高而增高，表明發(fā)酵溫度高可促進(jìn)甲醇和甲醛生成，35 ℃時(shí)，酵素中甲醇和甲醛含量最高，但均分別低于0.40 mg/ml和2.00 μg/ml，符合GB2758-2012的要求。各組均未檢出黃曲霉毒素及有害微生物（大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門(mén)菌），均符合GB2761-2017和GB2758-2012的要求，表明10～35 ℃均為適宜的發(fā)酵溫度，但為了提高酵素的安全性，10～25 ℃為蘋(píng)果酵素較適宜的發(fā)酵溫度。

3 討論

發(fā)酵溫度通過(guò)影響微生物的活性及抗氧化物質(zhì)的合成、氧化和分解速度，進(jìn)而影響抗氧化物質(zhì)的含量。發(fā)酵溫度為10～25 ℃時(shí)，微生物生長(zhǎng)代謝速率隨溫度升高而加快，促進(jìn)蘋(píng)果中維生素C、花色苷等物質(zhì)的溶出，且微生物在生長(zhǎng)代謝時(shí)會(huì)產(chǎn)生一定量的維生素C、酚類、花色苷等抗氧化物質(zhì)[3,12]，使體系中抗氧化物質(zhì)含量逐漸增加，SOD活力增強(qiáng)；發(fā)酵溫度為10 ℃時(shí)，酵素中微生物活性低，抑制了抗氧化物質(zhì)的溶出或產(chǎn)生，抗氧化物質(zhì)含量低；發(fā)酵溫度為25 ℃時(shí)，酵素中維生素C、總酚、花色苷含量達(dá)最大值，分別為41.70 mg/ml，2.11 mg/ml，61.11 mg/L，SOD活力達(dá)267.25 U/L。發(fā)酵溫度為25～35 ℃時(shí)，升高發(fā)酵溫度雖有利于提高微生物的活性，促進(jìn)維生素C、酚類等抗氧化物質(zhì)的溶出或產(chǎn)生，但維生素C、酚類、花色苷等物質(zhì)易受溫度影響，隨溫度升高其氧化或分解速度加快[12-13]，含量逐漸降低。因此發(fā)酵溫度為25 ℃時(shí)，酵素中抗氧物質(zhì)產(chǎn)生或分解速度適中，更好地維持體系中抗氧化物含量，使得該組的抗氧化性物質(zhì)含量最高。

通常將還原力、羥自由基清除率、超氧自由基清除率、DPPH自由基清除率作為酵素的抗氧化活性體系，抗氧化活性高低與抗氧化物質(zhì)的含量密切相關(guān)，但不同的抗氧化物質(zhì)和抗氧化活性相關(guān)程度不同[1]。主成分分析抗氧化物質(zhì)的含量和抗氧化活性的相關(guān)性結(jié)果（圖1）表明，總酚和羥自由基清除率呈顯著正相關(guān)，花色苷含量、SOD活力、DPPH自由基清除率呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），而維生素C含量與總酚含量、花色苷含量、SOD活力、羥自由基清除率、超氧自由基清除率及DPPH自由基清除率的相關(guān)性不大，即總酚、花色苷、SOD活力對(duì)酵素體系的抗氧化活性影響較大。本文研究結(jié)果顯示，發(fā)酵溫度為25 ℃時(shí)，總酚含量、SOD活力、花色苷含量最高，表明該組的抗氧化活性最高。

表5 5組蘋(píng)果酵素中的有害指標(biāo)

蘋(píng)果皮中的果膠質(zhì)在甲酯酶作用下水解產(chǎn)生甲醇；甘氨酸脫羧生成甲醇；果酸物質(zhì)受熱分解產(chǎn)生甲醇[18-19]。甲醛是酵母菌的一種代謝產(chǎn)物，酵素中甲醛主要來(lái)自于甲醇的氧化脫氫，在甲醛脫氫酶的作用下又繼續(xù)氧化成甲酸，然后在甲酸脫氫酶作用下繼續(xù)氧化生成二氧化碳[20]。發(fā)酵過(guò)程中過(guò)量甲醇和甲醛的產(chǎn)生易對(duì)人體造成傷害[15]。發(fā)酵溫度主要通過(guò)影響甲酯酶、甲醇脫氫酶等多種酶活性，進(jìn)而影響甲醇和甲醛的含量。10～35 ℃時(shí)，隨發(fā)酵溫度升高，甲醇含量逐漸增加，這是由于發(fā)酵溫度升高使甲酯酶、蛋白酶等多種酶活性增強(qiáng)，繼而對(duì)果膠等物質(zhì)分解徹底，產(chǎn)生大量的甲醇，甲醇再進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為甲醛，使甲醛含量增加； 35 ℃時(shí)，甲醇和甲醛含量達(dá)最高（P＜0.05）。因此，發(fā)酵溫度越低，酵素中甲醇和甲醛含量越低，但為了提高蘋(píng)果酵素的品質(zhì)，建議發(fā)酵溫度為25 ℃。

4 結(jié)論

發(fā)酵120 d時(shí)蘋(píng)果酵素中各指標(biāo)趨于穩(wěn)定，發(fā)酵溫度為25 ℃時(shí)，酵素中的花色苷含量、羥自由基清除率、DPPH自由基清除率、還原力、SOD活力均最高；總酚含量和羥自由基清除率呈顯著正相關(guān)，花色苷含量、SOD活力、DPPH自由基清除率呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）；5組酵素中有害物質(zhì)和有害微生物均符合國(guó)家相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)；模糊數(shù)學(xué)綜合評(píng)判結(jié)果為25 ℃發(fā)酵條件下，蘋(píng)果酵素的抗氧化性最高，品質(zhì)最優(yōu)。