急性砷暴露對(duì)小鼠腎臟免疫功能的影響

許何麗， 徐國(guó)偉， 毛亞萍， 竇文靜， 王主， 段曉旭*

（1. 沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院預(yù)防醫(yī)學(xué)專業(yè)2016 級(jí)， 遼寧 沈陽(yáng)110034； 2. 中國(guó)醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院環(huán)境與慢病研究中心； 3. 沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院毒理學(xué)教研室； 4. 沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心）

砷是地殼中普遍存在的元素之一， 長(zhǎng)期砷暴露嚴(yán)重威脅人類健康， 可導(dǎo)致皮膚癌、 膀胱癌、肺癌等多器官損害。 除了致癌性， 流行病學(xué)和實(shí)驗(yàn)研究還發(fā)現(xiàn)砷具有一定的免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)［1－2］， 這正成為砷研究領(lǐng)域一個(gè)新的熱點(diǎn)問(wèn)題。 無(wú)機(jī)砷可以誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分化和吞噬能力減弱、 朗格漢斯細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞的數(shù)目明顯減少以及Th17 細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子維甲酸相關(guān)孤核受體γt （retinoidrelated orphan receptor gammat， RoRγt） 及T 細(xì)胞增殖能力下降［3］。 除脾、 胸腺這些免疫器官外，越來(lái)越多的研究提示機(jī)體內(nèi)一些非免疫器官中也含有巨噬細(xì)胞、 樹(shù)突狀細(xì)胞、 淋巴細(xì)胞等免疫細(xì)胞， 并且這些免疫細(xì)胞可以參與機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)，從而參與一些免疫和非免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展。如腎臟中含有存在由樹(shù)突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞構(gòu)成的腎單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)及部分CD4＋／CD8＋組織常駐記憶T 細(xì)胞（tissue－resident memory T cell， Trm細(xì)胞） 和Treg 細(xì)胞等， 這些免疫細(xì)胞組成的免疫微環(huán)境可以調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫應(yīng)答及腎臟的防御功能［4－5］。 腎臟是砷排泄、 蓄積和發(fā)揮毒作用的主要靶器官， 砷暴露增加大鼠腎臟中TNF－α、 NF－κB和IL－1β 等的表達(dá)［6］。 這些結(jié)果提示砷引起腎損傷的過(guò)程中或多或少的會(huì)捕捉到免疫反應(yīng)的“蹤跡”， 但目前關(guān)于砷對(duì)腎臟的免疫學(xué)相關(guān)研究尚不多見(jiàn)。 本研究采用整體動(dòng)物學(xué)模型， 探討急性砷暴露對(duì)小鼠腎臟內(nèi)抗原吞噬、 趨化黏附和抗原提呈功能的影響， 為砷所致腎損傷提供新的思路和靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF 級(jí)C57BL／6 雌性小鼠40 只，體重18～22 g， 由北京維通利華公司提供， 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)11400700063049， 飼養(yǎng)于沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。 本實(shí)驗(yàn)遵循沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院有關(guān)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和使用以及國(guó)家《關(guān)于動(dòng)物倫理與福利的作者指南共識(shí)》 的規(guī)定。

1.2 儀器與試劑 超高速低溫離心機(jī)（美國(guó)Heal Force 公司）， Infinite M200 型微孔板發(fā)光檢測(cè)儀（瑞士Tecan 公司）， Nano Drop ND－2000 分光光度計(jì)（美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司）， ABI 7500實(shí)時(shí)定量PCR 儀 （美國(guó)ABI 公司）， 亞砷酸鈉（NaAsO2） （分析純， 美國(guó)Sigma 公司）； Trizol 試劑盒和SYBR Premix Ex Taq II Real－time PCR 試劑盒（日本TaKaRa 公司）， 尿素氮（BUN）、 肌酐（Cr）、 酸性磷酸酶（ACP） 測(cè)定試劑盒（南京建成生物工程研究所）。

1.3 方法

1.3.1 砷溶液配置 將2.5 g NaAsO2粉末， 溶于100 ml 純凈水中， 配置成濃度為25 g／L 的砷儲(chǔ)備液， 逐步稀釋為0.125、 0.25 和0.5 g／L 的砷溶液用于實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 模型建立 將小鼠隨機(jī)分為4 組， 分別為對(duì)照組、 2.5、 5 和10 mg／kg NaAsO2暴露組， 各10 只。 一次性灌胃方式染毒， 染毒時(shí)間為24 h，對(duì)照組給予生理鹽水。 記錄小鼠染毒前后體重變化。 染毒終點(diǎn)眼球取血用于生化指標(biāo)測(cè)定， 處死解剖， 摘取完整的腎臟， 記錄小鼠腎臟重量。

1.3.3 生化檢測(cè) 取各組小鼠外周血并分離出血清， 按照試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)血清中BUN、 Cr 和ACP 水平， 檢測(cè)腎組織勻漿中ACP 水平。

1.3.4 Real－time PCR 法檢測(cè)腎臟免疫功能 將收集的腎組織充分勻漿， 加入Trizol 溶液中， 提取組織中的總RNA， 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA 后， 測(cè)定腎臟趨化黏附功能分子（Ccr5、Ccr7、Icam1） 和抗原提 呈 功 能 相 關(guān) 分 子 （MhcⅡ、Cd80、Cd86、Cd40） 的表達(dá)， 嚴(yán)格按說(shuō)明書(shū)配制反應(yīng)體系并在相應(yīng)條件下進(jìn)行擴(kuò)增。 反應(yīng)結(jié)束后， 根據(jù)溶解曲線判斷待擴(kuò)增基因的特異性， 采用2－△△Ct值表示各目的基因的mRNA 相對(duì)表達(dá)量， 各引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列

續(xù)表1

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 24.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析， 計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示， 組間比較采用單因素方差分析， 兩兩比較采用LSD－t法（滿足方差齊性時(shí)） 或Dunnett’ T3 法（不滿足方差齊性時(shí)）。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況比較 實(shí)驗(yàn)期間， 各組小鼠生長(zhǎng)良好， 活動(dòng)靈敏， 大便成型， 毛發(fā)順齊， 均存活且未見(jiàn)明顯的系統(tǒng)毒性。 各組小鼠染毒前后體重?zé)o明顯變化， 與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）， 砷暴露組小鼠的腎臟重量及臟器系數(shù)均無(wú)明顯變化（P＞0.05）， 見(jiàn)圖1。

圖1 各組小鼠一般情況比較

2.2 血清BUN 和Cr 水平比較 與對(duì)照組比較，砷暴露組小鼠血清BUN 水平明顯增加（P＜0.05），見(jiàn)圖2A； 而4 組小鼠血清Cr 水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）， 見(jiàn)圖2B。

2.3 砷暴露對(duì)小鼠腎臟抗原吞噬功能的影響 與對(duì)照組比較， 血清ACP 水平降低（P＜0.05）， 見(jiàn)圖3A； 腎組織中ACP 水平升高（P＜0.05）， 見(jiàn)圖3B。

2.4 砷暴露對(duì)小鼠腎臟趨化黏附功能的影響 砷暴露組小鼠腎組織中Ccr5、Ccr7的mRNA 水平隨著染毒劑量的增加逐漸下降， 10 mg／kg 砷暴露組與其它組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖4A、 B； 與對(duì)照組比較， 砷暴露組Icam1的mRNA 水平均出現(xiàn)不同程度的下降， 5 mg／kg 砷暴露組與2.5 mg／kg 和10 mg／kg 砷暴露組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）， 見(jiàn)圖4C。

圖2 對(duì)照組和砷暴露組小鼠血清BUN 和Cr 水平比較

圖3 對(duì)照組和砷暴露組小鼠血清和腎組織ACP 水平比較

2.5 砷暴露對(duì)小鼠腎臟抗原提呈功能的影響 與對(duì)照組、 2.5 mg／kg 砷暴露組比較， 5 和10 mg／kg砷暴露組腎組織中MhcⅡ的mRNA 水平隨著染毒劑量的增加逐漸下降， 5 和10 mg／kg 砷暴露組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）， 見(jiàn)圖5A； 與對(duì)照組比較， 砷暴露組Cd80與Cd86的mRNA 表達(dá)水平明顯下降（P＜0.05）， 與2.5 mg／kg 砷暴露組比較， 5 和10 mg／kg 砷暴露組Cd80的mRNA 表達(dá)水平明顯升高， 見(jiàn)圖5B、 C； 而Cd40的mRNA 水平與對(duì)照組相比無(wú)明顯變化（P＞0.05）， 見(jiàn)圖5D。

圖4 對(duì)照組和砷暴露組小鼠腎臟組織中Ccr5、Ccr7 和Icam1 的mRNA 表達(dá)水平比較

圖5 對(duì)照組和砷暴露組小鼠腎組織中MhcⅡ、 Cd80、Cd86 和Cd40 的mRNA 表達(dá)水平比較

3 討論

眾所周知， 腎臟是砷毒性及其代謝的主要靶器官之一， 長(zhǎng)期砷暴露可以影響腎臟的生理功能，引起腎損傷， 甚至導(dǎo)致腎癌等。 隨著免疫學(xué)研究的進(jìn)展， 研究發(fā)現(xiàn)非免疫器官腎臟中也含有樹(shù)突狀細(xì)胞、 巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等免疫細(xì)胞組成的免疫微環(huán)境， 也發(fā)揮著一定的免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)［4－5］。

BUN 是蛋白質(zhì)代謝的主要終產(chǎn)物， 而Cr 是肌肉在體內(nèi)代謝的產(chǎn)物， 二者主要通過(guò)腎小球?yàn)V過(guò)排出體外， 故血清BUN 和Cr 是評(píng)價(jià)腎臟功能的重要指標(biāo)［7］。 本研究發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組比較， 砷暴露組小鼠血清BUN 的水平明顯增加， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義， 而血清Cr 的水平無(wú)明顯差異。 Mahajan 等［8］研究發(fā)現(xiàn)Wistar 大鼠50 ～150 μg／L 砷暴露28 d，其血清BUN 和Cr 明顯增加。 徐昉等［9］的研究結(jié)果顯示長(zhǎng)期低劑量砷攝入時(shí)， 隨著時(shí)間的延長(zhǎng)， 血清BUN 和Cr 才呈明顯升高， 這提示血清Cr 的水平變化不明顯可能與BUN 和Cr 的代謝部位不同和染毒時(shí)間過(guò)短有關(guān)。 人群流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)飲水型砷中毒病區(qū)居民血清BUN 平均水平高于非高砷區(qū)居民［10］， 這些結(jié)果均提示砷暴露能夠引起腎功能的損害。

ACP 是溶菌體酶的重要組分， 存在于前列腺、肝和腎等多種組織和體液中， 可以直接參與蛋白質(zhì)、 糖類和脂類的吞噬作用， 具有防御和免疫調(diào)節(jié)等生理功能［11］。 本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)， 與對(duì)照組比較， 砷暴露小鼠血清中ACP 的活性明顯下降， 腎臟中ACP 活性升高， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 Rana等［12］研究發(fā)現(xiàn)Wistar 大鼠20 mg／L 砷染毒3 個(gè)月，血清中ACP 水平明顯高于對(duì)照組。 田耕晨［11］等研究指出， 三角帆蚌在受到免疫激活時(shí)， 血清中ACP 呈現(xiàn)明顯先升后降趨勢(shì)。 本研究結(jié)果在一定程度上可以推斷是與血清和腎臟組織對(duì)外源性物質(zhì)刺激時(shí)反應(yīng)快慢不同有關(guān)。 同時(shí)， 也可能與染毒的時(shí)間和動(dòng)物的種屬不同有關(guān)。

Ccr5 和Ccr7 是樹(shù)突狀細(xì)胞表面的趨化因子受體； Icam 既是細(xì)胞間黏附分子又是抗原提呈細(xì)胞上的協(xié)同刺激分子， 這些分子均調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫反應(yīng)［13］。 本研究發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組比較， 10 mg／kg 砷暴露明顯降低小鼠腎臟組織中Ccr5、Ccr7的mRNA的表達(dá)， 砷暴露明顯降低小鼠腎臟組織中Icam1的mRNA 的表達(dá)， 差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 Zhao 等［14］研究發(fā)現(xiàn)C57BL／6 小鼠飲用含砷（0.1、 0.1、 1、10 mg／L NaAsO2） 水12 個(gè)月后， 脾和肺組織中Ccr5和Ccr7的mRNA 水平明顯高于對(duì)照組。 另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)100 μg／L 砷暴露明顯增加小鼠腎臟Icam1 的蛋白水平［15］。 這些結(jié)果的不一致可能與砷的劑量、 持續(xù)時(shí)間及作用的靶器官的不同有關(guān)，還需要進(jìn)一步研究和探討。 本研究結(jié)果提示砷引起的腎臟組織中趨化黏附因子的表達(dá)水平的下降可能參與砷的免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)。

多種免疫細(xì)胞表面分布有Cd40、 Cd80 和Cd86 等多種分化抗原， 具有多種生物學(xué)功能。Cd40 與Cd40 的受體Cd40L 結(jié)合后可上調(diào)其表面的Cd80、 Cd86 及MhcⅡ的表達(dá)， 增強(qiáng)抗原提呈的作用［16］。 本研究發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組比較， 砷暴露小鼠腎組織中MhcⅡ、Cd80和Cd86分子的mRNA 水平明顯下降， 差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 Bahari 等［17］研究發(fā)現(xiàn)樹(shù)突狀細(xì)胞經(jīng)1μg／L 砷處理12 h 和24 h后， Cd40 和MhcⅡ分子的表達(dá)下降， 影響樹(shù)突狀細(xì)胞的分化和成熟。 Macoch 等［18］的研究也發(fā)現(xiàn)，1～2 μmol／L 砷會(huì)抑制樹(shù)突狀細(xì)胞表面共刺激分子Cd80 和Cd86 的表達(dá)。 這些結(jié)果均提示砷暴露可以抑制機(jī)體的抗原提呈功能。

綜上所述， 本研究發(fā)現(xiàn)急性砷暴露破壞小鼠腎臟內(nèi)抗原吞噬功能分子ACP 的活性， 抑制趨化黏附功能相關(guān)分子（Ccr5、 Ccr7 和Icam1） 以及抗原提呈功能相關(guān)分子（MhcⅡ、 Cd80 和Cd86） 表達(dá)， 從而破壞腎臟正常的免疫功能， 進(jìn)而導(dǎo)致腎臟損傷， 為砷導(dǎo)致腎臟免疫損傷提供了理論依據(jù)。