母體孕期雙酚A 暴露對子代大鼠學(xué)習記憶能力及海馬中谷氨酸代謝酶基因表達的影響

于海洋， 劉娣， 裴秀叢， 段志文， 馬明月， 段曉旭， 張玉敏

（沈陽醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院毒理學(xué)教研室， 遼寧 沈陽110034）

雙酚A （bisphenol A， BPA）， 又稱2， 2－二（4－羥基苯基） 丙烷， 是明確的環(huán)境內(nèi)分泌干擾物［1］， 常用于生產(chǎn)聚碳酸酯塑料和環(huán)氧樹脂， 隨著人們對塑料制品的大量使用， BPA 已經(jīng)在生產(chǎn)生活環(huán)境中無處不在［2－3］， 并且自2000 年以來，我國BPA 消費量顯著增長， 已成為BPA 生產(chǎn)大國［4］。 現(xiàn)有研究表明， 水體和土壤等環(huán)境中存在BPA 污染， 且人群暴露也普遍存在［5－6］。 BPA 可造成多器官系統(tǒng)損傷， 由于神經(jīng)系統(tǒng)損傷具有不可逆性， 且可對家庭和社會造成長期的經(jīng)濟負擔，所以BPA 所致的兒童認知功能障礙越來越受到學(xué)者的關(guān)注［7］， 但機制仍未研究清楚。 海馬是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的重要組成部分， 在學(xué)習、 記憶等認知功能中發(fā)揮重要作用。 谷氨酸（glutamate， Glu）是一種重要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)， Glu 含量的穩(wěn)定在神經(jīng)調(diào)節(jié)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用， 對于學(xué)習記憶功能的維持具有重要意義［8］。 Glu 和谷氨酰胺（glutamine， Gln） 在神經(jīng)元與星形膠質(zhì)細胞之間的循環(huán)是維持Glu 含量的重要生理學(xué)過程， 其中谷氨酰胺合成酶（glutamine synthetase， GS） 是完成Glu與Gln 之間代謝轉(zhuǎn)化， 維持Glu 含量的關(guān)鍵酶［9］。此外， Glu 可在谷氨酸脫氫酶（glutamate dehydrogenase， GDH） 的作用下， 轉(zhuǎn)化為α－酮戊二酸，進入三羧酸循環(huán)， 徹底分解清除［10］。 本研究擬通過建立母體孕期BPA 暴露模型， 探討其對子代大鼠性成熟后學(xué)習記憶能力的影響， 及其對GS和GDH兩種Glu 代謝酶基因表達的影響， 分析其內(nèi)在聯(lián)系， 研究結(jié)果可為揭示母體孕期BPA 暴露所致子代的學(xué)習記憶損傷機制提供新的研究數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器設(shè)備 WMT－100S 水迷宮追蹤與分析儀器（成都泰盟有限公司）， 核酸分析儀（美國Thermo Fisher Scientific 公司）， 7500 Fast 熒光定量PCR 儀（美國ABI 公司）， 超速低溫離心機（德國Sigma 公司）， 超低溫冰箱（日本Sanyo 公司）。

1.2 主要試劑 BPA （純度＞99%） （日本Tokyo Chemical Industry 公司）， 玉米油（中國阿拉丁試劑公司）， Trizol、 反轉(zhuǎn)錄試劑盒及SYBR Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒（日本Takara 公司）。

1.3 實驗動物分組與染毒 10 周齡健康SPF 級SD 雌性大鼠30 只， 體重（220±20） g， 雄性大鼠15 只， 體重（320±20） g， （北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司）， 實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK （京） 2012－0001。 大鼠飼養(yǎng)在符合GB 14925－2010 《實驗動物環(huán)境及設(shè)施》 有關(guān)要求的屏障環(huán)境中， 自由進食、 飲水。 適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后， 按照雌∶雄＝2∶1 比例合籠， 每日記錄與雄鼠交配情況， 以觀察到陰栓為妊娠期第0 天（gestational day 0， GD 0）。 將孕鼠隨機分為對照組、0.05、 0.5、 5 和50 mg／ （kg·d） 的BPA 暴露組，每組6 只。 母鼠從GD 5 進行灌胃染毒至妊娠期結(jié)束前一天（GD 19）， 以玉米油為溶劑配制各濃度BPA 溶液， 對照組給予玉米油， 孕鼠飼養(yǎng)至自然分娩， 仔鼠于出生后第21 天（postnatal day 21，PND 21） 斷乳， 至PND 56 實驗結(jié)束。 取各組仔鼠， 每組6 只， 由于BPA 對學(xué)習記憶的影響是否存在性別差異尚未明確， 本研究中各組仔鼠為雌雄各半。 于PND 56 先進行水迷宮試驗， 實驗結(jié)束后， 稱取體重， 經(jīng)乙醚麻醉處死， 取仔鼠海馬組織。

1.4 檢測指標及方法

1.4.1 Morris 水迷宮試驗 水迷宮試驗包括定位航行試驗和空間探索試驗。 首先， 將泳池注入溫水， 并人為分為4 個象限， 在隨機的一個象限中設(shè)置透明平臺（定義為第Ⅱ象限）， 置于水面下2 cm 左右， 在整個定位航行試驗中保持位置不變。隨后將水池內(nèi)注入奶粉， 避免大鼠可以通過視覺找到平臺。 定位航行試驗的5 d 內(nèi)， 每天分別將4個象限的中心作為入水點， 將動物面向池壁放入水中， 檢測其尋找平臺的逃避潛伏期， 即大鼠從入水到找到平臺所需要的時間， 反映大鼠空間學(xué)習能力， 如在120 s 內(nèi)未能找到平臺， 則逃避潛伏期記為120 s。 在第6 天訓(xùn)練時撤除平臺， 進行空間探索試驗， 觀察并記錄大鼠在120 s 內(nèi)對原平臺象限搜索時間（第Ⅱ象限停留時間）、 有效游泳速度、 進入平臺次數(shù)及在對原平臺位置的搜索時間（平臺滯留時間）， 評價大鼠的空間記憶能力。

1.4.2 仔鼠體重的測定 乙醚麻醉處死前稱取各組仔鼠體重。

1.4.3 仔鼠海馬組織中GS與GDH的mRNA 含量測定 取各組仔鼠海馬組織， 采用Real－time PCR法測定仔鼠海馬中GS和GDHmRNA 含量。 按照Trizol 試劑盒的操作要求提取總RNA， 采用分光光度計在260 nm 和280 nm 波長處測定其光密度值，驗證總RNA 的濃度與純度。 按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作， 將樣本中的mRNA 轉(zhuǎn)錄為cDNA。 建立Realtime PCR 反應(yīng)體系， 采用SYBR Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒進行檢測， 應(yīng)用7500 Fast 實時定量PCR儀， 測定各樣本等質(zhì)量總RNA 的mRNA 的循環(huán)指數(shù)（Cycle threshold， Ct） 值， 以GAPDH基因為內(nèi)參照， 應(yīng)用2－ΔΔCt方法計算目的基因的相對表達量。 引物序列：GS上游： 5′－TTGCATCGGGTATGCGAAGA － 3′， 下 游： 5′ － TGGTGCCTCTTGCTCAGTTT－3′， 產(chǎn)物長度173 bp；GDH上游： 5′－ACCAAATCCAATGCACCCAGA－3′， 下游： 5′－ATAGTCCCGCCGTGCTTTC－ 3′， 產(chǎn) 物 長 度290 bp；GAPDH上游： 5′－GCAAGAGAGAGGCCCTCAG－3′，下游： 5′－TGTGAGGGAGATGCTCAGTG －3′， 產(chǎn)物長度74 bp。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 22.0 軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析， 計量資料以均數(shù)±標準差表示， 多組間比較應(yīng)用單因素方差分析， 組間兩兩比較采用LSD法，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 母體孕期BPA 暴露對仔鼠空間學(xué)習與記憶能力的影響 在定位航行試驗中， 自訓(xùn)練第3 天起，50 mg／ （kg·d） BPA 組仔鼠逃避潛伏期顯著長于對照組和其他BPA 組（P＜0.05）； 自訓(xùn)練第4 天起， 5 mg／ （kg·d） BPA 組仔鼠逃避潛伏期也顯著長于對照組和0.05 mg／ （kg·d） BPA 組（P＜0.05）； 在訓(xùn)練第5 天， 0.5、 5 和50 mg／ （kg·d） BPA 組仔鼠逃避潛伏期顯著長于對照組（P＜0.05）， 其中5 和50 mg／ （kg·d） BPA 組也顯著長于0.05 和0.5 mg／ （kg·d） BPA 組 （P＜0.05）。 見表1。

表1 各組仔鼠空間學(xué)習能力的比較（ ±s， s， n＝6）

表1 各組仔鼠空間學(xué)習能力的比較（ ±s， s， n＝6）

注： 與對照組比較，1）P＜0.05； 與0.05 mg／ （kg·d） BPA 組比較，2）P＜0.05； 與0.5 mg／ （kg／·d） BPA 組比較，3）P＜0.05； 與5 mg／（kg·d） BPA 組比較，4）P＜0.05

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在空間探索試驗中， 5 和50 mg／ （kg·d）BPA 組仔鼠在第Ⅱ象限停留時間少于對照組和0.05 mg／ （kg·d） BPA 組， 其中50 mg／ （kg·d） BPA 組也少于0.5 mg／ （kg·d） BPA 組（P＜0.05）。 而各BPA 組仔鼠有效游泳速度與對照組相比較， 差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。 5 和50 mg／ （kg·d） BPA 組仔鼠進入平臺次數(shù)少于對照組， 其中50 mg／ （kg·d） BPA 組也少于0.05 和0.5 mg／ （kg·d） BPA 組（P＜0.05）； 而5 和50 mg／ （kg·d） BPA 組仔鼠在平臺滯留時間也少于對照組和0.05 mg／ （kg·d） BPA 組， 其中， 50 mg／ （kg·d） BPA 組少于0.5 mg／ （kg·d） BPA組（P＜0.05）。 見表2。

表2 各組仔鼠空間記憶能力的比較（±s， n＝6）

表2 各組仔鼠空間記憶能力的比較（±s， n＝6）

注： 與對照組比較，1）P＜0.05； 與0.05 mg／ （kg／·d） BPA 組比較，2）P＜0.05； 與0.5 mg／ （kg·d） BPA 組比較，3）P＜0.05

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2.2 母體孕期BPA 暴露對仔鼠體重的影響 對照組、 0.05、 0.5、 5 和50 mg／ （kg·d） 的BPA 暴露組仔鼠體重分別為（199.87±33.89）、 （218.68±33.24）、 （203.58±33.97）、 （245.08±48.88） 和（232.57±47.69） g， 各BPA 組仔鼠體重與對照組相比， 差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

2.3 母體孕期BPA 暴露對仔鼠海馬組織中GS和GDH基因表達的影響 各BPA 組仔鼠海馬組織中GS和GDH的mRNA 含量均低 于 對照 組 （P＜0.05）， 但各暴露組間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。 見表3。

表3 各組仔鼠海馬中GS 和GDH 基因表達的比較（ ±s， n＝6）

表3 各組仔鼠海馬中GS 和GDH 基因表達的比較（ ±s， n＝6）

注： 與對照組比較，1）P＜0.05

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3 討論

本研究選擇了母體孕期BPA 暴露， 主要考慮孕期特殊生理狀態(tài)， 孕鼠更容易受到BPA 的影響，并且該時期為神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的重要時期， 神經(jīng)系統(tǒng)的損傷具有不可逆性； 此外， 孕期BPA 暴露對子代大鼠的影響研究較為少見。 選擇PND 56 作為檢測的時間節(jié)點， 主要考慮PND 56 為性成熟時間， 可用于評價孕期BPA 染毒對子代大鼠出生后的神經(jīng)毒性效應(yīng)。 體重是反映動物生長狀態(tài)的基礎(chǔ)指標， 本研究結(jié)果顯示， 在該BPA 暴露模型下，未對子代大鼠一般生長狀況產(chǎn)生顯著的影響， 提示本研究暴露劑量的選擇是較為適合的。

Morris 水迷宮試驗是目前公認的探討嚙齒類動物學(xué)習記憶能力的檢測手段之一［11－12］， 試驗分為定位航行試驗和空間探索試驗， 分別反映受試動物的學(xué)習與記憶能力。 本研究結(jié)果顯示， 在定位航行試驗中， 0.5 mg／ （kg·d） BPA 暴露可顯著延長大鼠的逃避潛伏期， 提示該劑量下母體孕期的BPA 暴露可損傷出生后（性成熟階段） 子代大鼠的空間學(xué)習能力。 而在空間探索試驗中， 當BPA 暴露劑量達到5 mg／ （kg·d） 時， 可導(dǎo)致大鼠第Ⅱ象限停留時間變短， 進入平臺的次數(shù)變少以及在平臺停留的時間變短， 但是對有效游泳速度這一指標并無顯著影響。 大鼠在目的象限停留的時間， 可初步反映其對空間的位置記憶能力，而進入平臺的次數(shù)以及在平臺的停留時間可以進一步精準反映大鼠對原平臺所在位置的記憶能力；上述檢測指標的變化均可提示： 當母體孕期BPA暴露劑量達到5 mg／ （kg·d） 時， 可損傷子代大鼠的空間記憶能力； 而各組大鼠平均有效游泳速度并無顯著差別， 提示本研究劑量下， BPA 對子代大鼠的運動能力， 尤其是游泳能力未產(chǎn)生顯著不良影響。 結(jié)合定位航行和空間探索試驗的結(jié)果可見， 孕期BPA 暴露對子代大鼠空間學(xué)習能力的影響更為顯著， 因為較低劑量的BPA 暴露［0.5 mg／ （kg·d） ］ 即出現(xiàn)了大鼠學(xué)習能力的損傷，而更高劑量才可導(dǎo)致大鼠空間記憶能力的損傷。前期， 有部分研究者利用Morris 水迷宮試驗探索BPA 對學(xué)習記憶能力的影響， 結(jié)果顯示： 母鼠圍產(chǎn)期及仔鼠出生后BPA 暴露均可損傷仔鼠的學(xué)習記憶能力［13－15］， 本研究結(jié)果與上述研究結(jié)果基本一致。 但是有關(guān)母體孕期BPA 暴露對仔鼠學(xué)習記憶功能的影響， 相關(guān)研究較為少見， 本研究結(jié)果提示孕期BPA 暴露可同樣造成仔鼠學(xué)習記憶損傷，可補充該暴露時期相關(guān)研究的不足， 為揭示BPA導(dǎo)致的學(xué)習記憶損傷機制提供新的研究證據(jù)。

Glu 作為一種興奮性神經(jīng)遞質(zhì)， 其與Gln 之間的Glu－Gln 循環(huán)對中樞神經(jīng)系統(tǒng)正常功能的維持，尤其是學(xué)習記憶能力的發(fā)揮具有重要作用［16－17］，而GS 和GDH 在Glu－Gln 循環(huán)中扮演重要角色。本研究結(jié)果顯示， 當孕期BPA 暴露劑量達到0.05 mg／ （kg·d） 時， 仔鼠海馬中GS和GDH的mRNA含量顯著均低于對照組， 提示0.05 mg／ （kg·d） 的孕期BPA 暴露可抑制GS和GDH的基因表達。 前期研究顯示， BPA 暴露可影響海馬中Glu 含量及Glu／GABA［18－19］， 而對引起其含量變化的可能代謝環(huán)節(jié)及關(guān)鍵位點研究不足， 確切機制尚未明確，本研究結(jié)果可為上述問題提供新的實驗數(shù)據(jù)和研究思路。

綜上所述， 母體孕期BPA 暴露可導(dǎo)致子代大鼠性成熟階段學(xué)習記憶損傷， 可抑制Glu 代謝酶GS和GDH的基因表達，GS和GDH基因表達的改變可能參與了BPA 所致的學(xué)習記憶損傷過程。 但是， 本研究的不足之處是未檢測GS 和GDH 的蛋白表達及酶活性的變化， 也未對Glu 代謝其他環(huán)節(jié)進行探討， 將在后續(xù)的研究中進行補充和深入探索。