氮、磷供給水平對纖細角毛藻生長及細胞物質組成的影響

周澤鵬，周曉見，2，宋雨晴，劉青，2，靳翠麗，2

（1.揚州大學環(huán)境科學與工程學院，江蘇 揚州 225127；2.揚州大學海洋科學與技術研究所，江蘇 揚州 225127）

微藻通過光合作用將大氣中的CO2固定，轉化為以碳水化合物為主的有機碳，一方面用于構建微藻細胞結構，擴增微藻細胞形成更大生物量，另一方面以各種復合形式儲存化學能和還原力[1]。藻類細胞壁由各種己糖和戊糖直接結合而成，β-1,3 葡聚糖儲存光合作用產生的部分化學能和還原力，還有一些還原力和化學能儲存在脂類中作為分子池，用作生產細胞所需原材料的替代能源[1-2]。蛋白質構成的碳庫，還起到氮儲存的作用，并且這個生化參數的變化可以反映細胞生長/分裂的活躍度[1]。研究發(fā)現，不同條件下生長的微藻，其細胞物質組成具有一定的差異[3-4]。

微藻細胞內含有豐富的脂類、蛋白質和碳水化合物，使其成為水產養(yǎng)殖中浮游動物、雙殼類、蟹類幼蟲和魚類幼體的重要餌料，同時也適用于其他各種商業(yè)用途[2]。海洋微藻餌料的培養(yǎng)是海水養(yǎng)殖育苗過程中的重要環(huán)節(jié)，微藻餌料生物量充足、細胞組成營養(yǎng)豐富是海水養(yǎng)殖育苗中幼體孵育的基本保障。纖細角毛藻（Chaetoceros gracilis）生長速度快、繁殖迅速、容易培養(yǎng)，同時細胞富含多種營養(yǎng)物質，是重要的餌料微藻[3]。該試驗研究氮磷供給濃度對纖細角毛藻的影響，對于節(jié)約培養(yǎng)成本、擴大纖細角毛藻生物量生產、改善細胞營養(yǎng)組成，進一步提高纖細角毛藻的培養(yǎng)效益具有重要意義。

1 材料和方法

1.1 試驗設計與纖細角毛藻培養(yǎng)方法

纖細角毛藻由中國海洋大學教育部海水養(yǎng)殖重點實驗室提供，用人工海水配制的Guillard 的f/2培養(yǎng)基保種。

改變氮、磷供給濃度進行試驗。氮供給設置7個濃度（NaNO3，μmol/L），分別為110.31、220.61、441.23、882.46、1 323.69、1 764.91 和2 647.37。磷供給設置7 個濃度（NaH2PO4·H2O, μmol/ L），分別為4.01、8.01、16.03、32.05、48.08、64.10 和96.15。其中氮供給濃度882.46 μmol/L 和磷供給濃度32.05 μmol/L與f/2 配方中基準濃度相同，記為1 倍濃度（對照），從低到高依次將上述氮磷供給濃度分別標記為1/8倍、1/4 倍、1/2 倍、1 倍、3/2 倍、2 倍和3 倍基準濃度。纖細角毛藻在250 mL 錐形瓶中進行一次性培養(yǎng)，不充氣，每天搖動2 次。在23 ℃、光強100 μmol·m-2·s-1，光∶暗比為12 h∶12 h 的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。初始密度為每毫升0.61×106，7 d 后收獲。所有試驗設置3 個重復。

1.2 纖細角毛藻生長情況測定

用血球計數板計數，再使用酶標儀測定相應細胞密度下藻液在520 nm 下的吸光度（OD520），建立OD520與藻細胞密度間的標準曲線。每24 h 測定藻液的OD520，計算細胞密度[3]。

1.3 纖細角毛藻細胞內蛋白質、總糖和脂肪含量測定

蛋白質和總糖含量測定方法如下，收集30 mL藻液，4 000 r/min 離心10 min，用30 mL 蒸餾水重新懸浮藻細胞成懸液，用冰浴超聲（700 w，超聲5 s，間隔3 s） 破碎10 min，4 000 r/min 離心10 min，取上清液用于測量蛋白質或總糖含量。采用考馬斯藍法以牛血清白蛋白（BSA）為標準測定蛋白質含量[5]。采用苯酚-硫酸法以D-葡萄糖為標準測定總糖含量[6]。

脂肪含量測定方法如下，收集50 mL 藻液，4 000 r/min 離心10 min，沉淀用蒸餾水洗兩次，加入20 mL 甲醇∶氯仿=2∶1（v/v）混合物，劇烈震蕩后4 ℃放置過夜。懸液冰浴超聲（700 w，超聲5 s，間隔3 s）破碎10 min 后，4 000 r/min 離心10 min，取氯仿層加等量蒸餾水搖勻，4 000 r/min 離心10 min，收集氯仿相至烘干并稱重的試管中，蒸發(fā)溶劑，放置50 ℃烘箱中烘30 min，稱重記錄[3]。

1.4 統計分析

所有處理均設置3 個重復。數據分析采用IBM SPSS22 軟件進行單因素方差分析（One-way ANOVA），利用最小顯著差數法（Least Significant Difference，LSD）或Dunnett T3 進行多重比較，分別用大、小寫字母代表極具統計學意義（P≤0.01）和具統計學意義（P≤0.05）的差異[7]。

2 結果

2.1 不同氮磷供給濃度對纖細角毛藻生長的影響

纖細角毛藻在不同氮磷供給濃度的培養(yǎng)基中都能生長（圖1-A，1-B），從每毫升細胞數量0.61×106逐漸上升，在1 倍氮磷濃度的培養(yǎng)基（即對照）中，每毫升纖細角毛藻的最終細胞數量在培養(yǎng)7 d時達到8.00×106（圖2-A，2-B）。氮供給濃度低于對照時，纖細角毛藻的生長受到抑制，1/8、1/4 和1/2倍氮供給濃度培養(yǎng)基的最終細胞數量都低于對照，1/8 倍氮供給濃度時每毫升細胞數量為4.72×106，只有對照密度的59%。但是氮供給濃度超過對照時，對纖細角毛藻生長的促進作用并不明顯，收獲時每毫升細胞數量未超過對照。磷供給濃度的變化對于纖細角毛藻的生長也有明顯影響，1/8、1/4 和1/2 倍磷供給濃度的每毫升細胞數量都低于對照，1/8 倍磷供給濃度時每毫升細胞數量只有4.29×106，只是對照密度的54%。然而，與氮供給不同的是，提高磷供給濃度能明顯促進纖細角毛藻的生長，3/2 倍磷供給濃度下，每毫升細胞數量高達13.41×106，是對照的1.7 倍。磷供給濃度繼續(xù)升高，促進生長的效果有所下降，但每毫升細胞數量仍遠遠高于對照，2 倍和3 倍磷供給濃度的最終細胞數量相差不大，都是對照的1.5 倍左右。

2.2 不同氮磷供給濃度對纖細角毛藻細胞物質組成的影響

氮供給濃度對纖細角毛藻細胞內蛋白質含量影響極顯著（圖3-A）。在低于和等于對照氮供給濃度的范圍內，蛋白質含量與氮供給濃度呈現線性相關，氮供給濃度越低，蛋白質含量越低。氮供給濃度超過對照時，細胞蛋白質含量極顯著提高（P=0.01），3/2~3 倍氮供給濃度的單個細胞平均蛋白質含量為9.067 pg，而1/8~1 倍氮供給濃度的細胞平均蛋白質含量為2.072 pg，不足前者的1/4。磷供給濃度對于纖細角毛藻的蛋白質含量也有影響，在1/4 和1/2倍磷供給濃度時的細胞蛋白質含量較高，而其他磷濃度下的蛋白質含量均與對照沒有統計學意義差異（P=0.05，圖3-B）。

氮供給濃度對纖細角毛藻細胞的總糖含量也有影響（圖4-A）。對照的單個細胞總糖含量最高，可達2.870 pg，其他氮供給濃度下的總糖含量區(qū)別不大。磷供給濃度極顯著影響纖細角毛藻的總糖含量（P=0.01），低磷供給濃度有利于細胞積累總糖，高濃度帶來總糖含量下降（圖4-B）。1/8 至1 倍磷供給濃度范圍內，細胞總糖含量較高，平均值為2.519 pg，3/2 到3 倍磷供給濃度范圍內的細胞總糖含量較低，平均值只有1.459 pg，只有前者的58%。

氮供給濃度對纖細角毛藻細胞的脂肪含量有顯著影響（圖5-A）。3 倍氮供給濃度時單個細胞脂肪含量最低，僅17.600 pg，且1/2~3 倍氮供給濃度間的脂肪含量無統計學差異（P=0.05），所以，高氮供給濃度不利于細胞積累脂肪。低氮供給濃度（1/8 和1/4 倍）使纖細角毛藻脂肪含量顯著增加（P=0.05），分別是對照的1.8 倍和1.3 倍。磷供給濃度對于纖細角毛藻的脂肪含量也有顯著影響，尤其是降低磷供給濃度能顯著提高脂肪含量（P=0.05，圖5-B）。1/8和1/4 倍磷供給濃度使脂肪含量分別達到55.453 pg和50.571 pg，分別是對照的2.6 倍和2.4 倍。磷供給濃度高于對照，脂肪含量無統計學差異，均不利于纖細角毛藻細胞積累脂肪。

3 討論

微藻通過光合作用固定二氧化碳，固定的碳如何分配取決于微藻的種類及生長環(huán)境條件[4，8-9]。為了提高微藻培養(yǎng)效益，人們采取了許多生物和非生物因素的策略，比如改變溫度、鹽度和營養(yǎng)鹽等，這些因素會導致微藻生長情況和生化成分的變化[10]。營養(yǎng)鹽中的氮、磷供給水平是決定微藻生物量生產的重要因素，已被證明是改變微藻質量的有效因素[4，11-12]。氮在微藻生物量中的占比約為7%~10%（w/w），主要以硝酸鹽的形式從培養(yǎng)基中吸收，是細胞蛋白質、核酸、磷脂和葉綠素等的基本元素，在微藻生命活動中占有首要地位[13]。磷是微藻3 大必需元素之一，參與微藻各種代謝活動，在細胞膜結構、物質代謝以及信號傳導、光合作用等方面都起著極為重要的作用[14]。

該研究結果表明，在提高纖細角毛藻生物量產量方面，改變磷供給濃度比氮更有效。低氮（1/2 倍及以下）使纖細角毛藻的生物量減少嚴重，而高氮（2 倍、3 倍）培養(yǎng)的細胞密度雖高于低氮，但仍與一倍氮相當，說明通過提高氮供應促進纖細角毛藻生長的意義不大。在該營養(yǎng)水平下，其他因素（如光）可能成為限制因素[15]。低磷（1/8、1/4 倍）使纖細角毛藻生長緩慢，高磷（大于1 倍磷）培養(yǎng)的生長情況明顯改善，3/2 倍磷在整個培養(yǎng)過程中的生長狀況都明顯好于其他培養(yǎng)基。對于氮磷兩種營養(yǎng)素來說，3倍濃度在纖細角毛藻的生長方面均不具有明顯優(yōu)勢。因此，為了提升纖細角毛藻的生長速度，可以適度提高磷濃度，3/2 倍的磷供給濃度比較適宜。在改善纖細角毛藻細胞營養(yǎng)物質組成方面，高氮（3/2~3倍）是提升細胞蛋白質含量的有效手段，磷濃度變化對于細胞蛋白質含量的影響較低。低磷（1/8~1倍）有助于提高總糖含量。低氮（1/8~1/4 倍）和低磷（1/8~1/4 倍）都能有效提高細胞脂肪含量，其中1/8倍的磷供給濃度對于提高脂肪含量效果最好。

閆愛菊等[16]在纖細角毛藻氮磷比（N/P）的研究中發(fā)現，纖細角毛藻在低N/P 水體中的生長好于高N/P 水體，而且當N/P 大于16∶1 時纖細角毛藻生長速率受到抑制。因此認為纖細角毛藻生長受磷供給的影響要大于氮供給的作用。該文的研究結果證明，纖細角毛藻不僅生長速率受磷供給影響大于氮供給，而且對于改變細胞物質組成而言，除了蛋白質含量，調節(jié)磷供給濃度比氮更為有效。實際生產中，可調整培養(yǎng)基的氮磷供應水平，達到不同的培養(yǎng)目標。