一例異育銀鯽病源細(xì)菌的分離、鑒定及藥敏試驗(yàn)

張熒熒，劉張淮，朱春艷，王曉英，管杰，王宇哲，王家軍

（寶應(yīng)縣水生動物疫病與預(yù)防控制中心，江蘇 寶應(yīng) 225800）

異育銀鯽（Carassius auratus gibelio）是中國科學(xué)院水生生物研究所于1970 年代中后期至1980年代初，利用天然雌核發(fā)育的方正銀鯽為母本，以興國紅鯉為父本，經(jīng)人工繁育的一個異精雌核發(fā)育鯽魚養(yǎng)殖品種，由于異育銀鯽具有多種養(yǎng)殖優(yōu)勢，在1986 年就已經(jīng)作為淡水養(yǎng)殖的優(yōu)良品種而在全國23 個省市得到推廣。近年來中科院水生所選育的異育銀鯽“中科3 號”、“中科5 號”加快了鯽魚養(yǎng)殖品種更新的速度，即便如此，異育銀鯽養(yǎng)殖過程中病害問題一直存在，近年來漸趨嚴(yán)重，極大影響了養(yǎng)殖異育銀鯽的經(jīng)濟(jì)效益[1]。

該試驗(yàn)對一養(yǎng)殖塘發(fā)病嚴(yán)重的鯽魚樣品進(jìn)行了病源細(xì)菌的分離鑒定，并進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，以期為防治鯽魚常見細(xì)菌性疾病提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品

患病鯽魚采自寶應(yīng)縣廣洋湖鎮(zhèn)，平均體質(zhì)量125 g 左右。發(fā)病塘口放養(yǎng)鯽魚密度為每667 m2放養(yǎng)1 600 尾，混養(yǎng)少量花白鰱，4 月初鯽魚開始發(fā)病，出現(xiàn)赤皮、紅鰓、水霉病等癥狀。

1.2 試劑

營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基；DNA 提取試 劑 盒 ；Protease K、DNA Marker2K、ddH2O 和2 ×EasyTay PCR SuperMix；動物用藥敏分析試劑板。

1.3 儀器

潔凈工作臺、干式恒溫器、SHP-160 型生化培養(yǎng)箱、THZ-82B 型空氣搖床、MIKRO200R 型臺式高速冷凍離心機(jī)、S1000 型PCR 儀、BG-Power 600 型電泳儀、INFINITY-3026 型凝膠成像系統(tǒng)、細(xì)菌自動鑒定系統(tǒng)。

1.4 病原菌分離

在無菌條件下使用無菌接種針蘸取鯽魚病灶部位于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，在28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，進(jìn)行3 次分離純化，最終選取3 株優(yōu)勢菌。同時，將分離出的菌落接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基上，于28 ℃空氣搖床中過夜培養(yǎng)，保存菌液。

1.5 細(xì)菌初步鑒定

觀察分離純化出來的3 株菌株形態(tài)，使用細(xì)菌自動鑒定系統(tǒng)對分離出的3 株細(xì)菌進(jìn)行初步鑒定。

1.6 DNA 提取

分離菌震蕩培養(yǎng)24 h 后，提取細(xì)菌DNA，按照DNA 提取試劑盒操作說明。

1.7 16 S rRNA 基因測序和分析

利用細(xì)菌16 S rRNA 通用引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。16 S rDNA 引物序列：F（5’-AAACTCAAAGGAATTGA CGG-3’）和R（5’-GACGGGCGGTGTGTACAA-3’），參考彭宣憲等人方法[2]。PCR 反應(yīng)體系25 μL：SuperMix 12.5 μL，ddH2O 9.5 μL，正反向引物各1 μL，模板1 μL。PCR 反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性3 s、56 ℃退火15 s、72 ℃延伸10 s，35 次循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。取一部分?jǐn)U增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠成像，觀察一下片段大小。剩下的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物送往上海生工生物股份有限公司進(jìn)行16 S rRNA 基因測序。

1.8 藥敏試驗(yàn)

使用動物用藥敏分析試劑板檢測兩種細(xì)菌對8種常見抗生素的藥物敏感性，藥敏結(jié)果判定參照《抗微生物敏感試驗(yàn)的執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)》（CLSI）[3]。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離

從患病鯽魚分離出3 株優(yōu)勢菌（圖1），菌株在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上生長優(yōu)勢良好，分別編號GY-1-2、GY-1-3、GY-2-1。

2.2 細(xì)菌生物系統(tǒng)初步鑒定結(jié)果

將3 株菌株接種到生化反應(yīng)板上，放置到28 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，使用細(xì)菌自動鑒定系統(tǒng)進(jìn)行初步鑒定。結(jié)果如表1，初步鑒定GY-1-2 為棲稻黃色單胞菌（Pseudomonas oryzihabitans），GY-1-3 為嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila），GY-2-1 為惡臭假單胞菌（P. putida）。

2.3 16 S rDNA 鑒定

利用細(xì)菌16 S rRNA 通用引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠成像圖（圖2），片段大小在500 bp左右。將測序獲得的基因序列提交BLAST 進(jìn)行比對，如表2 所示，GY-1-3 與嗜水氣單胞菌的基因序列相似度最高，GY-1-2、GY-2-1 與假單胞菌的基因序列相似度最高。結(jié)合細(xì)菌自動鑒定系統(tǒng)的初步鑒定結(jié)果，確定GY-1-2 為棲稻黃色單胞菌,GY-1-3為嗜水氣單胞菌，GY-2-1 為惡臭假單胞菌。

表1 細(xì)菌生物系統(tǒng)初步鑒定結(jié)果

2.4 藥敏試驗(yàn)

綜合匯總3 種菌的藥敏程度（表3），棲稻黃色單胞菌惡臭假單胞菌對恩諾沙星、硫酸新霉素、鹽酸多西環(huán)素和磺胺甲惡唑+甲氧芐啶高度敏感。嗜水氣單胞菌對恩諾沙星、硫酸新霉素、甲砜霉素、氟 苯尼考和鹽酸多西環(huán)素5 種抗生素高度敏感。惡臭假單胞菌對恩諾沙星、硫酸新霉素、鹽酸多西環(huán)素高度敏感。

表2 基因序列相似度

表3 菌株藥敏特性

3 討論

假單胞菌與嗜水氣單胞菌廣泛分布于自然環(huán)境中和水生動物體內(nèi)，棲稻黃色單胞菌、惡臭假單胞菌屬于革蘭氏陰性菌，是一種條件性致病菌。惡臭假單胞菌在人體的呼吸道和腸道也有分布，引起人的敗血癥等。該菌除了感染人之外，對多種水生動物如兩棲類、魚類都有較強(qiáng)的感染性。對不同的水生動物感染惡臭假單胞菌引起的癥狀與病理變化也有較大的差異[4-6]。該研究中感染的鯽魚病理癥狀為腸炎，解剖后腹腔有惡臭的氣味。嗜水氣單胞菌屬于氣單胞菌科，氣單胞菌屬。在池塘水質(zhì)變化，養(yǎng)殖魚體體質(zhì)下降時往往誘發(fā)疾病，給水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)造成損失。嗜水氣單胞菌易致鯽魚赤皮、皮膚潰爛、敗血癥急性死亡[7-8]。所以如何有效的抑制嗜水氣單胞菌與假單胞菌在養(yǎng)殖生產(chǎn)中尤為重要，該研究主要通過分離出的3 組細(xì)菌做藥敏試驗(yàn)，對比出抗菌效果較好的幾種藥物，指導(dǎo)養(yǎng)殖戶解決了目前鯽魚大批量死亡的問題。但在實(shí)際應(yīng)用過程中，這些藥物可能會受到溫度、環(huán)境污染物等多方面影響，要因地制宜地使用。當(dāng)然，長期濫用同一種抗生素藥物在消滅細(xì)菌的同時也造成耐藥性的問題也值得我們重點(diǎn)關(guān)注[9]，藥物只是起到輔助作用，在養(yǎng)殖過程中，做好預(yù)防管理工作才能獲得更好的經(jīng)濟(jì)效益。