試析固相萃取

摘 要：在辣椒生產(chǎn)中，甲基硫菌靈是常用的真菌病害防治藥劑，表現(xiàn)出一定不穩(wěn)定性，加大了辣椒中甲基硫菌靈殘留量檢測的難度?；诖?，本文提出一種固相萃取--高效液相色譜法，以實驗方式測定辣椒中甲基硫菌靈的殘留量，分析其在測定中的準確性、精密度與靈敏度。

關鍵詞：固相萃取;高效液相色譜法;甲基硫菌靈

目前常用的甲基硫菌靈測定方法較多，如液相色譜法、紫外分光光度法及氣相色譜法等。在實踐測定中，上述方法表現(xiàn)出樣品前處理流程復雜、樣品測定時間長、測定使用的化學試劑量大等缺點，不符合蔬菜水果的快速檢測要求。就此，關于固相萃取--高效液相色譜法測定的分析具有鮮明現(xiàn)實意義。

1 測定實驗

1.1 試劑與儀器

實驗使用的試劑如下：分析純級別的丙酮、乙酸乙酯及無水乙醇、去離子水、甲基硫菌靈標準儲備液、色譜純級別的甲醇等。其中，甲基硫菌靈標準儲備液的制備流程如下：將甲基硫菌靈標準品和甲醇混合，制備不同濃度梯度的標準溶液，其濃度分別為0.55mg/mL、1.1mg/mL、2.2mg/mL、5.5mg/mL、11mg/mL、22mg/mL;實驗使用的儀器如下：液相色譜儀、0.45μm的過濾膜、固相萃取柱及氮吹儀等;實驗使用的樣品為市場售賣的辣椒。

1.2 樣品前處理

本實驗選擇固相萃取方式進行樣品前處理，最大限度提取辣椒樣品中的甲基硫菌靈，提高殘留量檢測的精密度與準確性，具體的處理流程如下：第一，將干辣椒研磨為粉末狀，準確稱取0.500g干辣椒粉置于20mL離心管中，向離心管中添加10mL丙酮及1g無水硫酸鈉，首先在超聲波條件下進行溶液萃取，萃取時間為2min，再將離心管加塞，按照1500r/min的參數(shù)，分離2min;第二，取上清液置于50mL離心管中，將離心管中的殘渣用丙酮清洗兩次，第一次用10mL丙酮，第二次用5mL丙酮，兩次清洗液均置于50mL離心管中，將其在水浴鍋中進行真空旋轉(zhuǎn)蒸干處理，水浴鍋的參數(shù)設定為40℃;第三，通過乙酸乙酯溶解蒸干的殘渣，蒸干后置于中性氧化鋁固相萃取小柱中，選擇乙酸乙酯和無水乙醇混合液（二者體積比為5：1）作為洗脫劑，對固相萃取小柱進行清洗，將洗脫的速率控制在1mL/min，應用15mL樣品瓶收集固相萃取小柱內(nèi)的液體，使用氮吹儀吹干，通過甲醇溶解吹干的物質(zhì)，利用0.45μm的過濾膜過濾獲得樣品溶液。

1.3 實驗方法

在應用高效液相色譜儀測定樣品溶液內(nèi)的甲基硫菌靈時，色譜條件如下：選擇安捷倫系列二異丁基不銹鋼柱為色譜柱，其規(guī)格為250mm×4.6mm;將進樣量設定為10μL，色譜柱的溫度設定為35℃;選擇甲醇和水為流動相，二者體積比為3：2，將流動相的流速設定為0.8mL/min;檢測時的波長設定為268nm，根據(jù)色譜的保留時間對甲基硫菌靈進行定性分析，通過外標法對甲基硫菌靈進行定量分析。

2 實驗結(jié)果與分析

2.1 樣品處理參數(shù)選擇

在辣椒中甲基硫菌靈殘留量測定中，對樣品的處理效果直接關系到測定結(jié)果的準確性。為保障甲基硫菌靈能夠最大限度地被提取，在測定實驗前進行樣品處理參數(shù)選擇實驗，通過多項參數(shù)對比分析，選出最佳的藥劑與用量。

第一，溶劑選擇。備選溶劑包括甲醇、丙酮及二氯甲烷等，稱取等量辣椒粉樣品，應用備選溶劑溶解，發(fā)現(xiàn)丙酮和苯的溶解效果最佳，但由于苯具有毒性，本實驗選擇丙酮為溶劑;第二，凈化劑選擇。由于辣椒粉中的色素含量較大，會對測定工作造成不利影響，需在樣品處理時應用凈化劑。常用的凈化劑包括活性炭、中性氧化鋁等。由于活性炭的吸附性較強，不僅可吸附色素，還會吸附甲基硫菌靈，影響測定結(jié)果的準確性，所以本實驗選擇中性氧化鋁作為凈化劑，提高甲基硫菌靈和回收率。和活性炭相比，中性氧化鋁的回收率要高30%左右。就此，在測定實驗時，選擇中性氧化鋁固相萃取小柱;第三，洗脫劑選擇。在甲基硫菌靈洗脫中，乙酸乙酯和無水乙醇組成的洗脫體系表現(xiàn)出較大優(yōu)勢。本實驗選擇二者為洗脫劑，設定不同體積比，分別對辣椒粉進行洗脫實驗。實驗結(jié)果顯示，體積比為5：1時，洗脫效果最佳。就此，在測定實驗時，按照乙酸乙酯：無水乙醇=5：1的體積比進行洗脫處理;第四，洗脫體積設定。在明確洗脫劑類型的基礎上，需選擇合適的洗脫劑用量，保障洗脫劑作用的發(fā)揮。在洗脫體積設定實驗中，將不同濃度的標準甲基硫菌靈溶液置于辣椒粉溶液中，分別設定不同洗脫劑濃度梯度，對固相萃取小柱進行洗脫處理，再應用甲醇進行二次洗脫，收集最終的洗脫液，測定洗脫液內(nèi)的甲基硫菌靈含量，明確最佳洗脫體積。實驗結(jié)果表明，洗脫劑體積為5mL時，洗脫液內(nèi)未檢測到甲基硫菌靈，即將洗脫劑的體積選為5mL。

2.2 色譜條件選擇

第一，流動相體積比選擇。選擇不同體積比進行洗脫實驗，實驗結(jié)果顯示，在甲醇和水的體積比為3：2時，分離效果最佳，獲得的色譜圖峰形與出峰時間最佳，靈敏度較高。就此，在檢測時，將流動相體積比設定為3：2;第二，流動相流速選擇。選擇0.5mL/min、0.8mL/min、1mL/min、1.2mL/min四種流速方案，分別進行樣品溶液的洗脫處理。洗脫結(jié)果顯示，在流速為0.8mL/min時，樣品溶液的洗脫效果最佳。就此，在檢測時，將流動相的流速設定為0.8mL/min;第三，檢測波長選擇。選擇170-780nm為檢測波長備選范圍，檢測樣品前處理獲得的溶液。對比各個波長獲得的色譜圖，發(fā)現(xiàn)在268nm時，獲得的色譜圖雜峰較少，且表現(xiàn)出最大的甲基硫菌靈吸收峰。就此，在檢測時，將檢測波長設定為268nm。

2.3 高效液相色譜法的檢測限

將制備的甲基硫菌靈標準儲備液為基礎，按照上述色譜條件，對不同濃度的標準儲備液進行檢測，每個濃度的標準樣品測定三次，保障測定結(jié)果的準確性。在甲基硫菌靈濃度在0.5-22mg/L時，甲基硫菌靈溶液的濃度和色譜圖的峰面積間存在一定線性關系，二者間的線性回歸方程為：y=39002x-5983.9，R2=0.9995，可以判斷該線性回歸方程的線性關系良好，可通過色譜圖的峰面積，計算溶液中甲基硫菌靈的含量，說明高效液相色譜法測定辣椒中甲基硫菌靈溶液殘留量的準確性較高。同時，按照信噪比S/N=3的參數(shù)，計算高效液相色譜法檢測的最低檢測限為0.06mg/L。

2.4 高效液相色譜法的回收率

在回收率計算中，本實驗將辣椒粉溶液為基礎，分別加入1.1mg/L、2.2mg/L、5.5mg/L的甲基硫菌靈標準溶液，按照樣品前處理流程，對混合溶液進行甲基硫菌靈的提取，不同添加濃度的混合溶液分別檢測六次，做平行實驗。將檢測數(shù)據(jù)為基礎，通過外標法進行定量處理，計算不同濃度樣品溶液的平均回收率及相對標準偏差。計算結(jié)果如下：在1.1mg/L添加濃度下，平均回收率為76.82%、相對標準偏差為3.66%;在2.2mg/L添加濃度下，平均回收率為80.43%、相對標準偏差為4.94%;在5.5mg/L添加濃度下，平均回收率為88.70%、相對標準偏差為3.58%。可見，本實驗采取的樣品處理方法，具備較高的甲基硫菌靈回收率，可保障高效液相色譜檢測的準確性。

總的來說，在辣椒中甲基硫菌靈殘留量檢測中，應用固相萃取方法，可獲得較高的甲基硫菌靈回收率，為后續(xù)甲基硫菌靈檢測奠定基礎，保障測定結(jié)果的準確性。

3 結(jié)論

綜上所述，在進行辣椒中甲基硫菌靈殘留量測定時，檢測人員可選擇固相萃取方式提取辣椒中的甲基硫菌靈，選擇最佳樣品前處理試劑與參數(shù);合理設定高效液相色譜儀的色譜條件，發(fā)揮高效液相色譜法的優(yōu)勢，提高辣椒中甲基硫菌靈殘留量測定的準確性與精度，保障辣椒的健康安全。

參考文獻：

[1]鄒欽培，陳京蓉，熊鷹，等.2016-2017年某市加工型辣椒農(nóng)藥殘留狀況分析[J].現(xiàn)代預防醫(yī)學，2019，46（11）：1961-1964+1972.

作者簡介：

沈方（1990- ），女，漢族，籍貫：江蘇省新沂市新安鎮(zhèn)，學歷：本科，畢業(yè)于南京財經(jīng)大學，現(xiàn)有職稱：助理工程師，研究方向：中級工程師。