傳染性單核細胞增多癥兒童外周血中TLR9 mRNA及γδ-TCR型DNT細胞的表達*

吳振奎， 鐘麗花， 劉延霞， 劉玉玲

(1.海南現(xiàn)代婦女兒童醫(yī)院 兒科， 海南 ?？?571100； 2.海南省婦女兒童醫(yī)學中心 兒科， 海南 ?？?570208)

兒童傳染性單核細胞增多癥(IM)是原發(fā)EB病毒(EBV)感染的常見形式，IM感染多發(fā)生在兒童群體，大多數(shù)兒童被感染后呈現(xiàn)隱性性狀，無特異性臨床表現(xiàn)，確診難度較大[1-2]。IM的發(fā)病機制尚不明確，但其與機體免疫平衡紊亂密切相關(guān)，探討免疫相關(guān)物質(zhì)與IM間的關(guān)系，有助于臨床IM的診斷及了解IM的致病機制[3-4]。天然免疫系統(tǒng)中的細胞可表達模式識別受體(PRR)，PRR主要用于識別病原體結(jié)構(gòu)，Toll受體(TLR)是一類PRR，TLR9主要表達在B淋巴細胞表面，EBV病毒被證實為TLR9配體，能激活淋巴細胞上TRL9，誘發(fā)抗病毒反應[5-6]。人類胸外免疫組織及器官中存在一種雙陰性T細胞(DNT)，其在抗病毒、自身免疫及器官移植中均具有重要作用[7]。本研究以90例IM患兒作為研究對象，分析其入院時外周血淋巴細胞表型、TLR9 mRNA及(γ+δ)+TCR型DNT細胞表達水平變化，報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年1月—2020年1月收治的90例IM患兒作為研究對象，患兒均符合兒童EB病毒IM相關(guān)診斷標準[8]：臨床癥狀至少3項陽性(發(fā)熱、咽炎、扁桃體炎、頸部淋巴結(jié)腫大、肝臟腫大、脾臟腫大、皮疹)、血象檢測中≥5歲患兒白細胞分類的淋巴細胞占比50%以上或淋巴細胞總數(shù)>5.0×109/L，異型淋巴細胞達10%以上或總數(shù)>1.0×109/L；EB病毒抗體或EB病毒DNA檢查陽性。根據(jù)患兒病情，將患兒分為急性期組(n=50)與恢復期組(n=40)；急性期組患兒均為首次發(fā)病、未使用糖皮質(zhì)激素或細胞毒性藥物治療、未使用免疫調(diào)節(jié)劑治療，恢復期組為經(jīng)治療1個月后、臨床復查提示臨床癥狀及體征消失的患兒。同時選取30例同期體檢健康的同齡患兒作為對照組。IM患兒于入院時、對照組兒童于體檢當日抽取外周血，進行后續(xù)研究。

1.2 方法

1.2.1淋巴細胞表型分析 取3組兒童EDTA-K2抗凝的外周血3份，分別加入3支流式管中，在3支流式管中再各加入CD3-PECY5/CD4-FITC/CD8-PE 10 μL、CD3-PECY5/CD19-FITC 10 μL、CD3-FITC/CD(16+56)+PE 10 μL，充分混勻，25 ℃避光孵育20 min，加入OptiLyse C免洗溶血素250 μL，混勻靜置20 min，1 200 r/min離心5 min，去除上層血清，PBS緩沖液沖洗2次，加入PBS緩沖液500 μL懸浮細胞，流式細胞儀檢測10 000個淋巴細胞，流式數(shù)據(jù)分析及作圖使用EXPO32 ADC Analysis軟件。

1.2.2TLR9 mRNA表達水平 采用實時熒光定量PCR檢測，取3組兒童EDTA-K2抗凝的外周血5 mL，F(xiàn)icoll密度梯度離心法分離外周血單個核細胞(PBMNC)待用。設計并合成TLR9基因的上游引物序列為5′-CAGGACAACCACCACTTCT-3′，下游引物序列為5′-AGCCTTCGGTAGCATTTATTC-3′，目的片段大小為194 bp；以hGAPDH作為內(nèi)參基因，上游引物序列為5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′，下游引物序列為5′-GAAGAGGGTGATGGGATTTC-3′，目的片段大小為266 bp。試劑盒為SYBR Premix Ex TaqTMⅡ，儀器為ABI 7900HT Fast Real-Time PCR system儀，PCR擴增反應條件：95 ℃預變性30 s，95 ℃變性5 s、60 ℃退火30 s，40個循環(huán)，采用參照基因作為標準進行相對定量△CT法計算目的基因相對表達量。

1.2.3DNT細胞表型分析 取3組兒童EDTA-K2抗凝的外周血50 μL加入流式管，加入CD3-PECY5/CD4-FITC/PAN(α+β)TCR-PE 10 μL，充分混勻，25 ℃避光孵育20 min，加入OptiLyse C免洗溶血素250 μL，混勻靜置20 min，1 200 r/min離心5 min，去除上層血清，PBS緩沖液沖洗2次，加入PBS緩沖液500 μL懸浮細胞，流式細胞儀檢測10 000個淋巴細胞，使用EXP032 ADC XL4 Color軟件獲取數(shù)據(jù)，分別字前向散射光及側(cè)向散射光點圖中圈選出淋巴細胞，使用CD3設計，進一步在CD3+細胞中分析DNT細胞比例，流式數(shù)據(jù)分析及EXPO32 ADC Analysis軟件作圖。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 外周血淋巴細胞分型

結(jié)果顯示，3組兒童外周血CD3+、CD3+CD8+水平比較，急性期組>穩(wěn)定期組>對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；外周血CD3+CD4+、CD4/CD8、CD3-CD(16+56)+及CD3-CD19+水平比較，急性期組<穩(wěn)定期組<對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 3組兒童外周血淋巴細胞分型比較Tab.1 Comparison of lymphocyte typing in the peripheral blood among three groups

2.2 外周血TLR9 mRNA表達水平

結(jié)果顯示，3組兒童外周血TLR9 mRNA表達水平比較，急性期組>穩(wěn)定期組>對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 3組兒童外周血TLR9 mRNA表達水平比較Tab.2 Comparison of expression level of TLR9 mRNA in peripheral blood among three

2.3 外周血DNT細胞表型

結(jié)果顯示，對照組、穩(wěn)定期組及急性期組外周血中均有DNT細胞表達，為(γ+δ)+TCR型，且3組兒童外周血中(γ+δ)+TCR型DNT占比，急性期組>穩(wěn)定期組>對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 3組兒童外周血DNT細胞表型Tab.3 Phenotype of DNT cell in peripheral blood

3 討論

IM是一種單核-巨噬細胞系統(tǒng)急性增生性傳染病，該疾病主要由EBV感染所致，EBV感染后可侵犯機體淋巴系統(tǒng)，主要臨床表現(xiàn)為發(fā)熱、咽峽炎、頸淋巴結(jié)腫大，稱之為三聯(lián)征[9-11]。目前，IM診斷結(jié)合臨床表現(xiàn)與實驗室檢查結(jié)果做出最終判斷，但部分患兒在EBV原發(fā)感染后，大多數(shù)無癥狀，表現(xiàn)為隱性或輕型發(fā)病，外周血中異型淋巴細胞、特異性IgM檢測陽性率低，故在診斷IM時，需結(jié)合多種實驗室指標，并仔細分析患兒臨床表現(xiàn)。

IM發(fā)病機制尚不明確，但有大量研究發(fā)現(xiàn)，疾病的發(fā)生與患兒機體免疫機制失衡密切相關(guān)。IM急性期，其CD3+、CD8+水平明顯升高，CD3+CD4+、CD4+/CD8+水平明顯降低，存在明顯的CD4+/CD8+失衡[12-13]。本研究中，IM穩(wěn)定期及急性期患者外周血CD3+、CD3+CD8+水平明顯高于健康對照組，CD3+CD4+、CD4/CD8、CD3-CD(16+56)+、CD3-CD19+水平明顯低于健康對照組，與上述研究結(jié)論一致。

病毒在體內(nèi)的生存與復制取決于宿主抗病毒機制，天然免疫系統(tǒng)相關(guān)細胞可表達PRR，以識別病原體結(jié)構(gòu)成分(PAMP)，TLR就是一類PRR[14-15]。TLR家族成員較多，其中TLR(2、3、4、7、8、9)能識別病毒，TLR(3、7、8、9)還可作為胞內(nèi)受體[16-17]。有研究發(fā)現(xiàn)，TLR能外源性及內(nèi)源性分子，并鑒別內(nèi)源性大分子降解產(chǎn)物，提示TLRs參與了組織損傷、感染等病理生理過程。TLR9主要表達于B淋巴細胞表面，可被含非甲基化的CpG寡脫氧核苷酸激活，在促使B淋巴細胞分化、增殖及活化過程中發(fā)揮功效，EBV是TLR9配體，可激活淋巴細胞上的TLR9，進而產(chǎn)生抗病毒的細胞因子[18-19]。EBV可通過TRL9途徑激活炎癥反應，導致IL-8釋放增多，動物實驗發(fā)現(xiàn)，TRL9缺陷小鼠具有更高的病毒滴度，其死亡風險也更高，提示TLR9在抗DNA病毒的免疫應答中具有重要作用，TLR9可誘導CD4+CD25+細胞與CD4+CD25-細胞證實，削弱Treg抑制活性，TLR9配體通過擴增效應T細胞與抑制CD4+CD25+Treg功能，以增強宿主適應性免疫反應[20]。本研究中，IM穩(wěn)定期及急性期IM患兒血TLR9 mRNA水平均顯著高于健康對照組，而急性期IM患兒TLR9 mRNA水平較穩(wěn)定期患兒上調(diào)，提示在IM急性期，病毒侵入機體后，TLR9表達上調(diào)以識別病原體，同時誘導機體開啟免疫機制，另一方面，TLR9表達上調(diào)能導致CD4+CD25+Treg抑制功能下降，進而加強機體免疫功能，利于病原體清除[21-23]。

大部分淋巴細胞是在胸腺發(fā)育成熟后成為表面標志的CD4+或CD8+單陽性T細胞，但體內(nèi)依舊存在少量DNT[24]。DNT表達量低，在抗病毒、腫瘤免疫等方面發(fā)揮功效，有研究還表示，DNT細胞在自身免疫及器官移植中均具有免疫調(diào)節(jié)作用。DNT的表達是機體抑制病毒特異性CD8+T細胞的免疫調(diào)節(jié)機制，同時對機體自身抗病毒具有協(xié)同作用。但目前，關(guān)于CNT細胞的來源仍不清楚，有研究發(fā)現(xiàn)，IL-2能促進轉(zhuǎn)化的DNT細胞增殖，DNT細胞對細胞經(jīng)成熟樹突狀細胞刺激后將呈低反應性，IL-2則可完全恢復其體外反應性，提示IL-2提高了DNT細胞對細胞的凋亡的抵抗力[25]。本研究發(fā)現(xiàn)，IM患兒出現(xiàn)特異性高表達(γ+δ)+TCR型DNT，對臨床診斷IM提供依據(jù)。

綜上所述，IM患兒機體免疫機制失衡，TLR9表達上調(diào)，并出現(xiàn)特異性(γ+δ)+TCR型DNT水平升高，其在診斷IM中具有重要價值。