制何首烏、巴戟天及其配伍對ox-LDL誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷的影響

李燕玲 林國偉 梁偉海 劉曉俊

廣州市第一人民醫(yī)院 (廣州 510180)

卒中后認(rèn)知功能障礙(post-stroke cognitive impairment, PSCI)是指卒中后6個月內(nèi)，出現(xiàn)認(rèn)知功能障礙的綜合征。PSCI作為卒中后常見的并發(fā)癥，給個人、家庭及社會都造成了嚴(yán)重的影響。西醫(yī)認(rèn)為PSCI與動脈硬化密切相關(guān)[1]，而動脈硬化又多責(zé)之氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)對血管的損害。中醫(yī)認(rèn)為PSCI與氣、血、痰、瘀、郁等有關(guān)，由腦髓空虛、精氣血不足、氣滯血瘀、痰濁阻竅、陰陽失調(diào)等所致，治療上多遵補(bǔ)腎填精、理氣化痰、益智醒腦、活血補(bǔ)血等法[2]。全國名老中醫(yī)劉茂才教授根據(jù)上述理論及豐富的臨床經(jīng)驗(yàn)，選用紫河車、巴戟天、制何首烏、黃芪、半夏、當(dāng)歸等中藥組成癡復(fù)康方，其中又以制何首烏、巴戟天等取補(bǔ)腎填精之妙。大量的臨床研究表明，癡復(fù)康能有效增加PSCI患者的大腦血流量、改善腦循環(huán)，促進(jìn)腦細(xì)胞恢復(fù)，從而改善癡呆癥狀[3]。癡復(fù)康選用制何首烏、巴戟天以補(bǔ)腎填精法治療PSCI，故筆者特選制何首烏、巴戟天及二者配伍，從其對氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)損傷的影響，以窺探補(bǔ)腎填精法治療PSCI的現(xiàn)代醫(yī)學(xué)原理，以示臨床。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞 HUVEC

1.2 藥材

制何首烏，巴戟天(廣州市藥材公司中藥飲片廠，批號分別YPA8C0001，YPA8G0002)

1.3 試劑

DMEM培養(yǎng)基(HyClone，批號SH30809.01B)，胎牛血清(Gibco，批號1027-106)，胰蛋白酶，PBS(博士德，批號PYG14190)，氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)，CCK8試劑盒(碧云天)，trypsin-EDTA溶液(BIOSHARP，批號WH0518)，雙抗(青霉素/鏈霉素原液)(TBD，批號PS2004HY)，Propidium Iodide/碘化丙啶(碧云天，批號ST512)，RNase A酶(SIGMA，批號R4875)，Annexin V-APC /7AAD kit(聯(lián)科生物，批號4224750)，高純總RNA快速提取試劑盒(BIOTEKE，批號RP1201)，HiScript II Q RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)(Vazyme，批號R223-01)，HieffTMqPCR SYBR? Green Master Mix (LoWRox Plus)(翊圣生物，批號11202ES08)，DL 2000 DNA marker(TAKARA，批號3427B(Ax2))，瓊脂糖(BIOWEST，批號G10)。

1.4 儀器

SW-CJ-2F型凈化工作臺(蘇州凈化有限公司)，水套式二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo)，普通光學(xué)顯微鏡(尼康)，多功能酶標(biāo)儀(Thermo)，水平離心機(jī)(湖南湘義離心機(jī)儀器有限公司)，渦旋混勻器(其林貝爾儀器制造有限公司)，純水機(jī)(廈門銳思捷水純化技術(shù)有限公司)，冰箱(青島海爾股份有限公司), 流式分析儀(愛森生物有限公司)，熒光定量PCR儀(博日公司)，Tanon-1600凝膠成像系統(tǒng)(天能公司)，JY200C電泳儀(君意公司)，超微量核算分析儀Nano-200(杭州奧盛)。

1.5 制何首烏、巴戟天對ox-LDL誘導(dǎo)HUVEC增殖和相對活率的影響

1.5.1 分組與給藥 實(shí)驗(yàn)分為8組，每組6個平行樣：空白對照組(正常培養(yǎng)的HUVEC)；模型組(正常培養(yǎng)的HUVEC，加入80 μg/mL ox-LDL[4]誘導(dǎo))，制何首烏低、中、高劑量組(模型組中分別加入不同濃度5、10、20 mg/mL的制何首烏水煎煮物)[5-6]，巴戟天低、中、高劑量組(模型組中分別加入不同濃度5、10、20 mg/mL的巴戟天煎煮物)[7]。

1.5.2 步驟 在96孔板中接種2 000個HUVEC懸液(100 μL/孔)。將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)24 h(37 ℃,5% CO2)，棄上清，用PBS緩沖液洗2次，模型組加入含80 μg/mL ox-LDL的DMEM培養(yǎng)基，樣品組加入含不同濃度的制何首烏，巴戟天，制何首烏+巴戟天的DMEM培養(yǎng)基。樣品干預(yù)48 h后,向每孔加入10 μL CCK8溶液(注意不要在孔中生成氣泡，它們會影響OD值的讀數(shù))。將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育0.5～4 h。用酶標(biāo)儀測定在450 nm處的吸光度。

1.6 制何首烏、巴戟天對ox-LDL誘導(dǎo)HUVEC凋亡的影響

1.6.1 分組與給藥 實(shí)驗(yàn)分為5組，每組6個平行樣：空白對照組(正常培養(yǎng)的HUVEC)；模型組(正常培養(yǎng)的HUVEC，加入80 μg/mL ox-LDL誘導(dǎo))，制何首烏組(模型組中加入10 mg/mL的制何首烏水煎煮物，即以上細(xì)胞相對活率實(shí)驗(yàn)測得的最佳制何首烏濃度)，巴戟天組(模型組中加入10 mg/mL的巴戟天煎煮物，即以上細(xì)胞相對活率實(shí)驗(yàn)測得的最佳巴戟天濃度)，制何首烏巴戟天配伍組(模型組中加入10 mg/mL的制何首烏，10 mg/mL巴戟天水煎煮物)。

1.6.2 步驟 細(xì)胞消化，取藥物處理完成后的細(xì)胞，消化收集細(xì)胞，PBS洗一次，再用1×Binding Buffer洗一次。制備細(xì)胞懸液，用1×Binding Buffer重懸細(xì)胞，并計數(shù)。孵育染料，每個樣品中加入100 μL 1×Binding Buffer，確保每管的細(xì)胞數(shù)為1×105～1×106個，加入5 μL Annexin V-APC和10 μL 7AAD，輕柔渦旋混勻后室溫避光孵育15 min。無需洗滌，每管加入485 μL預(yù)冷 1×Binding Buffer重懸混合。送流式細(xì)胞儀檢測，F(xiàn)lowjo分析數(shù)據(jù)。

1.6.3 不同藥物對ox-LDL誘導(dǎo)下HUVEC細(xì)胞周期的影響

1.6.4 分組與給藥 同1.6.1。

1.6.5 步驟 細(xì)胞消化，取細(xì)胞生長狀況良好，密度適中的細(xì)胞，在超凈臺中消化收集細(xì)胞，棄上清，用預(yù)冷PBS洗細(xì)胞兩次。細(xì)胞固定，加入預(yù)冷70%乙醇重懸，于4 ℃固定過夜，或-20 ℃長期固定。細(xì)胞染色，離心收集細(xì)胞，1 mL PBS洗細(xì)胞一次，加入500 μL PBS [含5 μg/mL碘化丙錠(PI)]，100 μg/mL RNaseA，0.2%Triton X-100)4 ℃避光孵育30 min。流式細(xì)胞儀分析，以標(biāo)準(zhǔn)程序用流式細(xì)胞儀檢測，計數(shù)1×105個細(xì)胞以上。數(shù)據(jù)分析，結(jié)果用細(xì)胞周期擬合軟件Flowjo分析。

1.7 qPCR法鑒定ox-LDL誘導(dǎo)下HUVEC中Caspase-3、Caspase-9 mRNA的表達(dá)量

1.7.1 分組與給藥同1.6.1。

1.7.2 步驟 根據(jù)表1進(jìn)行設(shè)計引物，根據(jù)試劑說明書提取總RNA，收集各組細(xì)胞沉淀，準(zhǔn)備PCR反應(yīng)管，依次在管中加入20 μL反應(yīng)體系，并于 qPCR儀上反應(yīng)。

表1 引物設(shè)計

1.8 統(tǒng)計分析

2 結(jié) 果

2.1 制何首烏、巴戟天對ox-LDL誘導(dǎo)HUVEC細(xì)胞增殖和相對活率的影響

與空白組比較，制何首烏高劑量組的細(xì)胞增殖OD值下降(P<0.000 1)，巴戟天高劑量組的細(xì)胞增殖OD值下降(P<0.000 1)，以上藥物劑量具有細(xì)胞毒性；與空白組比較，制何首烏低劑量組細(xì)胞增殖OD值無下降(P=0.305)，制何首烏中劑量組細(xì)胞增殖OD值上升(P<0.000 1)、巴戟天低劑量組細(xì)胞增殖OD值上升(P<0.000 1)，巴戟天中劑量組細(xì)胞增殖OD值上升(P<0.000 1)，說明無細(xì)胞毒性。與空白組比較，模型組細(xì)胞相對活率下降(P<0.000 1)，細(xì)胞損傷模型制備成功。與模型組比較，制何首烏低劑量組細(xì)胞相對活率增高(P=0.001)，制何首烏中劑量組細(xì)胞相對活率增高(P<0.000 1)、巴戟天低劑量組細(xì)胞相對活率增高(P<0.000 1)，巴戟天中劑量組細(xì)胞相對活率增高(P<0.000 1)，巴戟天高劑量組細(xì)胞相對活率增高(P<0.000 1)，其中10 mg/mL制何首烏、10 mg/mL巴戟天細(xì)胞活率最好。見表2。

表2 制何首烏、巴戟天對HUVECs細(xì)胞 增殖和相對活率的影響

2.2 制何首烏、巴戟天對ox-LDL誘導(dǎo)下HUVEC細(xì)胞凋亡的影響

與空白組相比，模型組的凋亡率增高(P<0.000 1)，表明ox-LDL誘導(dǎo)HUVEC凋亡，模型制備成功。與模型組比較，制何首烏組的凋亡率降低(P<0.000 1)，巴戟天組的凋亡率降低(P<0.000 1)，制何首烏巴戟天配伍組的凋亡率降低(P<0.000 1)，說明制何首烏、巴戟天、制何首烏巴戟天配伍均有抑制ox-LDL誘導(dǎo)HUVEC細(xì)胞凋亡作用。與制何首烏組比較，巴戟天組凋亡率降低(P<0.000 1)，制何首烏巴戟天配伍組凋亡率降低(P<0.000 1)；與巴戟天組比較，制何首烏巴戟天配伍組凋亡率無統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.260)，說明巴戟天抑制ox-LDL誘導(dǎo)HUVEC細(xì)胞凋亡作用強(qiáng)于制何首烏，制何首烏巴戟天配伍抑制ox-LDL誘導(dǎo)HUVEC細(xì)胞凋亡作用強(qiáng)于單味中藥制何首烏。見圖1、表3。

圖1 制何首烏、巴戟天對ox-LDL誘導(dǎo)HUVECs細(xì)胞凋亡的影響注：A. 為空白組；B. 為模型組；C. 為制何首烏組；D. 為巴戟天組；E. 為制何首烏巴戟天配伍組

表3 制何首烏、巴戟天對ox-LDL誘導(dǎo)HUVECs細(xì)胞凋亡的影響 (n=6)

續(xù)表

2.3 制何首烏、巴戟天對ox-LDL誘導(dǎo)HUVEC細(xì)胞周期的影響

與空白組相比，模型組的(S+G2)%期降低(P<0.000 1)，表明ox-LDL誘導(dǎo)HUVEC損傷，模型制備成功。與模型組比較，制何首烏組的(S+G2)%期增高(P=0.014)，巴戟天組的(S+G2)%期增高(P=0.002)，制何首烏巴戟天配伍組的(S+G2)%期均增高(P<0.000 1)，說明制何首烏、巴戟天、制何首烏巴戟天配伍均有抑制ox-LDL誘導(dǎo)HUVEC損傷作用。與制何首烏組比較，巴戟天的(S+G2)%期無差異(P=0.441)，說明制何首烏、巴戟天抑制ox-LDL誘導(dǎo)HUVEC損傷的作用相似。與制何首烏組比較，制何首烏巴戟天配伍組的(S+G2)%期增高(P<0.000 1)，與巴戟天組比較，制何首烏巴戟天配伍組的(S+G2)%期增高(P<0.000 1)，說明何首烏巴戟天配伍抑制ox-LDL誘導(dǎo)HUVEC損傷作用強(qiáng)于單味中藥制何首烏、巴戟天。見表4、圖2。

圖2 制何首烏、巴戟天對ox-LDL誘導(dǎo)HUVECs細(xì)胞周期的影響注：A. 為空白組；B. 為模型組；C. 為制何首烏組；D. 為巴戟天組；E. 為制何首烏巴戟天配伍組

表4 制何首烏、巴戟天對ox-LDL誘導(dǎo)HUVECs細(xì)胞周期的影響 (n=6)

2.4 制何首烏、巴戟天對ox-LDL誘導(dǎo)HUVECs中NFκB mRNA表達(dá)的影響

與空白組相比，模型組的NFκB mRNA的表達(dá)量高于空白組(P<0.000 1)，模型制備成功。與模型組相比，制何首烏組的NFκB mRNA的表達(dá)量下降(P<0.000 1)，巴戟天組的NFκB mRNA的表達(dá)量下降(P<0.000 1)，制何首烏巴戟天配伍組的NFκB mRNA的表達(dá)量下降(P<0.000 1)。與制何首烏組比較，巴戟天組的NFκB mRNA表達(dá)量下降(P<0.000 1)，說明制何首烏抑制ox-LDL誘導(dǎo)HUVECs中NFκB mRNA表達(dá)的作用強(qiáng)于巴戟天。與制何首烏組比較，制何首烏巴戟天配伍組的NFκB mRNA表達(dá)量下降(P<0.000 1)；與巴戟天組比較，制何首烏巴戟天配伍組的NFκB mRNA表達(dá)量下降(P<0.000 1)，說明制何首烏巴戟天配伍下調(diào)NFκB mRNA表達(dá)的作用強(qiáng)于單味中藥制何首烏、巴戟天。見表5。

表5 制何首烏、巴戟天對ox-LDL誘導(dǎo) HUVECs中NFκB mRNA表達(dá)的影響

3 討 論

西醫(yī)認(rèn)為動脈粥樣硬化(AS)是卒中的病理學(xué)基礎(chǔ)，而ox-LDL從多個途徑促進(jìn)AS的發(fā)生發(fā)展。ox-LDL可以刺激內(nèi)皮細(xì)胞多種炎癥因子、黏附分子的表達(dá)，如單核細(xì)胞趨化蛋白-1、血管細(xì)胞黏附分子-1等[8]，誘導(dǎo)單核細(xì)胞遷移進(jìn)入動脈內(nèi)膜轉(zhuǎn)化為巨噬細(xì)胞[9]。ox-LDL本身有細(xì)胞毒作用，且比LDL更快地與巨噬細(xì)胞表面受體結(jié)合，促進(jìn)巨噬細(xì)胞吞噬形成泡沫細(xì)胞，而泡沫細(xì)胞形成是整個AS進(jìn)程中的最重要的病理學(xué)標(biāo)志[10]。ox-LDL不僅促進(jìn)AS形成，還促進(jìn)AS斑塊破裂、觸發(fā)腦卒中事件發(fā)生，而我國卒中后認(rèn)知功能障礙發(fā)生率約為55.9%[11]。

PSCI屬于中醫(yī)“呆病”、“善忘”、“癲證”、“郁證”等范疇，《醫(yī)林改錯》認(rèn)為“靈機(jī)記性不在心在腦”，故病位在腦?！鹅`樞·經(jīng)脈篇》：“人始生，先成精，精成后而腦髓生?！薄端貑枴の迮K生成論》：“諸髓者，皆屬于腦?！惫誓X為髓海。腎為先天之本，腎藏精，精生髓，故腦髓與腎息息相關(guān)。腎精充足，則髓海之源不斷，元神之府得安。腎虛不生髓，則腦髓空虛，元神不安，則出現(xiàn)頭暈、耳鳴、目眩、健忘、嗜睡、癡呆等癥狀。癡復(fù)康治療PSCI有顯效，通過改變患者的血液流變學(xué)、抗血小板凝聚、降低血液中的膽固醇和甘油三酯，升高高密度脂蛋白[12]等增加大腦血流量，維護(hù)腦細(xì)胞功能，改善學(xué)習(xí)能力、記憶功能[13]、卒中后前瞻性記憶障礙[14]，改善癡呆癥狀。本實(shí)驗(yàn)選用癡復(fù)康方中的制何首烏、巴戟天，通過探討二藥及其配伍對ox-LDL誘導(dǎo)的HUVEC損傷的影響，認(rèn)為制何首烏、巴戟天通過抑制ox-LDL誘導(dǎo)的HUVEC凋亡以及NFκB mRNA的表達(dá)、延長ox-LDL誘導(dǎo)的HUVEC的細(xì)胞周期(S+G2)%，從而達(dá)到抑制動脈硬化、治療PSCI的效果。這也是對實(shí)驗(yàn)法對補(bǔ)腎填精法治療PSCI的佐證初探，希望將來有更多的研究提供證據(jù)。