嗜酸乳桿菌和乳酸乳球菌混合發(fā)酵菊芋泡菜的研究

徐清萍，郭苗苗，唐培鑫，任超凡，唐百芬，胡麗亞

(1.鄭州輕工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，鄭州 450001；2.食品生產(chǎn)與安全河南省協(xié)同創(chuàng)新中心，鄭州 450001)

菊芋為菊科向日葵屬多年生草本植物，是一種生態(tài)抗逆性強、生命力旺盛的能源作物[1]。菊芋可用于生產(chǎn)菊粉、果糖、乙醇、丁醇等多種生物制品[2,3]。將菊芋粉添加到面包中，可以試制菊芋面包[4]，制作菊芋飲料[5,6]。菊芋中含有菊糖、脂肪酸、萜類、酚酸類等多種生物活性物質(zhì)[7]。目前國內(nèi)的菊芋主要用于生產(chǎn)醬菜、動物飼料等初級產(chǎn)品。

菊芋用于制作泡菜，多采用高鹽腌制的方式加工，這不僅影響了菊芋食品的口感，同時后期生產(chǎn)泡菜進(jìn)行脫鹽處理也增加了生產(chǎn)成本[8]。采用自然發(fā)酵的傳統(tǒng)泡菜工藝，生產(chǎn)中的優(yōu)勢菌群有乳桿菌屬、片球菌屬、鏈球菌屬、腸桿菌屬等[9]。在前期，由原料和環(huán)境帶入的雜菌較多,致病菌污染的風(fēng)險難以完全排除。與自然發(fā)酵相比，人工接種發(fā)酵具有亞硝酸鹽含量低、總酸含量高、發(fā)酵速度快的優(yōu)點。嗜酸乳桿菌LA、乳酸乳球菌LL為本實驗室前期篩選，對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等具有一定抑菌活性，有利于降低致病菌污染風(fēng)險。本文主要將具有抗菌性能的嗜酸乳桿菌LA、乳酸乳球菌LL應(yīng)用于菊芋泡菜發(fā)酵中，并研究接種量、加糖量、加鹽量、發(fā)酵時間對嗜酸乳桿菌LA、乳酸乳球菌LL混合發(fā)酵菊芋泡菜的影響，研究抗菌性乳酸菌的應(yīng)用對菊芋泡菜主要指標(biāo)的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

食鹽、白砂糖、甜菊糖苷：食品級，市售；菊芋：采收自鄭州附近種植地。

嗜酸乳桿菌LA、乳酸乳球菌LL：鄭州輕工業(yè)大學(xué)食品新產(chǎn)品新技術(shù)創(chuàng)新實驗室保藏菌種。

MRS肉湯培養(yǎng)基：杭州百思生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SHP-250智能生化培養(yǎng)箱 上海鴻都電子科技有限公司；LX-C35L滅菌鍋 合肥華泰醫(yī)療設(shè)備有限公司；SW-CJ-2FD潔凈工作臺 蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；YP20001電子天平 上海光正醫(yī)療儀器有限公司；UV-5500分光光度計 上海元析儀器有限公司。

1.3 發(fā)酵菊芋的制備

1.3.1 工藝流程

菊芋→清洗→晾干→切片→裝壇→加香辛料液→接種→發(fā)酵→成品。

1.3.2 操作要點

配制番茄-黃豆芽-菊芋培養(yǎng)液[10]：稱取20 g番茄，20 g黃豆芽，10 g菊芋，加入1 L水煮30 min，過濾后加入20 g葡萄糖，攪拌溶解，補水定容至1 L，滅菌，冷卻后備用。

將嗜酸乳桿菌LA和乳酸乳球菌LL接入MRS肉湯培養(yǎng)基活化后，按1∶1的比例混合接種，總接種量2%(體積分?jǐn)?shù))，轉(zhuǎn)接到番茄-黃豆芽-菊芋培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h，作為乳酸菌種液。

配制香辛料液，每1 kg水中，加入干辣椒30 g，生姜10 g，八角1 g，花椒1 g，白砂糖20 g，加熱，煮沸。

菊芋清洗、晾干、切片，按香辛料液∶菊芋為3∶1(質(zhì)量比)的比例倒入香辛料液，按比例加入白砂糖、食鹽，拌勻，接種乳酸菌種液。分別考察接種量、加糖量、甜味劑用量、加鹽量、發(fā)酵時間等對菊芋片發(fā)酵過程中總酸(以乳酸計)含量、亞硝酸鹽含量、氨基酸態(tài)氮含量的影響。發(fā)酵期間定期取樣測定發(fā)酵液中總酸(以乳酸計)含量、氨基酸態(tài)氮含量及菊芋片中的亞硝酸鹽含量。

1.4 乳酸含量的測定

參考國標(biāo)GB/T 12456—2008《食品中總酸的測定》。

1.5 亞硝酸鹽含量的測定

參考國標(biāo)GB 5009.33—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》。

1.6 氨基酸態(tài)氮含量的測定

參考國標(biāo)GB 5009.235—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中氨基酸態(tài)氮的測定》。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同接種量發(fā)酵菊芋泡菜

按香辛料液∶菊芋為3∶1(質(zhì)量比)的比例，將菊芋、香辛料液倒入泡菜壇中，分別接種乳酸乳球菌LL、嗜酸乳桿菌LA混合種液2，5，10，20，50 g/kg，室溫(25 ℃)下發(fā)酵7 d。發(fā)酵期間定時取樣測定發(fā)酵液中總酸(以乳酸計)含量、氨基酸態(tài)氮含量及菊芋片中亞硝酸鹽含量，結(jié)果見圖1。

圖1 不同接種量發(fā)酵菊芋時各指標(biāo)的變化Fig.1 Changes of various indexes in the fermentation of Jerusalem artichoke with different inoculation amount

圖1中(1)為乳酸乳球菌LL、嗜酸乳桿菌LA在不同接種量時，菊芋泡菜發(fā)酵液中總酸含量(以乳酸計)隨時間的變化曲線。由圖1中(1)可知，隨著發(fā)酵時間的延長，產(chǎn)酸量逐漸增加，其中總酸含量(以乳酸計)在發(fā)酵前5 d時變化較快，發(fā)酵5 d后，總酸含量基本不再明顯增加。接種量低于10 g/kg時，適當(dāng)提高接種量，有利于提高發(fā)酵前期(3 d)發(fā)酵液的總酸含量；接種量高于10 g/kg時，各組間的總酸含量變化差異不大。發(fā)酵7 d時，不同接種量對應(yīng)發(fā)酵液的總酸(以乳酸計)最低為10.01 g/L，最高為10.79 g/L。說明發(fā)酵液總酸含量主要受發(fā)酵時間的影響，適當(dāng)增加接種量有利于提高產(chǎn)酸速度。

圖1中(2)為乳酸乳球菌LL、嗜酸乳桿菌LA混合發(fā)酵在不同接種量時，菊芋泡菜發(fā)酵液中氨基酸態(tài)氮含量隨時間的變化曲線。由圖1中(2)可知，隨著發(fā)酵時間的延長，氨基酸態(tài)氮含量呈現(xiàn)上升趨勢，其中在發(fā)酵前3 d時，氨基酸態(tài)氮含量增加較快，發(fā)酵3 d后，變化逐漸趨于穩(wěn)定。接種量主要在發(fā)酵前期對發(fā)酵液中氨基酸態(tài)氮含量的影響差異較大，適當(dāng)提高接種量，發(fā)酵液中氨基酸態(tài)氮含量相對更高。發(fā)酵5 d后，各組間的氨基酸態(tài)氮含量相差不大。

圖1中(3)為嗜酸乳桿菌LA、乳酸乳球菌LL混合接種，不同接種量時發(fā)酵菊芋片中亞硝酸鹽含量的變化。由圖1中(3)可知，采用嗜酸乳桿菌LA、乳酸乳球菌LL混合發(fā)酵，菊芋片中亞硝酸鹽含量較低，其中亞硝酸鹽含量相對較高的時間為發(fā)酵1 d或3 d，發(fā)酵5 d后，亞硝酸鹽含量均低于5 mg/kg，不同接種量組間亞硝酸鹽含量差異不大，發(fā)酵7 d，除個別組外，亞硝酸鹽含量均低于4 mg/kg。亞硝酸鹽含量在發(fā)酵過程中無明顯的高峰，亞硝酸鹽含量符合國家標(biāo)準(zhǔn)中的規(guī)定限量，醬腌菜制品中亞硝酸含量不得超過20 mg/kg。據(jù)相關(guān)報道，乳酸菌產(chǎn)生的亞硝酸還原酶和代謝產(chǎn)物乳酸，可降解和清除亞硝酸鹽，從而降低泡菜發(fā)酵過程中亞硝酸鹽含量[11]。

綜合考慮接種量對總酸、氨基酸態(tài)氮、亞硝酸鹽含量的影響，接種量主要影響產(chǎn)酸速度和氨基酸態(tài)氮含量，適當(dāng)提高接種量有利于縮短發(fā)酵菊芋到達(dá)合適總酸含量的時間。

2.2 不同加糖量時菊芋泡菜指標(biāo)變化

按香辛料液∶菊芋為3∶1(質(zhì)量比)的比例混合，接種乳酸菌混合種液20 g/kg，分別加白砂糖0，10，15，20，25，30 g/kg，室溫發(fā)酵7 d，定時取樣測定發(fā)酵液中總酸含量、氨基酸態(tài)氮含量及菊芋片中亞硝酸鹽含量，結(jié)果見圖2。

圖2 不同加糖量發(fā)酵菊芋時各指標(biāo)的變化Fig.2 Changes of various indexes in the fermentation of Jerusalem artichoke with different sugar additive amount

圖2中(1)為不同加糖量時總酸含量隨時間的變化曲線。由圖2中(1)可知，隨著發(fā)酵時間延長，發(fā)酵液中總酸含量增加，其中總酸含量(以乳酸計)在發(fā)酵前5 d時增長較快，發(fā)酵5 d后，總酸含量不再明顯增加。與不添加白砂糖組相比，加白砂糖量高的發(fā)酵液總酸含量更高一些，但從各組間總酸含量的差值看，差值變化并不是很大。根據(jù)前期對嗜酸乳桿菌LA、乳酸乳球菌LL利用不同碳源的試驗分析，與葡萄糖相比，嗜酸乳桿菌LA、乳酸乳球菌LL利用蔗糖產(chǎn)酸能力較弱，添加白砂糖(成分為蔗糖)對嗜酸乳桿菌LA、乳酸乳球菌LL混合發(fā)酵的結(jié)果測定也表明其在發(fā)酵菊芋前期對總酸含量變化的影響較小。

圖2中(2)為不同加糖量時發(fā)酵液中氨基酸態(tài)氮含量隨時間的變化曲線。由圖2中(2)可知，氨基酸態(tài)氮含量基本在發(fā)酵5 d時達(dá)到高峰，此后又有所下降。與未加糖組進(jìn)行對比，適當(dāng)增加糖含量，有利于提高發(fā)酵液中氨基酸態(tài)氮的含量。發(fā)酵7 d時，各組間氨基酸態(tài)氮含量相差不大。

圖2中(3)為不同加糖量時菊芋片中亞硝酸鹽含量隨時間的變化曲線。由圖2中(3)可知，采用乳酸乳球菌LL、嗜酸乳桿菌LA混合發(fā)酵，亞硝酸鹽含量在發(fā)酵1 d時相對較高，此后降低。與不添加白砂糖組相比，適當(dāng)添加白砂糖，有利于降低發(fā)酵后期亞硝酸鹽含量，但各組間的差值并不是很大。其中白砂糖添加量為20 g/kg時，亞硝酸鹽含量在整個發(fā)酵期間均處于較低水平。

2.3 不同甜菊糖苷添加量時菊芋泡菜指標(biāo)變化

甜菊糖苷是一種常用的甜味劑，乳酸乳球菌LL、嗜酸乳桿菌LA混合種液接種量20 g/kg，白砂糖20 g/kg，分別添加甜菊糖苷0，0.1，0.15，0.2，0.25，0.3 g/kg，室溫發(fā)酵7 d，定期取樣測定，結(jié)果見圖3。

圖3 不同甜菊糖苷添加量發(fā)酵菊芋時各指標(biāo)的變化Fig.3 Changes of various indexes in the fermentation of Jerusalem artichoke with different steviol glycosides additive amount

圖3中(1)為甜菊糖苷在不同添加量時發(fā)酵液中總酸含量(以乳酸計)隨時間的變化曲線。由圖3中(1)可知，隨著發(fā)酵時間延長，總酸含量增加，發(fā)酵前5 d增長較快，發(fā)酵5 d后，總酸含量不再明顯變化。對比甜菊糖苷在不同添加量時對總酸的影響，甜菊糖苷添加量對發(fā)酵液總酸含量(以乳酸計)變化無明顯影響。

圖3中(2)為甜菊糖苷在不同添加量時發(fā)酵液中氨基酸態(tài)氮含量隨時間的變化曲線。由圖3中(2)可知，氨基酸態(tài)氮含量隨時間延長而逐漸增加，發(fā)酵5 d時達(dá)到高峰，此后略有降低。不同甜菊糖苷添加量，發(fā)酵3～5 d時，甜菊糖苷在一定范圍內(nèi)適當(dāng)提高，發(fā)酵液中氨基酸態(tài)氮含量有所提高，具體原因尚待進(jìn)一步分析。發(fā)酵后期，各組間氨基酸態(tài)氮含量變化相差不大。

圖3中(3)為甜菊糖苷在不同添加量時菊芋中亞硝酸鹽含量隨時間的變化曲線。由圖3中(3)可知，亞硝酸鹽含量在發(fā)酵1 d時最高，此后降低。在發(fā)酵前期，與不添加甜菊糖苷組相比，添加甜菊糖苷組亞硝酸鹽含量略低于非添加組，發(fā)酵后期各組間亞硝酸鹽含量與甜菊糖苷添加量無明顯劑量關(guān)系。

2.4 加鹽量對發(fā)酵的影響

乳酸乳球菌LL、嗜酸乳桿菌LA混合種液按接種量20 g/kg接入裝有菊芋和香辛料混合液的泡菜壇中，加入白砂糖20 g/kg，甜菊糖苷0.15 g/kg，室溫25 ℃發(fā)酵?？疾禧}添加量分別在10，30，50，70，90 g/kg時對乳酸菌發(fā)酵菊芋的影響。不同鹽添加量對菊芋泡菜發(fā)酵的影響見圖4。

圖4 不同鹽添加量發(fā)酵菊芋時各指標(biāo)的變化Fig.4 Changes of various indexes in the fermentation of Jerusalem artichoke with different salt additive amount

由圖4中(1)可知，鹽的添加量對乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)酸速度的影響較大。其中加鹽量在10～30 g/kg時，總酸含量(以乳酸計)在發(fā)酵前3 d增長較快，發(fā)酵5 d后不再明顯變化。隨著加鹽量的增加，發(fā)酵液中總酸含量增長速度變慢，加鹽量越大，抑制作用越強。當(dāng)加鹽量達(dá)到90 g/L時，對乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)酸具有明顯抑制作用，接種發(fā)酵5 d后，總酸含量才開始明顯增加。不同鹽添加量時，發(fā)酵液中氨基酸態(tài)氮含量隨時間的變化情況見圖4中(2)。由圖4中(2)可知，發(fā)酵液中氨基酸態(tài)氮含量在發(fā)酵前3 d增長較快，其后逐漸趨于穩(wěn)定。與低濃度加鹽量相比，加鹽量為70～90 g/kg時，發(fā)酵前期高鹽濃度對氨基酸態(tài)氮的形成或溶出有一定抑制作用。發(fā)酵5 d后，各組間差距減少。不同鹽添加量時，菊芋片中亞硝酸鹽含量隨時間的變化情況見圖4中(3)。由圖4中(3)可知，鹽含量較低(≤10 g/kg)時，發(fā)酵菊芋的亞硝酸鹽含量在發(fā)酵1 d時相對較高；鹽含量增加，發(fā)酵菊芋3 d時亞硝酸鹽含量相對較高，發(fā)酵過程中無明顯亞硝酸鹽峰值。

從不同因素對嗜酸乳桿菌LA、乳酸乳球菌LL混合發(fā)酵菊芋的影響方面分析，影響各指標(biāo)變化的主要因素為加鹽量和發(fā)酵時間。其中，不同加鹽量對發(fā)酵菊芋總酸含量變化有顯著差異，直接影響著產(chǎn)酸速度。采用低鹽發(fā)酵能使菊芋泡菜在較短時間達(dá)到理想酸度。發(fā)酵菊芋的總酸含量、氨基酸態(tài)氮含量、亞硝酸鹽含量直接與發(fā)酵時間相關(guān)，在一定時間范圍內(nèi)，總酸含量、氨基酸態(tài)氮含量隨發(fā)酵時間延長而增加至一定峰值后不再明顯變化，或略有下降。亞硝酸還原酶和酸性環(huán)境(pH<4.0)是發(fā)酵蔬菜中亞硝酸鹽降解的主要原因，此外，乳酸菌產(chǎn)生的細(xì)菌素也在其中起著重要作用[12]。采用具有抑菌活性的嗜酸乳桿菌和乳酸乳球菌混合發(fā)酵菊芋，通過測定也表明采用抗菌性乳酸菌發(fā)酵，能使發(fā)酵酸度較快地達(dá)到理想酸度，而亞硝酸鹽含量在發(fā)酵過程中無明顯高峰。抑菌乳酸菌主要對發(fā)酵蔬菜中的腸桿菌等有害菌有抑制作用，從而降低了發(fā)酵過程中的亞硝酸鹽含量。

3 結(jié)論

乳酸菌發(fā)酵菊芋的總酸含量主要與時間、接種量和加鹽量有關(guān)。無鹽添加時，隨時間延長，總酸含量增加，發(fā)酵5 d后總酸含量趨于穩(wěn)定；接種量大時，總酸含量增長更快。加鹽發(fā)酵時，鹽濃度明顯影響產(chǎn)酸速度，鹽濃度越高，產(chǎn)酸速度越慢，鹽濃度在90 g/kg以上時，對總酸的增長有明顯抑制作用。

適當(dāng)提高接種量，有利于發(fā)酵前期氨基酸態(tài)氮含量的增加，發(fā)酵5 d后，氨基酸態(tài)氮含量不再明顯增加，或略有下降。

發(fā)酵菊芋中亞硝酸鹽含量變化主要與時間有關(guān)，亞硝酸鹽在發(fā)酵前3 d相對較高，發(fā)酵3 d后無明顯亞硝酸鹽高峰，采用嗜酸乳桿菌、乳酸乳球菌混合發(fā)酵菊芋能明顯抑制亞硝酸鹽峰值的形成。