外源酶對(duì)夏秋紅茶主要品質(zhì)成分影響研究

林劍峰，白建陽，吳理文 ，張海華

（1.松陽縣科學(xué)技術(shù)局，浙江松陽 323400；2.松陽縣建陽茶葉有限公司，浙江松陽 323400；3.浙江正德和食品有限公司，浙江松陽 323400；4.中華全國供銷合作總社杭州茶葉研究院，浙江杭州 310016）

茶葉是我國重要的農(nóng)產(chǎn)品，近十年，我國茶產(chǎn)業(yè)規(guī)模（產(chǎn)量、面積、農(nóng)業(yè)產(chǎn)值）穩(wěn)居世界首位，茶葉產(chǎn)量從134 萬噸增長至279 萬噸， 茶園面積從186 萬公頃增長至306 萬公頃， 農(nóng)業(yè)產(chǎn)值從413億元增長至2396 億元[1-2]，發(fā)展勢(shì)頭良好。 另一方面， 茶資源供過于求的差距不斷增大， 主要表現(xiàn)在：干毛茶供過于求差額達(dá)30 余萬噸，占比50%以上的夏秋茶的利用率低、棄采嚴(yán)重，加之茶園荒棄等現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生，導(dǎo)致茶葉、茶花、茶籽（果）、茶枝條等能用卻未用資源總量逾400 萬噸。 中國茶產(chǎn)業(yè)總體表現(xiàn)出茶資源供過于求的差距不斷增大的趨勢(shì)、質(zhì)量效益亟待提高的突出瓶頸[3-5]。 基于此， 文章著重開展外源酶對(duì)以夏秋茶鮮葉為原料加工的紅茶的品質(zhì)影響研究，旨在探索利用閑置、棄采夏秋茶資源， 希望通過外源酶調(diào)控小葉種紅茶品質(zhì)。

以小葉種茶樹鮮葉為原料加工制作紅茶的工藝及產(chǎn)品已相當(dāng)成熟，如浙江杭州市的九曲紅梅、觀音紅等[6-8]?，F(xiàn)有這類產(chǎn)品多采用春季茶鮮葉，而對(duì)小葉種茶樹的夏秋季鮮葉加工制作紅茶的加工技術(shù)和產(chǎn)品尚顯不足。少量研究報(bào)道表明，外源添加食品酶制劑能夠改善茶葉加工或深加工的效果。目前相關(guān)研究主要集中在兩方面：一是將外源酶用于茶葉深加工（速溶茶、茶飲料）的前處理，主要有單寧酶、纖維素酶、蛋白酶和果膠酶，能夠增加浸出物含量，提高速溶茶的冷溶性，進(jìn)而改善速溶茶或茶飲料的品質(zhì)[9-11]；二是將外源酶用于紅茶加工中，在發(fā)酵時(shí)添加外源酶（單寧酶、纖維素酶和多酚氧化酶），能夠縮短發(fā)酵時(shí)間，改善紅茶品質(zhì)，如蘇祝成等[12]利用外源單寧酶改善了夏茶滋味品質(zhì)成分和組成、包先進(jìn)等[13]在磚茶加工中加入纖維素酶對(duì)微生物發(fā)酵進(jìn)行部分替代而促進(jìn)了磚茶品質(zhì)的形成。文章突破前人研究思路，以小葉種茶樹夏秋鮮葉為原料， 探索在紅茶揉捻工序加入外源酶， 研究外源酶對(duì)紅茶主要內(nèi)質(zhì)成分的影響，為紅茶品質(zhì)研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗(yàn)材料為2016 年9 月采自浙江松陽縣赤壽鄉(xiāng)婁塘村茶園白葉1 號(hào)茶樹品種一芽一二葉。

纖維素酶（EC3.2.1.4，20000 U/mL）：諾維信生物技術(shù)有限公司 （中國上海）； 木瓜蛋白酶（EC 3.4.22.2，50000 U/g）：廣西南寧東恒華道生物科技有限公司；單寧酶（EC 3.1.1.20，500 U/g）：江西百盈生物科技有限公司。兒茶素標(biāo)品：上海源葉生物科技有限公司；茶黃素標(biāo)品：Sigma-Aldrich 有限公司；乙腈（色譜純）、蒽酮、乙醇等化學(xué)分析試劑：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

YF-6CWD-6 型紅茶萎凋槽： 安溪縣永鋒機(jī)械有限公司；6CSW-100 搖青機(jī)、6CR-35 茶葉揉捻機(jī)：浙江上洋機(jī)械有限公司；干燥箱：上海印溪儀器儀表有限公司。 ME4001 型電子天平： 梅特勒-托利儀器有限公司；DK-S26 型電熱恒溫水浴鍋、HG-9146A 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；1525 型高效液相色譜儀：美國 Waters 公 司 ；5424R 型 高 速 離 心 機(jī) ： 德 國Eppendorf 公司；UV-2102PC 型紫外分光光度計(jì)：上海尤尼柯儀器有限公司；LRH-70 型生化培養(yǎng)箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

1.3 加工實(shí)驗(yàn)方法

紅茶加工技術(shù)路線為萎凋、揉捻、發(fā)酵、干燥、提香，在揉捻過程中加入食品酶制劑。

加工流程為將當(dāng)日采摘的夏秋鮮葉均勻攤放于萎凋槽中，攤?cè)~厚度15 cm，環(huán)境溫度30 ℃、環(huán)境濕度80%～86%下自然萎凋21 h，獲得適宜揉捻的萎凋葉。 取等量2 kg 萎凋葉進(jìn)行揉捻和發(fā)酵試驗(yàn)， 設(shè)置揉捻和發(fā)酵實(shí)驗(yàn)條件為環(huán)境溫度25 ℃、環(huán)境濕度88%，輕壓揉捻（20 min）→中壓揉捻（60 min）→發(fā)酵（28 ℃，8 h）。 酶制劑添加量實(shí)驗(yàn)安排見表1。 干燥和提香參數(shù)根據(jù)實(shí)際生產(chǎn)經(jīng)驗(yàn)，確定干燥參數(shù)先 110 ℃、55 min， 再 70 ℃、120 min，提香參數(shù) 120 ℃、35 min。

表1 外源酶應(yīng)用實(shí)驗(yàn)安排Table 1 Test design of the addition of exogenous enzymes

1.4 紅茶品質(zhì)分析方法

對(duì)紅茶樣品進(jìn)行品質(zhì)成分分析， 主要分析水浸出物、茶多酚、可溶性糖、咖啡堿、兒茶素、茶黃素、茶氨酸的含量，以此探討外源酶對(duì)紅茶內(nèi)質(zhì)成分的影響。 含水率的測(cè)定參照GB/T 8304—2013《茶 水分測(cè)定》； 水浸出物的測(cè)定參照 GB/T 8305—2013《茶 水浸出物含量測(cè)定》；咖啡堿含量的測(cè)定參照GB/T 8312—2013《茶 咖啡堿測(cè)定》；茶多酚和兒茶素含量測(cè)定參照GB/T 8313—2018《茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測(cè)方法》；茶氨酸含量測(cè)定參照GB/T 23193—2017《茶葉中茶氨酸的測(cè)定 高效液相色譜法》；茶黃素含量測(cè)定參照GB/T 30483—2013 《茶葉中茶黃素的測(cè)定高效液相色譜法》； 可溶性糖測(cè)定采用蒽酮-硫酸比色法[14]。

1.5 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)處理和圖表繪制采用WPS OFFICE EXCEL 2007。 每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，最終數(shù)據(jù)取平均值表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 水浸出物含量

從圖1 可以看出， 加酶樣品的水浸出物含量均高于對(duì)照樣， 說明加酶能夠增加茶葉的水浸出物含量， 以及酶將茶葉中水不溶性組分經(jīng)酶解作用實(shí)現(xiàn)部分可溶。 對(duì)樣品進(jìn)行排序：對(duì)照＜單寧酶01#＜單寧酶02#＜單寧酶03#＜蛋白酶03#＜蛋白酶01#＜蛋白酶+單寧酶＜纖維素酶01#＜蛋白酶02#＜纖維素酶02#＜纖維素酶03#＜蛋白酶+纖維酶＜三種酶混合＜單寧酶+纖維酶。從排序結(jié)果來看，就三種酶單獨(dú)使用而言， 纖維素酶對(duì)于紅茶水浸出物含量的增加效果最好，其次是蛋白酶，最后是單寧酶，這與三種酶的自身特性和底物含量有關(guān)；就兩兩組合酶來說，單寧酶+纖維素酶最好，其次是蛋白酶+纖維素酶，最后是蛋白酶+單寧酶，且所測(cè)值高于單酶，說明雙酶間有協(xié)同增效作用。當(dāng)三種酶同時(shí)應(yīng)用時(shí)，其效果并未特別突出，與蛋白酶+纖維素酶、單寧酶+纖維素酶、纖維素03#相當(dāng)。

圖1 紅茶樣水浸出物含量Fig.1 Water extract content of black tea samples

2.2 可溶性糖含量

從圖2 可知， 加酶可以顯著增加紅茶中可溶性糖含量， 增加幅度最低者蛋白酶02# 增加了59%， 增加幅度最高者纖維素酶 01# 增加了193%，這一結(jié)果從內(nèi)質(zhì)上支撐了紅茶滋味甜度的提高。對(duì)比加酶樣品，纖維素酶參與的樣品可溶性糖含量高，其次是單寧酶，最后是蛋白酶。 從雙酶樣品結(jié)果可知蛋白酶和單寧酶組合具有協(xié)同增效作用，而與纖維素酶組合呈降效作用。

2.3 多酚總量

多酚是茶葉中非常重要的品質(zhì)成分， 是多酚氧化酶作用的底物， 其氧化產(chǎn)物是紅茶中重要的內(nèi)質(zhì)成分茶紅素、茶黃素等。 如圖2 所示，實(shí)驗(yàn)樣品的多酚總量主要介于11.12～17.46 g/100 g。與對(duì)照樣相比，除單寧酶01# 外，其余加酶樣品中多酚總量都高于對(duì)照樣。結(jié)合雙酶結(jié)果推斷，就單酶使用而言蛋白酶對(duì)于增加多酚總量作用最大， 就雙酶使用而言蛋白酶和纖維素酶具有協(xié)同增效作用。

2.4 咖啡堿含量

如圖2， 加酶后樣品中咖啡堿含量與對(duì)照相當(dāng)，分布在4.64～5.70 g/100 g 之間，說明加酶對(duì)紅茶中咖啡堿的含量影響不大， 進(jìn)一步推測(cè)茶葉中咖啡堿的存在受水不溶蛋白和纖維素等大分子影響較小， 或是與蛋白或纖維素之間結(jié)合態(tài)少的緣故。

圖2 紅茶樣茶多酚、可溶性糖和咖啡堿含量Fig.2 Content of tea polyphenols, suluble sugar and caffeine in black tea samples

2.5 茶氨酸含量

紅茶樣品中的茶氨酸含量分布在0.35～0.60 g/100 g 之間，加酶后樣品中纖維素酶01# 與對(duì)照相當(dāng)，其余樣品茶氨酸含量均低于對(duì)照，且酶用量最大者降幅也最大，見圖3。 可能是因?yàn)槊附庾饔么蚱屏瞬枞~細(xì)胞系統(tǒng)中物質(zhì)間固有的平衡， 使得L-茶氨酸暴露或游離出來，光照下引起不穩(wěn)定[15]。

2.6 茶黃素含量

茶黃素由多酚類及其衍生物氧化縮合而來，主要是由兒茶素中的 （-） 表沒食子兒茶素 （LEGC） 與 （-） 表沒食子兒茶素沒食子酸酯 （LEGCG） 縮合而成，TF-3-G （茶黃素-3-沒食子酸酯）、TF-3'-G（茶黃素-3'-沒食子酸酯）、TFDG（茶黃素-3,3-雙沒食子酸酯）和TF（茶黃素）是常見的可檢測(cè)的茶黃素單體。 紅茶中茶黃素類的含量一般為0.3%～1.5%，對(duì)紅茶品質(zhì)起著決定性作用。所有實(shí)驗(yàn)樣中（圖4），以單寧酶+纖維素酶樣品的茶黃素總量最高為1.54 g/100 g，以單寧酶01# 最低0.53 g/100 g。 實(shí)驗(yàn)樣品的茶黃素含量排序?yàn)椋簡螌幟?01#＜單寧酶 02#＜蛋白酶 02#＜蛋白酶01#＜單寧酶03#＜對(duì)照＜蛋白酶+單寧酶＜蛋白酶03#＜三種酶混合＜纖維素酶03#＜纖維素酶01#＜纖維素酶02#＜蛋白酶+纖維酶＜單寧酶+纖維酶。三種酶中纖維素酶對(duì)茶黃素具有增效作用， 單寧酶作用后茶黃素含量比對(duì)照低。 無論是蛋白酶還是單寧酶與纖維素組合，都表現(xiàn)出增效作用。

2.7 兒茶素含量

兒茶素是茶鮮葉中的特征性成分， 紅茶發(fā)酵工序?qū)翰杷赝ㄟ^非微生物作用的聚合、氧化、異構(gòu)化等反應(yīng)轉(zhuǎn)化為茶黃素或茶紅素等。 圖5，加酶后兒茶素總量都提高了60%以上， 加酶樣品中兒茶素總量最高者為單寧酶01# 和單寧酶+纖維素酶、最低者為三種酶混合樣品。 就單酶而言，從提高程度上排序?yàn)槔w維素酶＞蛋白酶＞單寧酶。 無論蛋白酶還是單寧酶與纖維素酶組合使用， 提高幅度均不及纖維素酶或蛋白酶單獨(dú)使用。

圖3 紅茶樣茶氨酸含量Fig. 3 Content of theanine in black tea samples

圖4 紅茶樣中茶黃素含量Fig.4 Content of theaflavins in black tea samples

3 討論

縱觀上述紅茶的水浸出物、 茶多酚、 可溶性糖、咖啡堿、兒茶素、茶黃素、茶氨酸含量7 個(gè)主要品質(zhì)指標(biāo)的變化，結(jié)合表2 木瓜蛋白酶、纖維素酶和單寧酶的作用機(jī)理和應(yīng)用效果分析：（1）單寧酶通過水解多酚類化合物中酯鍵和縮酚酸鍵實(shí)現(xiàn)對(duì)茶葉中茶多酚、兒茶素總量及單體、茶黃素總量及單體的動(dòng)態(tài)調(diào)控。 研究認(rèn)為單寧酶能夠增加茶梗提取液中兒茶素的總量[16]，且公認(rèn)單寧酶能夠轉(zhuǎn)溶“茶乳酪”（多酚類、咖啡堿、蛋白質(zhì)等物質(zhì)通過分子間氫鍵與疏水作用絡(luò)合而成），即通過水解切斷兒茶素復(fù)合物中的酯鍵， 解離出的沒食子酸又能與茶紅素、茶黃素競爭咖啡堿，形成分子量較小的水溶物，從而降低茶湯渾濁度[17]，F(xiàn)UKUDA 等[18]研究也認(rèn)為單寧酶處理綠茶提取物能夠提高非聚合型兒茶素類濃度。綜合分析，認(rèn)為在茶葉加工中使用單寧酶一方面可降解兒茶素復(fù)合體 （天然結(jié)合態(tài)茶多酚，加工中形成的茶乳酪等），另一方面對(duì)于兒茶素縮合產(chǎn)物的生成亦有一定影響。 夏秋鮮葉中因多酚、氨基酸等滋味物質(zhì)比例不協(xié)調(diào)，常出現(xiàn)苦澀味， 而單寧酶通過水解作用可動(dòng)態(tài)調(diào)控多酚類（茶多酚、兒茶素、茶黃素）的轉(zhuǎn)化，進(jìn)而改變呈味物質(zhì)的比例[19]。 （2）蛋白酶主要是對(duì)茶葉中的蛋白質(zhì)進(jìn)行水解作用， 茶葉中蛋白質(zhì)含量一般在20%左右且多是水不溶蛋白， 蛋白酶對(duì)茶葉蛋白進(jìn)行水解，產(chǎn)生肽段和部分氨基酸，增加了紅茶的水浸出物含量，同時(shí)釋放了多酚-蛋白復(fù)合物中的多酚類物質(zhì)[20]，進(jìn)而增加了紅茶中多酚類物質(zhì)的含量，前人研究也發(fā)現(xiàn)在紅碎茶加工、紅茶發(fā)酵中添加蛋白酶， 均能夠增加茶黃素和氨基酸的含量，且此時(shí)多酚氧化酶活性可提高一倍，有效縮短發(fā)酵時(shí)間[21-23]。同時(shí)蛋白酶水解產(chǎn)生的肽段及氨基酸類具有呈味作用[24]，從而能夠改變紅茶的呈味物質(zhì)組成及比例，最終影響紅茶茶湯的滋味。 （3）纖維素酶能夠水解茶葉細(xì)胞壁物質(zhì)，更快、更多的釋放細(xì)胞質(zhì)， 這為茶葉中固有的多酚氧化酶提供了更多的底物和酶促機(jī)會(huì)， 因此表現(xiàn)出添加纖維素酶的紅茶的多項(xiàng)品質(zhì)指標(biāo)都有增高現(xiàn)象。

圖5 紅茶樣中兒茶素含量Fig.5 Content of catechins in black tea samples

表2 外源酶在茶葉加工中的作用機(jī)理[25]Table 2 Mechanism of exogenous enzymes in tea processing[25]

總體而言， 添加蛋白酶對(duì)于紅茶主要內(nèi)質(zhì)成分的增加具有較好的作用， 因此蛋白酶可優(yōu)選為紅茶加工用外源酶。纖維素酶，對(duì)于紅茶內(nèi)質(zhì)也有增加作用， 但是鑒于纖維素酶對(duì)細(xì)胞壁的水解作用，實(shí)驗(yàn)中肉眼可見易出現(xiàn)葉張不完整、外形和葉底不勻、茶湯有葉渣等現(xiàn)象，這對(duì)纖維素酶的實(shí)際應(yīng)用有所影響。