基于電子鼻和HPLC分析蜂房哈夫尼菌對海參腐敗的影響

姚 巧 麗， 張 公 亮， 畢 景 然， 高 美 玲， 侯 紅 漫

( 大連工業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院, 遼寧 大連 116034 )

0 引 言

近年來，即食海參越來越受到消費(fèi)者的歡迎，其需求量增加的同時(shí)，問題也隨之而來，主要集中于即食海參的腐敗變質(zhì)現(xiàn)象[1]。加工過程中滅菌不夠徹底、耐冷嗜冷腐敗細(xì)菌的入侵是導(dǎo)致即食海參腐敗變質(zhì)的主要原因[2]。即食海參受微生物侵染后，不但影響感官品質(zhì)，降低食用價(jià)值，甚至可能嚴(yán)重影響人類健康。

蜂房哈夫尼菌(Hafniaalvei)是一種革蘭氏陰性菌，存在于自然界，可從乳制品、肉制品和水產(chǎn)品中分離得到[4]。蜂房哈夫尼菌能夠在低溫環(huán)境中生長，是導(dǎo)致冷藏食品變質(zhì)的主要腐敗菌之一[5]。Nychas等[6]研究發(fā)現(xiàn)一些耐冷的腸桿菌，如蜂房哈夫尼夫菌、成團(tuán)腸桿菌和變形斑沙雷菌等，能夠引起肉及肉類制品腐敗變質(zhì)。李婷婷等[7]研究了希瓦氏菌和蜂房哈夫尼菌共生培養(yǎng)對冷藏大菱鲆的致腐能力，發(fā)現(xiàn)兩者共同作用時(shí)腐敗效果更為顯著。

本實(shí)驗(yàn)室從腐敗即食海參多種優(yōu)勢腐敗菌，通過對其生理生化特性的鑒定分析，認(rèn)定其中一株為蜂房哈夫尼菌屬。由于目前關(guān)于蜂房哈夫尼菌對即食海參致腐能力的研究不多，故本實(shí)驗(yàn)通過蜂房哈夫尼菌的回接實(shí)驗(yàn)，觀察海參源蜂房哈夫尼菌致腐特性，研究了該菌的生長情況，接菌前后海參氣味變化和海參產(chǎn)生物胺的情況，初步探索蜂房哈夫尼菌對即食海參的腐敗作用，以期為后續(xù)的研究提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材 料

即食海參，冷凍保藏；蜂房哈夫尼菌(HafniaalveiH4)，實(shí)驗(yàn)室保藏，分離自腐敗即食海參。

L-賴氨酸鹽酸鹽、L-組氨酸單鹽酸鹽-水合物、L-酪氨酸二鈉鹽水合物、L-鳥氨酸鹽酸鹽、L-精氨酸鹽酸鹽、L-苯丙氨酸鹽酸鹽和L-色氨酸鹽酸鹽、丹磺酰氯，北京索萊寶科技有限公司；胰蛋白胨、瓊脂粉、氯化鈉、氧化鎂，均為國產(chǎn)分析純，1 mL無菌注射器、0.22 μm有機(jī)濾膜、0.22 μm 有機(jī)過濾器、色譜級乙腈。

1.2 儀器與設(shè)備

PEN3.5便攜式電子鼻，德國Airsense公司；1260高效液相色譜儀，安捷倫科技(中國)有限公司；Sorvall ST 16R高速冷凍離心機(jī)，賽默飛世爾科技(中國)有限公司；海能K9840自動凱氏定氮儀，濟(jì)南海能儀器股份有限公司。

1.3 方 法

1.3.1 菌落總數(shù)的測定

LB培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨10.0，酵母浸粉5.0，NaCl 10.0，pH (7.0±0.2)，121 ℃、15 min高溫濕熱滅菌備用。

海參基質(zhì)培養(yǎng)基：將解凍后的即食海參與超純水按照質(zhì)量比1∶19勻漿，110 ℃、15 min高溫濕熱滅菌，備用。

挑取單菌落于100 mL液體LB培養(yǎng)基中，30 ℃、150 r/min搖床過夜培養(yǎng)，作為種子菌液(濃度1×109CFU/mL)。采用平板計(jì)數(shù)法，根據(jù)GB 4789.2—2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)：菌落總數(shù)測定》進(jìn)行菌落總數(shù)的測定。

1.3.2 揮發(fā)性鹽基氮的測定

將解凍后的海參加入適量的超純水(質(zhì)量比2∶1)絞碎處理，每50 g分裝到250 mL錐形瓶中，110 ℃、15 min濕熱滅菌處理，待冷卻后，接種1 mL種子菌液，置于恒溫恒濕培養(yǎng)箱(30 ℃，濕度60%)中培養(yǎng)。每隔24 h用無菌鑰匙稱取(3.00±0.10) g，參照國家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.228—2016中的自動凱氏定氮法，對樣品進(jìn)行揮發(fā)性鹽基氮(TVB-N)的測定。

1.3.3 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的檢測

將冷凍即食海參解凍，切成小塊，每塊質(zhì)量(3.00±0.10) g，置于小平板中，110 ℃、15 min濕熱滅菌處理，待冷卻后，均勻淋灑100 μL 菌液，置于恒溫恒濕(30 ℃，濕度60%)培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，每隔1 d進(jìn)行一次電子鼻檢測，共5 d。采用Winmuster軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的采集與處理，主要分析方法有主成分分析(principal component analysis，PCA)、線性判別式分析(linear discriminant analysis，LDA)和負(fù)荷加載分析(Loadings)。

1.3.4 生物胺的定性和定量分析

1.3.4.1 脫羧酶實(shí)驗(yàn)

根據(jù)Chang等[8]方法稍有改動，以氨基酸脫羧酶培養(yǎng)基和普通LB培養(yǎng)基同時(shí)作為實(shí)驗(yàn)組，氨基酸脫羧酶培養(yǎng)基作為空白對照，將菌液按1∶100 接種到培養(yǎng)基中，30 ℃、150 r/min搖床培養(yǎng)，每隔24 h觀察顏色變化。

1.3.4.2 HPLC測定生物胺質(zhì)量分?jǐn)?shù)

樣品制備方法根據(jù)夏秀東等[9]的方法稍有改動：挑取單菌落于5 mL液體LB培養(yǎng)基中，30 ℃、150 r/min搖床培養(yǎng)，待培養(yǎng)基混濁，吸取100 μL菌液轉(zhuǎn)接于5 mL海參基質(zhì)培養(yǎng)基中，分別置于10、15、20、25、30和35 ℃下?lián)u床培養(yǎng)，每隔24 h進(jìn)行一次生物胺提取，提取液過3次0.22 μm 濾膜，除去雜質(zhì)，即可進(jìn)行HPLC分析。

HPLC條件：安捷倫ZORBAX SB-C18色譜柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)，體積流量1.0 mL/min，進(jìn)樣量25 μL，時(shí)長35 min，柱溫30 ℃，檢測波長254 nm，流動相為乙腈和水。0～5 min，乙腈體積分?jǐn)?shù)45%；5～20 min，乙腈體積分?jǐn)?shù)由45%提升至90%；20～30 min，乙腈體積分?jǐn)?shù)保持90%不變；30～33 min，乙腈體積分?jǐn)?shù)由90%降到45%；33～35 min，保持乙腈體積分?jǐn)?shù)45%不變。

1.4 數(shù)據(jù)分析

每個實(shí)驗(yàn)平行重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果使用SPSS 18.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)方差分析及多重比較，使用Origin 9.0進(jìn)行圖表繪制。

2 結(jié)果與討論

2.1 野生型蜂房哈夫尼菌在海參基質(zhì)中的生長

細(xì)菌的生長繁殖和代謝活動是引起水產(chǎn)品腐敗變質(zhì)的主要原因。如圖1所示，30 ℃下，蜂房哈夫尼菌在海參基質(zhì)培養(yǎng)基生長迅速，4 h菌落數(shù)可達(dá)6.27×106CFU/mL，此后生長趨于穩(wěn)定，12 h達(dá)到最高，為6.67×106CFU/mL，16 h開始降低，菌落數(shù)為6.42×106CFU/mL。說明蜂房哈夫尼菌能夠利用海參的營養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行生長繁殖。

圖1 海參基質(zhì)培養(yǎng)基中菌落數(shù)的變化Fig.1 Changes of colony number in sea cucumber medium

2.2 TVB-N質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化

TVB-N是評判水產(chǎn)品品質(zhì)的重要指標(biāo)，能在一定程度上說明水產(chǎn)品的腐敗進(jìn)程。圖2是海參基質(zhì)接種蜂房哈夫尼菌后，30 ℃培養(yǎng)條件下TVB-N質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化情況。由圖2可知，TVB-N質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨時(shí)間延長而增加，在120 h的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為(175.3±2.9) mg/kg，說明蜂房哈夫尼菌能夠引起海參的腐敗變質(zhì)。

圖2 30 ℃下?lián)]發(fā)性鹽基氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化Fig.2 Change of TVB-N content at 30 ℃

2.3 揮發(fā)性物質(zhì)的電子鼻分析

2.3.1 PCA方法分析

主成分分析是將多個指標(biāo)化為較少的幾個綜合指標(biāo)的一種統(tǒng)計(jì)方法[10]。圖3是采用PCA方法分析不同時(shí)間下海參塊的電子鼻響應(yīng)信息。由圖3可知，第1主成分貢獻(xiàn)率為96.25%，第2主成分貢獻(xiàn)率為2.88%，總貢獻(xiàn)率為99.13%。從圖3中可以看出，海參產(chǎn)生的揮發(fā)氣味隨時(shí)間變化而變化，且沒有重疊，區(qū)分度較好。1～2 d信號響應(yīng)值比較接近，說明海參揮發(fā)氣味較為接近，變化不明顯；3～5 d較前兩天信號響應(yīng)值區(qū)分明顯，說明揮發(fā)性氣味變化較大。PCA結(jié)果說明菌能夠在海參塊上生長作用，并且其代謝活動能夠引起海參品質(zhì)變化，產(chǎn)生多種揮發(fā)性物質(zhì)。

圖3 不同時(shí)間下海參塊的PCA分析Fig.3 PCA analysis of sea cucumber blocks at different time

2.3.2 LDA方法分析

線性判別式分析更加注重樣品在空間中的分布狀態(tài)及彼此之間的距離分析[9]。圖4是不同時(shí)間下海參塊電子鼻的LDA分析。圖4中判別式1(橫軸)貢獻(xiàn)率為97.01%，判別式2(縱軸)貢獻(xiàn)率為2.61%，兩個判別式總貢獻(xiàn)率為99.62%。從LDA分析看出，不同時(shí)間下海參塊之間存在差異，可由此區(qū)分不同新鮮程度的海參。

圖4 不同時(shí)間下海參塊的LDA分析Fig.4 LDA analysis of sea cucumber blocks at different time

2.3.3 Loadings方法分析

負(fù)荷加載分析表現(xiàn)的是10個傳感器響應(yīng)值的信息。若某一傳感器的響應(yīng)值接近于零(橫、縱坐標(biāo)對應(yīng)值接近于零)，則該傳感器的識別作用可以忽略；若某一傳感器的響應(yīng)值越偏離于零，則說明該傳感器的識別能力越強(qiáng)[15]。如圖5所示，主軸1貢獻(xiàn)率70.78%，主軸2貢獻(xiàn)率18.41%。1～10號傳感器分別代表10種揮發(fā)性物質(zhì)，其中2、6、7、8和9號信號響應(yīng)較強(qiáng)，分別對應(yīng)氮氧化合物、甲烷、硫化氫、乙醇和有機(jī)硫化物，這幾類物質(zhì)是水產(chǎn)品腐敗過程中的常見揮發(fā)性成分，由此可以說明蜂房哈夫尼菌能夠引起海參的腐敗變質(zhì)，影響其新鮮程度。

圖5 不同時(shí)間下海參塊的Loadings分析Fig.5 Loadings analysis of sea cucumber blocks at different time

2.4 生物胺的定性和定量分析

2.4.1 脫羧酶實(shí)驗(yàn)

由圖6可知，添加了各氨基酸前體的培養(yǎng)基在接種蜂房哈夫尼菌種子液之后，腐胺和尸胺在24 h之內(nèi)產(chǎn)生陽性反應(yīng)(紫色)，說明該菌具備代謝鳥氨酸和賴氨酸的能力；另外幾種氨基酸在96 h內(nèi)也相繼產(chǎn)生陽性反應(yīng)，但較腐胺和尸胺稍弱。

a，LB培養(yǎng)基；b，脫羧酶培養(yǎng)基對照；c，脫羧酶培養(yǎng)基圖6 脫羧酶實(shí)驗(yàn)Fig.6 Experiments of decarboxylase

2.4.2 HPLC定量測定海參基質(zhì)中的生物胺

表1為HPLC測定蜂房哈夫尼菌在海參基質(zhì)中分別在培養(yǎng)溫度10、15、20、25、30、35 ℃和培養(yǎng)時(shí)間24、48、72、96 h下產(chǎn)生生物胺的種類和質(zhì)量分?jǐn)?shù)。由表1可知，在24 h各個溫度下和48 h的10、15和20 ℃下均未檢出色胺，此后48 h在25、30和35 ℃，以及72和96 h的各個溫度下均有色胺檢出，且各溫度下色胺質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨時(shí)間延長而增加。

表1 HPLC分析海參基質(zhì)中生物胺的質(zhì)量分?jǐn)?shù)Tab.1 Analysis of biogenic amines in sea cucumber medium by HPLC

10 ℃下腐胺產(chǎn)量隨時(shí)間延長稍有增加，96 h產(chǎn)量最高；25 ℃下，24 h產(chǎn)生腐胺質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，隨時(shí)間延長略有降低；其他各溫度下，腐胺質(zhì)量分?jǐn)?shù)在72 h達(dá)到頂峰。低溫下蜂房哈夫尼菌的生長速度受到影響，故在10 ℃下生物胺產(chǎn)量較少，僅為同時(shí)間內(nèi)生物胺總量的13%左右；25 ℃下生物胺產(chǎn)量較高，占同時(shí)間內(nèi)生物胺總量的23%左右。由此可初步認(rèn)定25 ℃是蜂房哈夫尼菌在海參基質(zhì)中產(chǎn)生物胺的最適溫度。

3 結(jié) 論

蜂房哈夫尼菌在30 ℃下能夠利用海參基質(zhì)中的營養(yǎng)成分進(jìn)行生長繁殖，12 h菌落總數(shù)最高可達(dá)6.67×106CFU/mL。在電子鼻分析中，接種該菌之后的5 d時(shí)間內(nèi)，其生長代謝產(chǎn)生了硫化氫和氮氧化合物等揮發(fā)性物質(zhì)，第5天TVB-N質(zhì)量分?jǐn)?shù)為(175.3±2.9) mg/kg，質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨時(shí)間延長而增加。脫羧酶實(shí)驗(yàn)表明，在添加各氨基酸前體物質(zhì)的前提下，蜂房哈夫尼菌可代謝7種氨基酸，生成相應(yīng)的胺類物質(zhì)，其中以腐胺和尸胺最為顯著。HPLC分析可知，該菌在海參基質(zhì)中代謝可產(chǎn)生較多的腐胺。脫羧酶實(shí)驗(yàn)和HPLC定量實(shí)驗(yàn)中，由于培養(yǎng)基質(zhì)不同，產(chǎn)生的生物胺種類略有不同，但兩者都說明蜂房哈夫尼菌能夠代謝鳥氨酸，生成腐胺。結(jié)果表明，蜂房哈夫尼菌具有一定的致腐作用，會造成水產(chǎn)品的營養(yǎng)流失和腐敗變質(zhì)，不利于人類健康和食用。