健脾補腎法對肺癌化療小鼠RAS、Bcl-2、FLIP、IL-2、NK 水平的影響

鄭春素

（福建中醫(yī)藥大學中醫(yī)學院，福建 福州350122）

肺癌是發(fā)病率和病死率增長最快的惡性腫瘤之一，嚴重威脅人類的健康和生命。 近50 年來，許多國家報道肺癌的發(fā)病率和病死率均明顯增高，占所有惡性腫瘤的第1 位［1］。 因肺的解剖位置較特殊，肺門血管、支氣管結(jié)構(gòu)復(fù)雜，加之肺癌早期診斷較為困難，85%～90%的患者就診時已是中、 晚期，失去了手術(shù)機會，且預(yù)后較差，總體5 年生存率只有15%左右。 在我國約70%～80%的肺癌患者接受化療，但抗癌藥物所致的不良反應(yīng)限制了癌癥治療的最佳用藥［2］。 健脾補腎法在肺癌化療過程中具有一定的療效，本項目通過健脾補腎藥物對肺癌小鼠模型的干預(yù)，觀察腎素血管緊張素（renin-angiotensin system，RAS）、B 淋巴細胞瘤-2 基因（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）、轉(zhuǎn)換酶抑制蛋白（inhibitory protein，F(xiàn)LIP）、白細胞介素-2（Interleukin-2，IL-2）、自然殺傷細胞（natural killer cell，NK）等指標的變化，以期從健脾補腎法對RAS 調(diào)節(jié)機制的影響探討健脾補腎法的作用，為中西醫(yī)結(jié)合治療肺癌提供實驗數(shù)據(jù)。

1 實驗材料

1.1 實驗動物及細胞 50 只雄性6～8 周SPF 級C57BL ／ 6 純系小鼠，體質(zhì)量（20±2）g，由福建中醫(yī)藥大學實驗動物中心代購，動物合格證號：SCXK（閩）2019-089。 小鼠Lewis 肺癌細胞株購于江蘇凱基生物細胞庫。

1.2 實驗藥物 健脾補腎法藥物組成：人參15 g，黨參15 g，白術(shù)12 g，黃芪15 g，淮山藥10 g，枸杞15 g，首烏15 g，肉蓯蓉12 g，熟地黃12 g，山萸肉12 g。 由福建中醫(yī)藥大學附屬第三人民醫(yī)院提供，藥物煎煮2 次，分別加10 倍、8 倍的水煎煮60、40 min，合并煎煮液，過濾后，濃縮至含生藥量1.0 g ／mL，置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩ｍ樸K注射液（上海上藥信誼藥廠有限公司公司，批號：20183341）。

1.3 實驗試劑 小鼠NK 細胞試劑盒、小鼠IL-2 ELISA 試 劑 盒、RAS 抗 體 試 劑 盒、Bcl -2 抗 體 試劑盒、FLIP 抗體試劑盒（美國Affinity 公司，批號：E00097-203，202003251，84v2118，11o9905，43d3773）。

2 實驗方法

2.1 分組與造模 將50 只小鼠常規(guī)飼養(yǎng)1 周后，隨機分為正常組10 只和造模組40 只。 造模組小鼠適應(yīng)喂養(yǎng)1 周后，將小鼠Lewis 肺癌細胞以8×105個／ 只注射到小鼠腋窩皮下成瘤［1］，取其瘤體組織，剪碎后加入適量生理鹽水，用玻璃研磨器制備成細胞懸濁液，200 目鋼網(wǎng)過濾，取過濾后的細胞懸濁液予臺盼藍染色計數(shù)， 調(diào)節(jié)細胞懸濁液濃度為1×107個／ mL，然后將懸液接種于小鼠右下腋窩皮下，每只0.1 mL，所有操作均在無菌條件下進行。

2.2 給藥 將造模組隨機分成模型組、中藥組、化療組、綜合組，每組10 只。 化療組予順鉑進行化療，隔日給藥，共給藥3 次，即第1、3、5 天給藥，計算小鼠順鉑的等效劑t 為4.8 mg ／ （kg·d），順鉑注射液1 mg ／ mL，平均每只小鼠腹腔注射劑量為0.1 mL ／（mg·d）（含DDP 0.1 mg）；腹腔注射化療同時，予生理鹽水0.4 mL ／ （只·d）灌胃。 參考周氏［3］等計算方法，根據(jù)人和小鼠體表面積折合法，中藥組予補脾益腎法藥液按0.4 g ／ （kg·d）灌胃；同時于 第l、3、5天，予0.9%生理鹽水0.l mL ／ （只·d）進行腹腔注射。 綜合組予順鉑化療聯(lián)合中藥藥液灌胃，給藥劑量、方法同化療組和中藥組。 模型組和正常組給予0.9%生理鹽水0.4 mL ／ （只·d），灌胃，共連續(xù)灌胃12 d，于第1、3、5 天，予0.9%生理鹽水0.1 mL／（只·d）腹腔注射。 各組12 d 為1 個治療周期，共進行4 個治療周期。

2.3 取材 各組小鼠均造模成功后第13 天進行無菌取脾并制備脾細胞懸液。

2.4 觀察指標及方法

2.4.1 脾臟NK 細胞活性及IL-2 含量檢測 采用乳酸脫氫酶（LDH）釋放試驗檢測小鼠脾臟NK 細胞活性，采用雙抗體夾心ELISA 法檢測小鼠脾上清液中IL-2 的含量。

2.4.2 RAS、Bcl-2、FLIP 蛋白表達 采用Western Blot 法檢測小鼠RAS、Bcl-2、FLIP 的表達。

2.5 統(tǒng)計學方法 應(yīng)用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。 計量資料以（±s）表示，符合正態(tài)分布采用單因素方差分析，模型組與治療組間比較采用Dunnet 檢驗。

3 結(jié) 果

3.1 肺癌小鼠模型的建立 將Lewis 肺癌細胞懸液接種于小鼠腋窩皮下，接種7 天后，可見小鼠腋下明顯成瘤組織，病理觀察可見模型小鼠腫瘤細胞的細胞核大小及形態(tài)不一，腫瘤細胞呈圓形且有異常核分裂。 具體見圖1。

圖1 肺癌小鼠模型建立

3.2 5 組小鼠脾臟NK 細胞活性和IL-2 含量比較見表1。

表1 5 組小鼠脾臟NK 細胞活性和IL-2 含量比較（±s）pg ／ mL

表1 5 組小鼠脾臟NK 細胞活性和IL-2 含量比較（±s）pg ／ mL

注：與正常組比較，1） P＜0.05；與模型組比較，2） P＜0.05，3） P＜0.01。

組別正常組模型組化療組中藥組綜合組n 10 10 10 10 10 IL-2 28.31±3.43 9.79±2.561）15.61±3.411）2）18.31±3.171）3）21.96±3.361）3）NK 細胞活性4.54±0.96 5.48±1.151）5.37±0.49 5.02±1.091）2）4.94±0.091）2）

3.3 5 組小鼠RAS、Bcl-2、FLIP 蛋白比較 見圖2、表2。

圖2 5 組小鼠RAS、Bcl-2、FLIP 蛋白電泳圖

4 討 論

中醫(yī)古籍中并無肺癌一病名，根據(jù)肺癌的臨床表現(xiàn)，可將其歸屬于 “肺痿” 范疇。 肺癌的形成與正氣不足有著密切的關(guān)系，正氣虛損是腫瘤發(fā)生及轉(zhuǎn)移的主要原因。 此外，腫瘤化療藥物對腫瘤缺乏特異性的選擇作用，在殺傷腫瘤細胞的同時也損壞機體的正常組織和細胞，損傷人體的正氣，導致脾腎損傷，進一步加重疾病進展。 肺癌病位在肺，與脾腎兩虛關(guān)系最密切，健脾補腎法作為治療肺癌的基本治法，可以使氣血津液生化充足，陰陽平衡，同時寓有 “培土生金”“金水相生” 之意［4］。

表2 5 組小鼠RAS、Bcl-2、FLIP 蛋白相對表達量比較（±s）

表2 5 組小鼠RAS、Bcl-2、FLIP 蛋白相對表達量比較（±s）

注：與正常組比較，1） P＜0.05；與模型組比較，2） P＜0.05，3） P＜0.01。

FLIP 10.52±1.05 25.08±1.151）21.64±1.271）2）15.92±1.081）3）13.92±0.981）3）組別正常組模型組化療組中藥組綜合組RAS 0.52±0.03 0.86±0.061）0.73±0.051）2）0.68±0.041）3）0.63±0.041）3）Bcl-2 11.06±1.27 19.63±1.411）15.42±1.331）2）13.35±1.211）3）12.27±1.181）3）

大量的臨床及實驗研究證明健脾補腎中藥能夠提高機體的免疫功能，增強抵抗力，延長腫瘤患者的生存期，同時能保護骨髓造血機能，拮抗化療引起的周圍白細胞下降的現(xiàn)象，提高機體耐受化療的能力，為進一步提高腫瘤化療的作用創(chuàng)造了條件［5-7］。 RAS 與腫瘤關(guān)系密切，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)RAS、Bcl-2、FLIP 的表達水平與肺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，Bcl-2、FLIP 與RAS 呈顯著的正相關(guān)，IL-2 與RAS 呈顯著的負相關(guān)，NK 與RAS 沒有明顯的相關(guān)性［8-10］。 本研究結(jié)果顯示，中藥組、綜合組小鼠IL-2、NK、RAS、Bcl-2、FLIP 等指標均較 模型組明顯改善，推測健脾補腎法可能通過調(diào)節(jié)免疫功能降低Bcl-2、FLIP 水平，進而調(diào)節(jié)RAS。隨著研究的不斷深入，能否將RAS、Bcl-2、FLIP 等指標作為腫瘤藥物治療的靶點及依據(jù)，進而為中西醫(yī)結(jié)合治療肺癌進行一些有益的嘗試是需要我們不斷關(guān)注與探索。