羅非魚下腳料酶解制備降血糖肽的工藝研究

趙闊　王濤　陳艷　張紅建　鄒易　梁愛文　鄭聯(lián)合

摘 要：研究以羅非魚加工下腳料為原料制備降血糖肽的工藝。從5種常用蛋白酶（胃蛋白酶、胰蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶）中篩選出了堿性蛋白酶作為目標酶;之后通過單因素試驗和正交試驗對堿性蛋白酶水解工藝進行優(yōu)化，得到最適酶解條件：溫度50 ℃、加酶量1 000 U·g-1、pH9.5、底物濃度6%，此工藝條件下水解度和α-葡萄糖苷酶抑制率分別達到28.19%和30.12%。

關(guān)鍵字：羅非魚加工下腳料;降血糖肽;酶解;α-葡萄糖苷酶抑制率

Abstract：The experiment was carried out to study the preparation technology hypoglycemic peptide with tilapia heels as raw material by enzymatic hydrolysis. Firstly， studied the enzymolysis effect of five enzymes （pepsin， trypsin， alkaline protease， neutral protease， and papain） respectively on tilapia heels， and acreened the alkaline protease as target enzyme. Then optimization hydrolysis conditions were carried out through mono-factor and orthogonal experiments： temperature 50 ℃， the amount of enzyme 1 000 U·g-1， pH 9.5，substrate concentration 6%. Under this condition， the hydrolysis degree and α-glycosidase inhibition rate were 28.19% and 30.12%， respectively.

Key words：Tilapia heels; Antihypertensive peptides; Degree of hydrolysis;α-glycosidase inhibition rate

中圖分類號：TS254.9

糖尿?。―iabetes Mellitus，DM）是一種由于胰島素生物作用受損或分泌不足而引起血液中葡萄糖水平慢性增高為特征的代謝疾病，持續(xù)的高血糖和長期代謝紊亂會導致人體出現(xiàn)腎臟、眼睛、足部、神經(jīng)、心血管等組織器官受損的癥狀，嚴重時容易引發(fā)酮癥酸中毒、高血糖高滲性昏迷等急性并發(fā)癥。近年來，受生活水平提高、飲食結(jié)構(gòu)改變、生活節(jié)奏加快、體力勞動強度降低以及少動多坐的生活方式等諸多因素的影響，全球糖尿病發(fā)病率不僅增長迅速，發(fā)病人群也日趨年輕化[1-3]。最新數(shù)據(jù)顯示，我國是全球糖尿病患者人數(shù)最多的國家，患者人數(shù)1.14億，約占全球糖尿病人總數(shù)的33%[4]。糖尿病目前尚無根治方法，最有效的方式是靠飲食、運動和藥物聯(lián)合控制血糖水平。應(yīng)用最普遍、藥效最明顯的主要是胰島素、磺酰脲類和雙胍類降糖藥物，但存在一定副作用[5]。

降血糖肽是一類能降低血糖的多肽活性物質(zhì)，來源于食物蛋白，安全性高、無毒副作用，適合長期服用，除此之外，降血糖肽本身是一種多肽，具有較強的營養(yǎng)價值。無論在功能性食品還是在醫(yī)藥產(chǎn)品開發(fā)方面都具有廣泛的應(yīng)用前景[6-8]。

羅非魚（Tilapia）也稱福壽魚、非洲鯽魚，肉質(zhì)厚、潔白無刺、味道鮮美，是聯(lián)合國糧農(nóng)組織極力推薦養(yǎng)殖的優(yōu)良魚種，在國際市場很受歡迎。羅非魚加工主要是加工成魚片、魚條等，魚頭、尾、鰭、鱗、皮、內(nèi)臟、殘肉等淪為下腳料，總重量約占整魚的60%[9-10]，

目前僅有部分被加工成魚粉添加到飼料中，大部分被丟棄，造成蛋白資源的浪費。筆者曾以羅非魚下腳料為原料制備過降血壓肽[11]，本試驗開展酶解制備降血糖肽的工藝研究，并對工藝進行優(yōu)化，為羅非魚下腳料的高值化綜合利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

羅非魚下腳料：新鮮羅非魚洗凈后剔除魚肉，剩余物-20 ℃凍存，試驗時4 ℃解凍;α-葡萄糖苷酶、對硝基苯酚-α-D-吡喃葡萄糖苷（PNPG）：美國sigma公司;胃蛋白酶、胰蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶，南寧龐博生物工程有限公司;其他試劑均為分析純。

1.2 儀器

S-D200高效組織搗碎機，上海模具廠;UV-8000s紫外可見分光光度計，上海元析儀器有限責任公司;Sigma 3-30k高速冷凍離心機，上海譽鑫科技有限公司;HDK-6數(shù)顯恒溫磁力攪拌水浴鍋，常州德科儀器制造有限公司;RG-18磁力攪拌器，上?，斈醿x器設(shè)備有限公司;QDN-ll全自動凱氏定氮儀，杭州匯爾儀器設(shè)備有限公司;PB-10 pH計，德國賽多利斯科學儀器有限公司;SB5200DTD超聲波清洗機，寧波新藝生物科技有限公司;AY220電子天平，日本島津;UPN-11-10T超純水制造系統(tǒng)，四川優(yōu)普超純科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 蛋白酶水解羅非魚下腳料

將羅非魚下腳料剪成小塊，加水調(diào)節(jié)底物濃度，用高速組織搗碎機絞碎，調(diào)節(jié)所需pH，在設(shè)定溫度下加酶水解一定時間，沸水浴滅活10 min，冷卻后離心10 min，離心機轉(zhuǎn)速3 500 r·min-1，中間部分的澄清液即為羅非魚水解液。

1.3.2 蛋白酶的篩選

選取5種常用蛋白酶（堿性蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶），結(jié)合生產(chǎn)廠家提供的最適酶解條件（表1所示），調(diào)節(jié)水解反應(yīng)溫度和pH，分別對羅非魚下腳料進行水解，對比5種酶水解液的水解度和α-葡萄糖苷酶抑制率，篩選出最佳用酶。

1.3.3 酶解工藝優(yōu)化

選擇水解效果最佳的酶，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以溫度、加酶量、底物濃度和pH4個因素，開展L16（45）正交試驗，正交試驗表見表2。

1.3.4 水解度測定的方法

水解度（DH）指蛋白質(zhì)分子發(fā)生水解反應(yīng)后斷裂的肽鍵占蛋白質(zhì)分子中總肽鍵的比例，反映蛋白質(zhì)的水解程度。

（1）

式（1）中，氨基酸態(tài)氮（AAN）含量的測定參照GB 5009.235-2016中比色法;總氮含量的測定參照GB 5009.5-2016中凱氏定氮法。

1.3.5 α-葡萄糖苷酶抑制率測定方法[12-13]

取2 mg·mL-1蛋白酶水解液100 μL，加入0.16 U·mL-1

的α-葡萄葡萄葡萄糖苷酶溶液50 μL，于37 ℃水浴10 min后，加入2.5 mmol·L-1的底物PNPG（對硝基苯酚-α-D-吡喃葡萄糖苷）溶液50 μL，在溫度37 ℃條件下水浴15 min，隨后立即加入1 mol·L-1的Na2CO3溶液100 μL終止反應(yīng)，測定波長405 nm處的吸光度A1，另取100 μL磷酸鹽緩沖溶液代替酶解液，測定其吸光度A0，再測定只有酶解液反應(yīng)體系的吸光度A2，按式（2）計算抑制率：

（2）

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白酶的篩選

5種蛋白酶分別在各自最適酶解條件下水解處理羅非魚加工下腳料，水解度和α-葡萄糖苷酶抑制率分析結(jié)果見圖1。由圖1可見，5種蛋白酶中對羅非魚下腳料的水解能力較強的是胃蛋白酶和堿性蛋白酶，但胃蛋白酶水解液α-葡萄糖苷酶抑制率較低;胰蛋白酶水解能力相對較差，但水解液具有很強的α-葡萄糖苷酶抑制活性;木瓜蛋白酶和中性蛋白酶的水解度和α-葡萄糖苷酶抑制率都比較差。由此可以看出，蛋白酶水解能力強弱與水解產(chǎn)物α-葡萄葡萄糖苷酶抑制活性無線性關(guān)系，分析原因可能是受蛋白酶的作用方式和作用位點影響，不同蛋白酶處理后羅非魚下腳料水解液中蛋白多肽結(jié)構(gòu)和長短不同，對α-葡萄葡萄糖苷酶的抑制活性不同。據(jù)此，比較5種不同蛋白酶水解效果，綜合考慮水解度和α-葡萄葡萄糖苷酶抑制率兩個指標，確定選取堿性蛋白酶為目標用酶。

2.2 試驗條件優(yōu)化

前期單因素試驗結(jié)果表明：堿性蛋白酶水解羅非魚加工下腳料的最佳溫度為50 ℃，最佳加酶量為

10 000 U·g-1，最佳pH為9.5，最佳底物濃度為5%。據(jù)

此，以溫度、加酶量、pH和底物濃度4個因素，以水解度和α-葡萄糖苷酶抑制率為指標，開展正交試驗，試驗結(jié)果及數(shù)據(jù)分析見表3、表4。從正交試驗極差分析結(jié)果（表3）可知，影響水解度的因素主次順序為：A>C>D>B，最優(yōu)組合為A2B3C3D3，而影響抑制率的因素主次順序為C>A>B>D，最優(yōu)組合為A2B2C3D3。兩個組合的差別僅在于因素B（加酶量）是取水平二還是水平三。從方差分析結(jié)果（表4）可知，因素A（溫度）對水解度影響顯著，因素B和因素D對水解度合抑制率均沒有顯著影響，且因素B對抑制率影響比對水解度影響強。因此，從經(jīng)濟角度考慮，將因素B的最適條件優(yōu)化為B2，則堿性蛋白酶水解工藝的最適組合為A2B2C3D3，即溫度50 ℃、加酶量10 000 U·g-1、pH 9.5、底物濃度6%。以最適組合條件進行驗證試驗，羅非魚下腳料水解度為28.19%和30.12%。

3 結(jié)論

通過對比胃蛋白酶、胰蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶等5種常用蛋白酶水解羅非魚下腳料的效果，確定堿性蛋白酶為目標用酶，該酶反應(yīng)條件相對溫和，實驗條件易于控制，水解度和α-葡萄糖苷酶抑制率相對較高。通過單因素和正交試驗，對堿性蛋白酶水解羅非魚下腳料制備降血糖肽的工藝條件進行了優(yōu)化，最適條件是：溫度50 ℃、加酶量10 000 U·g-1、pH9.5、底物濃度6%，此工藝條件下水解度與抑制率分別為28.19%和30.12%。

參考文獻：

[1]Eduardo José A P，Pedro C E，José Maria F R，et al.Cost-effectiveness analysis of dapagliflozin compared to DPP4 inhibitors and other oral antidiabetic drugs in the treatment of type-2 diabetes mellitus in Spain[J].Atencion primaria，2015，47（8）：505-513.

[2]Barra N G，Chew M V，Holloway A C，et al.Interleukin-15 treatment improves glucose homeostasis and insulin sensitivity in obese mice[J].Diabetes Obes & Metab，2012，14（2）：190-193.

[3]張征立.固定化酶制備降血糖肽及其生物學活性評價[D].鎮(zhèn)江：江蘇科技大學，2019.

[4]中華醫(yī)學會糖尿病學分會.中國2型糖尿病防治指南（2017年版）[J].中國實用內(nèi)科雜志，2018，38（4）：292-344.

[5]王 瑩，徐秀林，朱乃碩.生物活性肽降血糖功能的研究進展[J].食品科學，2012，33（9）：341-344.

[6]王 楠，石國英，趙婷婷，等.功能型食品中降血糖活性因子的研究進展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學，2017，45（4）：75-77.

[7]江明珠.超聲波預(yù)處理輔助酶解制備大豆降糖肽及其作用機理[D].鎮(zhèn)江：江蘇大學，2018.

[8]楊宇軒，胡森科，張敬華，等.大豆多肽對糖尿病模型大鼠的血糖控制及對胰島細胞的保護作用[J].西安交通大學學報（醫(yī)學版），2014，35（2）：191-195.

[9]李 川，段振華，龍映均，等.羅非魚頭中硫酸軟骨素提取的工藝優(yōu)化[J].食品科學，2009，30（20）：234-237.

[10]王文勇，張英慧.羅非魚下腳料的綜合利用研究進展[J].肉類工業(yè)，2016（11）：46-49.

[11]趙 闊，張紅建，陳 艷，等.酶解羅非魚下腳料制備降血壓肽的研究[J].農(nóng)產(chǎn)品加工，2018（21）：10-13，16.

[12]顏 輝，蔡 豪，賈俊強，等.超聲酶解制備牡丹籽降血糖肽的響應(yīng)面優(yōu)化研究[J].食品工業(yè)科技，2016，37（17）：220-224，231.

[13]包美麗.馬鹿茸降血糖肽的制備及性質(zhì)研究[D].哈爾濱：東北林業(yè)大學，2017.

基金項目：海南省重點研發(fā)計劃專項（編號：ZDYF2018083）。

作者簡介：趙 闊（1984—），女，碩士，高級工程師;研究方向為食品營養(yǎng)與健康。