達(dá)塞布韋對撲熱息痛葡萄糖醛酸化的抑制作用

李蘭麗，姜麗麗，夏楊柳，劉勇

（大連理工大學(xué)生命科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，遼寧 盤錦 124221）

撲熱息痛（paracetamol，APAP）又稱對乙酰氨基酚、醋氨酚，是世界上應(yīng)用最廣泛的解熱鎮(zhèn)痛藥，臨床上常與其他藥物聯(lián)合使用。過量服用APAP可導(dǎo)致肝毒性和急性肝功能衰竭［1］。APAP在人體內(nèi)主要通過肝臟中多種尿苷二磷酸-葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶（UDP-glucuronosyltransferases，UGTs）介導(dǎo)的葡萄糖醛酸化反應(yīng)清除，其中最主要的是尿苷二磷酸-葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶1A9 （UDPglucuronosyltransferases1A9，UGT1A9）［2-3］。UGTs是人體內(nèi)一類重要的Ⅱ相代謝酶，參與了許多內(nèi)源性物質(zhì)（如膽紅素）和外源性化學(xué)物（如藥物）的代謝清除［4-5］。研究［6-8］表明，當(dāng)與APAP同時服用的藥物對UGTs活性具有抑制作用時，APAP的不良反應(yīng)率可能會增加，甚至引發(fā)嚴(yán)重的肝毒性。

抗病毒藥物達(dá)塞布韋，又名ABT-333，是丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）的新型非核苷抑制劑，通過抑制NS5B的RNA聚合酶抑制HCV復(fù)制［9］。研究［10］發(fā)現(xiàn)，達(dá)塞布韋對幾種UGTs有抑制作用，且HCV治療周期較長［11］，因此，達(dá)塞布韋在臨床上與其他藥物同時服用時，有可能通過其對某些UGTs的抑制導(dǎo)致藥物相互作用［12］。

本研究擬利用酶動力學(xué)和藥物相互作用預(yù)測模型，定量評價達(dá)塞布韋對APAP的葡萄糖醛酸化的抑制作用，并預(yù)測由此引發(fā)藥物相互作用的危險度，以期為達(dá)塞布韋的臨床安全應(yīng)用提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料

p-乙酰氨基苯-β-D-葡萄糖酸鈉鹽（p-acetamidophenyl β-D-glucuronide sodium salt，APAPG），尿苷-5’-二磷酸葡糖醛酸三鈉鹽（uridine 5’-diphosphoglucuronic acid trisodium salt，UDPGA）購自美國Sigma-Aldrich公司。人肝微粒體（human liver microsomes，HLMs）購自上海瑞德肝臟疾病研究有限公司。人重組UGT1A9購自美國康寧公司。APAP、3’-羥基乙酰苯胺購自中國阿拉丁公司。達(dá)塞布韋購自美國Selleck公司。

1.2 方法

1.2.1 HLMs中APAP的葡萄糖醛酸化動力學(xué)研究:選用混合HLMs反應(yīng)體系孵育系統(tǒng)［12］，在含有HLMs（0.5 mg/mL）、50 mmol/L Tris-HCl緩沖液 （pH7.4）、丙甲菌素（2.5 mg/mL）、MgCl2（100 mmol/L）、底物APAP（終濃度為0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、15.0、20.0、30.0、40.0 mmol/L）和UDPGA （50 mmol/L）的200 μL總體積典型孵育混合體系中，進(jìn)行酶促反應(yīng)，所有實(shí)驗(yàn)設(shè)置2個平行組。上述條件加入Tris-HCl、HLMs、丙甲菌素后輕輕渦旋5 s，冰浴15 min后，再依次向EP管內(nèi)加入MgCl2、APAP后渦旋5 s，在37 ℃下預(yù)溫孵育5 min后，將啟動反應(yīng)的輔助因子UDPGA加入到該體系中啟動反應(yīng)。在37 ℃下反應(yīng)30 min后，向該體系加入100 μL冰乙腈（含內(nèi)標(biāo)物3-乙酰氨基苯酚，1 mmol/L）終止反應(yīng)，并渦旋混勻后放入冰中。4 ℃、20 000g離心15 min，取上清液再離心1次后，取50 μL上清液轉(zhuǎn)移至進(jìn)樣瓶中。將上清液（10 μL）注入高效液相色譜儀HPLC （Waters 2695，美國沃特世公司）中進(jìn)行分析。分離柱為Tnature C18［4.6 mm ×250 mm，5 μm，中國華譜科儀（北京）科技有限公司與美國沃特世公司聯(lián)合出品］。UV檢測波長為254 nm，流速為1 mL/min。流動相A和B分別含有1.19 %冰醋酸和甲醇。比例為84%A液和16%B液，進(jìn)樣20 min。通過使用標(biāo)準(zhǔn)曲線定量APAP代謝物APAPG。

1.2.2 達(dá)塞布韋對APAP葡萄糖醛酸化的抑制作用研究:將10 mmol/L APAP與達(dá)塞布韋（0～200 μmol/L）分別在0.5 mg/mL的HLMs或重組UGT1A9反應(yīng)體系中孵育反應(yīng)。達(dá)塞布韋和APAP溶于DMSO中（終濃度為1%），加入達(dá)塞布韋的催化APAP葡萄糖醛酸化活性/空白的活性的百分比值作為Y軸，lg （達(dá)塞布韋濃度）的值作為X軸，從而擬合出IC50值來評價藥物的抑制作用。

1.2.3 達(dá)塞布韋對APAP葡萄糖醛酸化抑制動力學(xué)研究:根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果和文獻(xiàn)［6］作為參考，設(shè)置底物濃度覆蓋其Km值參考范圍。另根據(jù)前面的抑制作用實(shí)驗(yàn)得到的IC50為參考，設(shè)置抑制作用藥物達(dá)塞布韋濃度覆蓋IC50值范圍。將不同濃度的APAP（5、10、15、或20 mmol/L）和達(dá)塞布韋（1、2、4、或8 μmol/L）孵育于HLMs（0.5 mg/mL）或重組UGT1A9（蛋白質(zhì)終濃度為0.5 mg/mL）。分別利用競爭性抑制公式（1）{v=（VmaxS）/ （Km（1+［I］/Ki） +S） }、非競爭性抑制公式（2）{v=（VmaxS）/ （Km+S） （1+［I］/Ki） }、反競爭性抑制公式（3）{v=（VmaxS）/ （Km+（1+［I］/Ki） S） }和混合性抑制公式（4）{v=（VmaxS）/ （（Km（1+［I］/Ki） +S （1+［I］/αKi） }進(jìn)行數(shù)據(jù)擬合，判斷抑制類型并求得抑制常數(shù)Ki。上述公式中，v和Vmax分別表示反應(yīng)速度和最大反應(yīng)速度，Km是反應(yīng)速度為最大反應(yīng)速度的一半時的底物濃度，Ki是表觀抑制常數(shù)，表示酶與抑制劑的親和力，S是底物濃度，［I］是抑制劑濃度。分別利用Lineweaver-Burk作圖法和Dixon作圖法來直觀表現(xiàn)抑制類型及Ki。

1.2.4 計算曲線下面積（area under curve，AUC）比率以定量預(yù)測藥物相互作用風(fēng)險度:因達(dá)塞布韋的抑制而導(dǎo)致的藥物相互作用危險度的預(yù)測根據(jù)存在和不存在抑制劑達(dá)塞布韋的情況下APAP的AUC的比率{AUCi/AUC=1/ （fm/ （1+［I］/Ki）+（1-fm） }［13］來進(jìn)行預(yù)測。其中，Ki是從體外實(shí)驗(yàn)獲得的抑制劑常數(shù)；fm是被抑制酶代謝的比例（fm=0.55）［14］，APAP藥物主要由UGTs代謝。［I］是酶活性位點(diǎn)上的抑制劑濃度。既往研究［9］表明，在該計算模型中使用［I］in作為參數(shù)來評估藥物相互作用較為準(zhǔn)確。［I］in是最大肝輸入藥物濃度。有研究［13］表明，用［I］in參數(shù)代替［I］參數(shù)評估藥物相互作用更加準(zhǔn)確。計算公式為［I］in=［I］av+kaFaD/Qh。其中，ka是達(dá)塞布韋吸收速率常數(shù)，其值為0.5 （1/h）；Fa是從腸道進(jìn)入血中的吸收比例，其值為0.7；D代表給藥劑量（250 mg/次，2次/d）［15］；Qh是肝的血液流速（1 610 mL/min［13］）；達(dá)塞布韋的ka、Fa參數(shù)均能從文獻(xiàn)［10］中獲取。［I］av是反復(fù)口服達(dá)塞布韋后系統(tǒng)血漿濃度的平均值。計算公式為［I］av=（D/τ）/ （CL/F） 。其中，τ代表給藥間隔，其值為12 h；CL/F是藥物的表觀清除率，其值為1 150 L/d［12］。

2 結(jié)果

2.1 HLMs中APAP的葡萄糖醛酸化動力學(xué)

結(jié)果顯示，HLMs中APAP的葡萄糖醛酸化反應(yīng)符合米氏方程，米氏常數(shù)Km和最大反應(yīng)速度Vmax分別為（10.84±2.07） mmol/L和 （26.20±1.85） pmol·min-1·mg-1protein。

2.2 HLMs中達(dá)塞布韋對APAP葡萄糖醛酸化的抑制作用

圖1 人肝微粒體中達(dá)塞布韋對APAP葡萄糖醛酸化的抑制作用Fig.1 The inhibited effect of dasabuviron on paracetamol glucuronidation in pooled HLMs

如圖1A所示，隨著達(dá)塞布韋濃度的增加，溫孵體系中APAP葡萄糖醛酸化產(chǎn)物量明顯減少，表明達(dá)塞布韋對APAP的葡萄糖醛酸化反應(yīng)具有較強(qiáng)的抑制作用，其IC50值為（3.94±1.29） μmol/L。進(jìn)一步對抑制動力學(xué)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行非線性回歸分析及Lineweaver-Burk作圖和Dixon作圖。Lineweaver-Burk作圖得到圖1B，隨著不同抑制物（達(dá)塞布韋）濃度的增加，直線的傾斜率增加且交于X軸同一點(diǎn)，由此可知達(dá)塞布韋是通過非競爭可逆性抑制機(jī)制作用于APTP葡萄糖醛酸化過程的。根據(jù)Dixon作圖法得到圖1C，可擬合得到其表觀抑制常數(shù)Ki值為（5.50±0.46） μmol/L。

2.3 UGT1A9中達(dá)塞布韋對APAP葡萄糖醛酸化的抑制作用

如圖2A所示，在單酶UGT1A9體系中，達(dá)塞布韋對APAP的葡萄糖醛酸化具有較強(qiáng)的抑制作用，其IC50值為（5.24±1.26） μmol/L。非線性回歸分析及Lineweaver-Burk作圖和Dixon作圖（圖2B、2C）表明，達(dá)塞布韋通過非競爭性的可逆性抑制機(jī)制作用于APAP葡萄糖醛酸化過程，Ki值為（4.92±0.46） μmol/L。與HMLs體系中得到的動力學(xué)參數(shù)相似，表明達(dá)塞布韋對APAP葡萄糖醛酸化反應(yīng)的抑制主要通過抑制UGT1A9完成。

圖2 UGT1A9中達(dá)塞布韋對APTP葡萄糖醛酸化的抑制作用Fig.2 The inhibited effect of dasabuvir on paracetamol glucuronidation in UGT1A9

2.4 AUC比率

根據(jù)查到的參數(shù)，結(jié)合公式可計算得到反復(fù)口服達(dá)塞布韋后系統(tǒng)血漿濃度的平均值，即［I］av的值為0.88 μmol/L，并得到最大肝輸入藥物濃度，即［I］in為2.97 μmol/L。最后，將體外HLMs中達(dá)塞布韋對APAP葡萄糖醛酸化的抑制常數(shù)（Ki=5.50 μmol/L）帶入到公式中，進(jìn)而得出APAP的AUC的比率（AUCi/AUC）為1.27，即達(dá)塞布韋與APAP同時服用時APAP的AUC較單獨(dú)服用APAP時將增加27%，提示二者聯(lián)合用藥時發(fā)生藥物相互作用的可能性很大，應(yīng)當(dāng)引起重視。

3 討論

達(dá)塞布韋對UGTs有抑制作用［10］，而APAP又主要由UGTs催化代謝。APAP的毒性與APAP葡萄糖醛酸化抑制程度相關(guān)［6］，即UGTs活性受到抑制的情況下，APAP葡萄醛酸化物量減少，其母藥在體內(nèi)暴露量增加，毒性增加，這也是APAP導(dǎo)致肝毒性的主要原因之一。因此，當(dāng)達(dá)塞布韋與APAP聯(lián)合用藥時，有可能導(dǎo)致參與APAP代謝的UGTs受到抑制，進(jìn)而引發(fā)不良反應(yīng)。由于肝內(nèi)的UGTs有一定的底物特異性，因此，本研究中首先探討了達(dá)塞布韋是否對APAP的葡萄糖醛酸化有影響。HLMs中APAP的葡萄糖醛酸化動力學(xué)研究的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，本研究測定的Km值和文獻(xiàn)［6］報道相近，說明本實(shí)驗(yàn)的反應(yīng)體系中HLMs中的酶活性較好，可進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

本研究發(fā)現(xiàn)，在HLMs中，達(dá)塞布韋對APAP的葡萄糖醛酸化具有較強(qiáng)的非競爭性抑制作用。HLMs中有很多種UGTs亞型［16］，在APAP正常發(fā)揮藥效的血藥濃度條件下，UGT1A9對APAP的葡萄糖醛酸化發(fā)揮著重要的催化作用［6］。因此，本研究進(jìn)一步在UGT1A9單酶體系中進(jìn)行了酶抑制動力研究。結(jié)果表明，UGT1A9單酶體系中和HLMs中的結(jié)果相似，均為非競爭性抑制，抑制常數(shù)Ki也相近，說明HLMs中達(dá)塞布韋對APAP的葡萄糖醛酸化的抑制作用主要通過UGT1A9完成。

fm是指底物被參與其代謝的酶代謝的比例（fm=0.55）［14］，參數(shù)fm是DDI風(fēng)險評估的關(guān)鍵參數(shù)［17］，在很多研究DDI的文獻(xiàn)［18-19］中都會引用到該參數(shù)。值得注意的是，本研究中藥物相互作用預(yù)測計算結(jié)果僅僅基于達(dá)塞布韋對肝中的UGTs的抑制作用，然而，UGT1A9還存在于肝外組織，如腸道、腎臟中［20］。口服藥物在達(dá)到系統(tǒng)循環(huán)前需穿過胃腸道壁，在吸收過程中由于腸和肝而損失藥物的過程稱為首過效應(yīng)。因此，若考慮到達(dá)塞布韋對肝外組織UGTs的抑制作用，即對首過效應(yīng)的抑制可能引起血藥濃度增高，其AUC比率會更高。另外，用于計算血藥濃度的藥代動力學(xué)參數(shù)是采用人群的平均值參數(shù)，但個體間的變異性很高，某些個體中達(dá)塞布韋血藥濃度更高［21］。此外，APAP的最大血藥濃度（Cmax）可以因空腹攝入而增加1.72倍［22］，且有研究［23］表明體外數(shù)據(jù)傾向于低估體內(nèi)藥物葡萄糖醛酸化的抑制作用。綜上所述，臨床上由于達(dá)塞布韋對UGTs的抑制作用，APAP的AUC增加的結(jié)果應(yīng)當(dāng)比計算預(yù)測的更多，特別是對于一些達(dá)塞布韋血液濃度較高的人。根據(jù)公式（1）預(yù)測得到AUC將是原來的1.27倍，而美國食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）規(guī)定預(yù)測的AUC比率在0.8～1.25就應(yīng)當(dāng)進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的初篩標(biāo)準(zhǔn)。因此，達(dá)塞布韋與APAP聯(lián)用時，在體內(nèi)可能會使APAP的AUC增加而產(chǎn)生肝毒性，應(yīng)引起臨床醫(yī)生的警惕。

盡管已有研究［24-25］預(yù)測體內(nèi)抑制藥物相互作用的危險度，但從體外數(shù)據(jù)外推到體內(nèi)藥物相互作用的結(jié)果仍需謹(jǐn)慎對待。體內(nèi)的藥物代謝受各種因素影響，如與體內(nèi)大分子蛋白的結(jié)合、藥物分子一系列的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和代謝酶的情況都可影響藥物濃度的估算。另外，不同于已有大量報道的細(xì)胞色素P （cytochrome，CYP） 450酶介導(dǎo)的藥物相互作用，現(xiàn)在對由于UGTs抑制或誘導(dǎo)引發(fā)的藥物相互作用的研究［13］較少，不便于通過數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析推導(dǎo)出更適合UGTs介導(dǎo)的藥物相互作用模型。因此，為了進(jìn)一步確定達(dá)塞布韋與APAP聯(lián)用是否會引起APAP肝毒性的發(fā)生，仍需進(jìn)一步的體內(nèi)研究。而FDA只考慮到CYP和轉(zhuǎn)運(yùn)體介導(dǎo)的藥物相互作用，忽略了UGTs介導(dǎo)的藥物相互作用。本研究結(jié)果作為一個初篩，為臨床醫(yī)生的安全合理用藥提供理論建議。在臨床中，當(dāng)達(dá)塞布韋與APAP聯(lián)用時，需留意監(jiān)測服藥者的APAP的血藥濃度以免發(fā)生藥物的不良反應(yīng)。