影響肝細(xì)胞癌5年生存期的關(guān)鍵基因分析

李樹(shù)強(qiáng)

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院普通外科，沈陽(yáng) 110004）

原發(fā)性肝癌是目前我國(guó)第四位常見(jiàn)的惡性腫瘤，在腫瘤致死疾病中排第三位，嚴(yán)重威脅人們的生命和健康。肝細(xì)胞癌 （hepatocellular carcinoma，HCC） 占原發(fā)性肝癌的80%以上，手術(shù)切除和肝移植是根治原發(fā)性HCC的主要手段，但是由于早期發(fā)現(xiàn)困難，放化療效果不佳，5年生存率僅為15%［1］。因此，更好地了解HCC發(fā)生的分子機(jī)制，發(fā)現(xiàn)影響HCC 5年生存期的關(guān)鍵基因，為HCC治療提供新的靶點(diǎn)已成當(dāng)務(wù)之急。

1 材料與方法

1.1 癌癥基因組圖譜（the cancer genome atlas，TCGA）數(shù)據(jù)下載

登陸TCGA數(shù)據(jù)庫(kù) （https://cancergenome.nih.gov）網(wǎng)站下載公開(kāi)的HCC轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和腫瘤樣本臨床數(shù)據(jù)。其中，生存期＞5年 （無(wú)論存活與否） 的癌癥樣本43例，生存期＜5年 （已死亡） 的癌癥樣本107例。本研究旨在探討影響HCC 5年生存率的關(guān)鍵基因，故排除隨訪時(shí)間不到5年且存活的樣本。

1.2 差異表達(dá)基因分析

使用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中的reads count評(píng)估基因表達(dá)水平，應(yīng)用R軟件 （3.5.1版本） 中的limma及edgeR軟件包［2］對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化及差異表達(dá)分析，gplots軟件包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行圖形可視化。篩選log FC絕對(duì)值 ＞2，F(xiàn)DR ＜0.01的基因?yàn)椴町惐磉_(dá)基因。

1.3 功能和通路富集分析

DAVID （The Database for Annotation，Visualization and Integrated Discovery） 是一個(gè)在線數(shù)據(jù)庫(kù)［3］（https://david.ncifcrf.gov），為研究人員提供了一套全面的功能注釋工具，以便理解大量基因背后的生物學(xué)意義。應(yīng)用DAVID分別對(duì)上調(diào)和下調(diào)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO （gene ontology） 和 KEGG （Kyoto encyclopedia of genes and genomes） 富集分析，P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.4 候選關(guān)鍵基因篩選

將差異基因上傳到STRING數(shù)據(jù)庫(kù)［4］（https://string-db.org），選擇置信度＞ 0.4構(gòu)建蛋白-蛋白互作（PPI）網(wǎng)絡(luò)。基因在PPI網(wǎng)絡(luò)的連接度 （degree） ≥8且排名前10位的基因定義為候選關(guān)鍵基因。

1.5 結(jié)果驗(yàn)證

應(yīng)用在線網(wǎng)站 http://kmplot.com/analysis［5］，繪制Kaplan-Meier生存曲線，計(jì)算95%置信區(qū)間的危險(xiǎn)比和logrankP值，比較不同基因表達(dá)水平患者的生存期，篩選并驗(yàn)證候選關(guān)鍵基因是否為真正關(guān)鍵基因。

2 結(jié)果

2.1 識(shí)別差異表達(dá)基因

下載數(shù)據(jù)后進(jìn)行歸一化、對(duì)數(shù)化，去掉沒(méi)有對(duì)應(yīng)基因注釋信息的探針，如果同一個(gè)基因有多個(gè)探針表達(dá)值，取平均數(shù)，去掉重復(fù)探針，最終得到包含19 754個(gè)基因，150個(gè)樣本的表達(dá)譜。通過(guò)R中edgeR包，log FC絕對(duì)值 ＞2，F(xiàn)DR＜0.01為表達(dá)差異基因篩選條件，共得到383個(gè)差異基因。其中表達(dá)上調(diào)基因253個(gè)，表達(dá)下調(diào)基因130個(gè)，見(jiàn)圖1、2。

2.2 功能和通路富集分析

圖1 差異表達(dá)基因火山圖Fig.1 Volcano plots of differentially expressed genes

圖2 差異表達(dá)基因主成分分析Fig.2 Principal component analysis of differentially expressed genes

用DAVID分別對(duì)上調(diào)和下調(diào)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO和 KEGG富集分析。得到了Biological process （BP）和KEGG pathway結(jié)果 （表1、2）。上調(diào)基因BP功能聚類(lèi)主要集中在“positive regulation of cAMP biosynthetic process”，“synaptic transmission，cholinergic”，“cation transmembrane transport”，“regulation of membrane potential”等。有3種典型的KEGG通路在上調(diào)基因中過(guò)表達(dá)，包括“Neuroactive ligand-receptor interaction”，“Nicotine addiction” 和“GABAergic synapse”。下調(diào)基因BP功能主要富集在“potassium ion transport”，“energy reserve metabolic process”和“oxygen transport”等，下調(diào)基因在KEGG通路中主要富集在“Salivary secretion”，“cAMP signaling pathway”和“Cardiac muscle contraction”等。由此可見(jiàn)，差異表達(dá)基因功能主要富集在與某些神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)有關(guān)的生物學(xué)過(guò)程和通路中，通過(guò)膜電位改變，跨膜離子的轉(zhuǎn)運(yùn)和突觸傳遞等影響患者5年生存率。

表1 上調(diào)差異表達(dá)基因的BP及KEGG通路富集分析Tab.1 Enrichment analysis of BP and KEGG pathways of up-regulated differentially expressed genes

表2 下調(diào)差異表達(dá)基因的BP及KEGG通路富集分析Tab.2 Enrichment analysis of BP and KEGG pathways of down-regulated differentially expressed genes

2.3 候選關(guān)鍵基因篩選

差異表達(dá)基因在PPI網(wǎng)絡(luò)的連接度≥8且排名前10位的基因定義為候選關(guān)鍵基因，包括GCG、LEP、PTH、HTR5A、CRH、CRHR1、CALCA、ADCY2、GAST和CHGA（圖3）。除LEP為表達(dá)下調(diào)基因外，其余均為表達(dá)上調(diào)基因。

圖3 蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò) （PPI） 圖Fig.3 Protein-protein interaction network

圖4 肝細(xì)胞癌關(guān)鍵基因預(yù)后分析Fig.4 Prognostic analysis of key genes in hepatocellular carcinoma

2.4 生存曲線分析

繪制Kaplan-Meier生存曲線，結(jié)果 （圖4）顯示，除了LEP和CHGA，HCC患者中GCG、PTH、HTR5A、CRH、CRHR1、CALCA、ADCY2和GAST基因的高表達(dá)，其總生存率明顯升高，故認(rèn)為這些差異表達(dá)基因可能為HCC患者長(zhǎng)期生存的關(guān)鍵基因。

3 討論

HCC是全球第五大常見(jiàn)癌癥，每年約有85萬(wàn)新發(fā)病例［6］，占肝癌的80%以上［7］。HCC通常發(fā)生在肝硬化患者中，越來(lái)越多的HCC病例伴有非酒精性脂肪肝，這是肥胖和胰島素抵抗的結(jié)果［8］。常用的治療方法有器官移植、手術(shù)切除、經(jīng)動(dòng)脈化療栓塞、局部射頻消融和局部微波消融等［9］。由于早期沒(méi)有臨床癥狀，大多數(shù)HCC病例發(fā)現(xiàn)即為晚期，治療療效差。索拉非尼作為不可切除HCC病例的臨床替代藥物，療效一般［10］。因此，從基因水平更好地了解HCC發(fā)生機(jī)制，發(fā)現(xiàn)新的治療靶點(diǎn)已成當(dāng)務(wù)之急。

本研究利用TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中HCC mRNA基因及臨床表型信息，通過(guò)一系列分析，確定了8個(gè)與HCC 5年生存期密切相關(guān)的關(guān)鍵基因，GCG在糖代謝和體內(nèi)平衡中起著重要作用［11］，PTH通過(guò)溶解骨骼中的鹽分和防止腎臟排泄來(lái)提高血鈣水平，與前列腺癌侵襲程度相關(guān)［12］。HTR5A是一種生物激素，起神經(jīng)遞質(zhì)、激素和有絲分裂原的作用。這種受體的活性是由G蛋白介導(dǎo)的，可能通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平而發(fā)揮作用。CRH所編碼的前蛋白經(jīng)蛋白水解處理后產(chǎn)生成熟的神經(jīng)肽激素。應(yīng)激反應(yīng)時(shí)，這種激素由下丘腦室旁核分泌，與促腎上腺皮質(zhì)激素釋放受體結(jié)合，刺激垂體釋放促腎上腺皮質(zhì)激素。這種蛋白的顯著減少與阿爾茨海默病有關(guān)。CRHR1編碼一種G蛋白耦聯(lián)受體，對(duì)激活信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路至關(guān)重要，這些通路調(diào)節(jié)包括壓力、繁殖、免疫反應(yīng)和肥胖在內(nèi)的多種生理過(guò)程。最近研究［13］報(bào)道，CRH/CRHR1可通過(guò)IL-6/JAK2/STAT3信號(hào)通路和VEGF誘導(dǎo)的腫瘤血管生成，促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖。CALCA表達(dá)水平與多種腫瘤有關(guān)，如胃癌、肺癌和睪丸腫瘤等［14-16］。ADCY2是一種膜相關(guān)酶，催化二級(jí)信使環(huán)腺苷單磷酸的形成。GAST能刺激胃黏膜產(chǎn)生和分泌鹽酸，胰腺分泌其消化酶。還能刺激平滑肌收縮，促進(jìn)胃和腸的血液循環(huán)和水分分泌。

綜上所述，本研究應(yīng)用TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)，發(fā)現(xiàn)了8個(gè)與HCC 5年生存期有關(guān)的關(guān)鍵基因，為今后HCC的研究提供了新的方向。本研究?jī)H是通過(guò)數(shù)據(jù)分析初步得到可能有價(jià)值的關(guān)鍵基因，作用機(jī)制尚不清楚，需要后續(xù)實(shí)驗(yàn)加以驗(yàn)證。