喉鱗癌組織中PTTG VEGF-C的表達(dá)及與臨床病理特征的相關(guān)性

高立生, 高 珊, 徐 勤, 劉 雙, 劉曉東

(1.承德護(hù)理職業(yè)學(xué)院外科教研室, 河北 承德 0670002.承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院耳鼻喉科, 河北 承德 067000)

喉鱗癌組織中PTTG VEGF-C的表達(dá)及與臨床病理特征的相關(guān)性

高立生1, 高 珊2, 徐 勤2, 劉 雙2, 劉曉東2

(1.承德護(hù)理職業(yè)學(xué)院外科教研室, 河北 承德 0670002.承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院耳鼻喉科, 河北 承德 067000)

目的：探討喉鱗癌組織中垂體腫瘤轉(zhuǎn)化基因(PTTG)及血管內(nèi)皮生長因子-C(VEGF-C)的表達(dá)及其與喉癌病理特征的關(guān)系。方法:應(yīng)用免疫組化SP法分別檢測60例喉癌病理組織和32例癌旁正常組織中PTTG和VEGF-C的表達(dá)水平，并應(yīng)用RT-PCR法檢測以上組織中PTTG mRNA和VEGF-C mRNA的表達(dá)水平。結(jié)果:喉鱗癌病理組織中PTTG和VEGF-C表達(dá)情況均顯著高于相應(yīng)癌旁正常組織(P<0.01)；PTTG和VEGF-C的表達(dá)在淋巴結(jié)有否轉(zhuǎn)移組、臨床不同分期組與不同分化程度的喉鱗癌組組間比較，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)論:喉鱗癌的發(fā)生、發(fā)展、侵襲與轉(zhuǎn)移的過程中PTTG和VEGF-C起了重要作用，PTTG與VEGF-C的聯(lián)合檢測，可能對喉癌的預(yù)后判斷產(chǎn)生重要意義。

喉鱗癌; PTTG; VEGF-C

喉鱗狀細(xì)胞癌是頭頸部常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜。影響喉鱗癌預(yù)后的主要因素包括癌細(xì)胞是否呈侵襲性生長及淋巴結(jié)是否有轉(zhuǎn)移。垂體腫瘤轉(zhuǎn)化基因(pituitary tumor transforming gene，PTTG)能夠使正常細(xì)胞轉(zhuǎn)化成腫瘤細(xì)胞，進(jìn)而導(dǎo)致惡性腫瘤的發(fā)生。微淋巴管系統(tǒng)在腫瘤細(xì)胞向周圍組織浸潤和向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的過程中發(fā)揮著重要作用。血管內(nèi)皮生長因子-C(Vascular endothelial growth factor-C, VEGF-C)，是可以刺激淋巴管內(nèi)皮生長的因子，是具有反式激活作用的PTTG蛋白的靶基因之一，VEGF-C可能通過作為PTTG介導(dǎo)微淋巴管生成行為的效應(yīng)劑來發(fā)揮作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料:選取我院耳鼻喉科2007年8月至2013年8月期間收治的60例原發(fā)性喉鱗癌患者，以上患者均接受喉癌手術(shù)治療，其中男50例，女10例；年齡≥60歲32例，<60歲28例；吸煙組48例，均為吸煙史20年以上(每日>20支)，對照組12例；以上患者術(shù)前均未接受放、化療。通過喉癌手術(shù)切除獲60例腫瘤組織標(biāo)本，并收集32例相應(yīng)癌旁組織標(biāo)本。所有標(biāo)本均經(jīng)過兩名有診斷經(jīng)驗(yàn)病理醫(yī)師明確診斷。其中23例有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，37例無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；22例中低分化，38例高分化；26例聲門型，34例聲門上型；腫瘤直徑<3cm者36例，腫瘤直徑≥3cm者24例；TNMⅠ、Ⅱ期共42例，TNMⅢ、Ⅳ期共18例。PTTG、VEGF-C兔抗人多克隆抗體購自福建邁新公司;RT-PCR檢測試劑分別購自Invitrogen公司與上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 免疫組化法：取0.1g標(biāo)本組織于液氮中凍存，以用于提取mRNA，4%中性福爾馬林固定其余組織，常規(guī)脫水石蠟包埋，以用于免疫組化染色。①取石蠟包埋的標(biāo)本，作2張石蠟切片，其中一張給予VEGF-C免疫組化染色，另一張給予PTTG免疫組化染色；②室溫孵育，抗原修復(fù)，PBS沖洗；③胎牛血清封閉，滴加一抗50μL 4℃過夜，PBS沖洗；④加二抗，PBS沖洗；⑤DAB顯色，復(fù)染，脫水，封片，鏡檢。

1.2.2 RT-PCR檢測：采用半定量PCR技術(shù)，運(yùn)用Trizol試劑采用一步法提取總RNA，用AMV逆轉(zhuǎn)錄酶將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA，β-actin作為內(nèi)參照基因,擴(kuò)增片段為145bp。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳后，每例PTTG、VEGF-C與相應(yīng)β-actin擴(kuò)增產(chǎn)物條帶累積光密度(IOD)的比值作為PTTG、VEGF-C mRNA的相對表達(dá)量。①PTTG基因上游引物(5'to 3')：TGA TCC TTG ACG AGG GAG；下游引物(5'to 3')：GGT GGC AAT TCA ACA TCC AGG;② VEGF-C基因上游引物(5'to 3')：CTC TCT CAA GGC CCC AAA TCC；下游引物(5'to 3')：TCT TGT TCG CTG CCT GAC ACT 。

1.3 判定標(biāo)準(zhǔn):PTTG、VEGF-C蛋白主要在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)進(jìn)行表達(dá)，陽性反應(yīng)以出現(xiàn)棕黃色顆粒為標(biāo)準(zhǔn)。陽性對照是已知該癌陽性組織切片，PBS代替一抗作為陰性對照，采用雙評分法綜合判定。選取8個(gè)染色均勻腫瘤區(qū)的高倍鏡視野，①按染色陽性細(xì)胞百分率(A值)評分：>50%賦值3分，25%～50%賦值2分，<25%賦值1分，陰性賦值0分。②按染色強(qiáng)度(B值)評分：棕褐色賦值3分，棕黃色賦值2分，淺棕黃色賦值1分，不著色賦值0分，；綜合A值與B值判斷結(jié)果：陽性：1～6分，陰性：0分。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)數(shù)資料采用率的方式計(jì)數(shù)，χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料應(yīng)用均數(shù)加標(biāo)準(zhǔn)差記錄，采用t檢驗(yàn)，以a=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)，P<0.01，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 PTTG、VEGF-C在喉鱗癌病理組織與癌旁正常組織中的表達(dá):PTTG在喉鱗癌病理組織表達(dá)的陽性率為81.7%，在癌旁正常組織表達(dá)的陽性率31.3%，(P<0.01)；VEGF-C在喉鱗癌病理組織表達(dá)的陽性率為76.7%，在癌旁正常組織表達(dá)的陽性率為15.7%，PTTG與VEGF-C在喉鱗癌病理組織的表達(dá)均高于癌旁正常組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.01)，見表1。

表1 PTTG VEGF-C在喉鱗癌病理組織與癌旁正常組織中的表達(dá)比較

表2 PTTG、VEGF-C在喉鱗癌病理組織中的表達(dá)及與臨床實(shí)際病理因素的關(guān)系

2.2 PTTG、VEGF-C在喉鱗癌病理組織中的表達(dá)及與臨床實(shí)際病理因素的關(guān)系PTTG、VEGF-C在喉鱗癌病理組織中的表達(dá)與不同臨床分期、不同分化程度、有否淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移方面均有關(guān)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.01)；與年齡、性別、吸煙史、腫瘤大小及不同臨床分型方面均無關(guān)，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.01)。見表2。

2.3 PTTG mRNA、VEGF-C mRNA在喉鱗癌病理組織與癌旁正常組織中的表達(dá)PTTG mRNA與VEGF-C mRNA在喉鱗癌病理組織的表達(dá)均高于癌旁正常組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P均<0.01)，見表3。

表3 PTTG mRNA、VEGF-C mRNA在喉鱗癌病理組織與癌旁正常組織表達(dá)

表4 PTTG mRNA、VEGF-C mRNA水平在喉鱗癌組織中的表達(dá)及其臨床病理因素關(guān)系

2.4 PTTG mRNA、VEGF-C mRNA在喉鱗癌病理組織中的表達(dá)及與臨床實(shí)際病理因素的關(guān)系(見表4)，在喉鱗癌組織中，PTTG mRNA、VEGF-CmRNA的表達(dá)與不同臨床分期、不同分化程度、有否淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移方面均有關(guān)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.01)；與年齡、性別、吸煙史、腫瘤大小及不同臨床分型方面均無關(guān)，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.01)。

3 討 論

PTTG是一種新型原癌基因，由Pei于1997年分離出[1]。有研究發(fā)現(xiàn)[2,3]，PTTG可通過促進(jìn)細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)化，擾亂染色體穩(wěn)定性，誘導(dǎo)p53的細(xì)胞凋亡等作用導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。還可通過反式激活作用激活原癌基因、生長因子等途徑導(dǎo)致腫瘤侵襲及轉(zhuǎn)移[4]。近年研究發(fā)現(xiàn)，VEGF-C家族與腫瘤新生淋巴管形成有密切關(guān)系，是具有反式激活作用的PTTG蛋白的靶基因之一，能夠特異性地誘導(dǎo)淋巴管的增生，賦予VEGF-C在惡性腫瘤的生長、浸潤、侵襲及轉(zhuǎn)移過程中極為重要的角色[5]。此外，VEGF-C通過誘導(dǎo)血管新生，增加其通透性，加劇了惡性腫瘤細(xì)胞的淋巴道轉(zhuǎn)移[6]。

本研究發(fā)現(xiàn)：通過蛋白水平與基因水平雙重比較，PTTG、VEGF-C在喉鱗癌組織中的表達(dá)均明顯高于癌旁正常組織，且與腫瘤的分化程度、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期有關(guān)，提示PTTG、VEGF-C在喉鱗癌的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移中起到了重要作用。說明PTTG、VEGF-C可能通過以上某種途徑促進(jìn)了喉鱗癌的進(jìn)展。也有研究表明，PTTG可以上調(diào)DNA結(jié)合抑制蛋白-3(ID3)的表達(dá)，而VEGF‐C介導(dǎo)血管生成的介質(zhì)之一也是ID3，其在惡性腫瘤細(xì)胞的生長與轉(zhuǎn)移方面起到了促進(jìn)作用[7]。由此可見：PTTG可能通過以上途徑，促進(jìn)了VEGF-C的表達(dá)，從而二者共同促進(jìn)了喉鱗癌的發(fā)生及轉(zhuǎn)移。

我們所做的實(shí)驗(yàn)研究分別從蛋白水平及mRNA水平檢測了PTTG、VEGF-C在喉鱗癌組織及癌旁正常組織中的表達(dá)，并在此基礎(chǔ)上研究了二者與喉鱗癌臨床病理因素之間的關(guān)系，兩種水平的研究結(jié)論一致。提示在轉(zhuǎn)錄之前，PTTG與VEGF-C在喉鱗癌組織與癌旁正常組織中的差異性表達(dá)可能就已存在，對喉鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展侵襲與轉(zhuǎn)移有著重要影響。

總之，PTTG與VEGF-C在喉鱗癌發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移過程中起到了至關(guān)重要的作用，如果能夠發(fā)現(xiàn)某種途徑可以抑制PTTG、VEGF-C的過度表達(dá)，則很有可能為喉鱗癌的治療提供新的靶點(diǎn)。

[1] Pei L,Melmed S.Isolation and characterization of a pituitary tumortransforming gene(PTTG)[J].moL Endocrinol,1997,11(4):433～441.

[2] Kim D,Pemberton H,Stratford AL,et al.Pituitary tumor transforming gene(PTTG) inducegenetic instability in thyroid cell[J].Oncogene,2005,24(30):4861～4867.

[3] McCabe CJ,Boelaert K,Tannahill LA,et al.Vascular endothelial growth factor, its receptor KDR/Flk-1,and pituitary tumor transforming gene in pituitary tumrs[J].Clin Endocrinology Metab,2002,87:4238～4244.

[4] Yin H,Fujimoto N,Maruyuma S.Strain differerce in regulation of pituitary tumor transforming gene(PTTG)in estrogen-induced pituitary tumor genesis in rats[J].JapaneseJournal of Cancer Research,2001,92:1034～1040.

[5] Mei J,Huang X,Zhang P.Securin is not required for cellular viability,but is required for nomal growth of mouse embryonic fibroblasts[J].C-urrent Biology,2001,11:1197～1201.

[6] Latham AM, moLina-Paris C, Homer-Vanniasinkam S, et al. An integrative model for vascular endothelial growth factor A as a tumour biomarker[J].Integr Biol(Camb),2010,2 (9):397～407.

[7] Akino K ，Akita S ，Mizuguchi T ，et al．A novel moLeeularmarker of pituitary tumor transforming gene involves in a ratliver regeneration[J].Surg Res,2005,129(1) :142～146．

Expression of PTTG and VEGF-C in Laryngeal Squamous Cell Carcinoma and its Correlation with Clinicopathological Features

GaoLisheng,etal

(ChengdeNursingVocationalCollege,HebeiChengde06700,China)

Objective:To investigate the expression of PTTG and VEGF-C in laryngeal squamous cell carcinoma and the relationship with the pathological features. Methods: Immunohistochemistry and RT-PCR were adopted to detect the expression of PTTG and VEGF-C in 60 cases of laryngeal squamous cell carcinoma and 32 cases of para-carcinoma tissue. Results: The expression of PTTG and VEGF-C in laryngeal squamous cell carcinoma were significantly higher than that in para-carcinoma tissue (P<0.01). In laryngeal squamous cell carcinoma, the expressions of PTTG and VEGF-C were associated with differentiation, Lymph node metastasis and clinical stage (P<0.01). Conclusion: PTTG and VEGF-C might play an important role in the development of laryngeal squamous cell carcinoma. PTTG and VEGF-C might be prognostic factor of lymph node metastasis.

Laryngeal squamous cell carcinoma; PTTG; VEGF-C

1006-6233(2017)04-0656-04

河北省科技計(jì)劃項(xiàng)目，(編號(hào)：152777218)

A 【doi】10.3969/j.issn.1006-6233.2017.04.036