犬瘟熱病毒一步法RT-PCR 檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用

李文佳，陳 姍，高 旭

延邊大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)系，吉林延吉 133400

犬瘟熱（canine distemper，CDV）是由犬瘟熱病毒（canine distemper virus， CDV)引起犬科動(dòng)物的一種高度接觸性、烈性傳染病，我國(guó)將其列為二類動(dòng)物傳染病，一年四季均可發(fā)生，尤其是季節(jié)交替和高溫天氣更容易發(fā)病[1]。主要臨診癥狀是反復(fù)發(fā)熱和后期的神精癥狀，伴有腹瀉和嘔吐，由于病程晚期病毒損傷患犬神經(jīng)元，多為死亡或預(yù)后不良，患病幼犬死亡率高達(dá)80%。CDV 無論在病情嚴(yán)重程度、傳染強(qiáng)度，還是在死亡率上都是犬類動(dòng)物傳染病之首，給養(yǎng)犬業(yè)帶來巨大重創(chuàng)[2]。

CDV 為負(fù)鏈單股RNA 病毒，屬于副粘病毒科，副粘病毒屬成員。由于與同屬的牛瘟病毒（RPV）和麻疹病毒（MV）存在抗原相關(guān)性，臨床診斷中血清學(xué)方法常存在爭(zhēng)議[3]。因此，分子診斷較為可信，在眾多分子診斷方法中，RT-PCR 方法應(yīng)用較多，但由于常規(guī)的RT-PCR 檢測(cè)方法需要兩步進(jìn)行，即在進(jìn)行PCR 之前，需要經(jīng)歷病毒基因組RNA到cDNA 的反轉(zhuǎn)錄，往往在反轉(zhuǎn)錄過程引入污染源，導(dǎo)致假陽(yáng)性出現(xiàn)。而一步法RT-PCR 檢測(cè)方法避免了中間環(huán)節(jié)，反應(yīng)可以在一個(gè)反應(yīng)管中一步完成，不但節(jié)省時(shí)間，還可大大提升檢測(cè)準(zhǔn)確率[4]。因此，本研究擬參照GenBank 已登錄的CDV 基因序列，選取核蛋白編碼基因N 作為目的基因，設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，建立一種特異、高效、靈敏、重復(fù)性好的CDV 一步法RT-PCR 檢測(cè)方法，為CDV 感染的早期診斷和病原體監(jiān)測(cè)提供一種有效的檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 毒株與病料

犬瘟熱病毒（CDV）、犬細(xì)小病毒（CPV）和鵝細(xì)小病毒（GPV）由延邊大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室分離保守；狂犬病病毒（RABV）活疫苗由齊魯動(dòng)物保健品有限公司生產(chǎn)。36 份疑似CDV 感染的肛門拭子采自延邊地區(qū)多家動(dòng)物醫(yī)院。

1.2 試劑

質(zhì)粒提取試劑盒、DNA 凝膠回收試劑盒、DL2000 DNA Marker 和一步法RT-PCR 檢測(cè)試劑盒購(gòu)自TaKaRa 公司；病毒基因組RNA/DNA 提取試劑盒購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。

1.3 引物的設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank 已登錄的CDV 基因序列（JN381190）， 利 用oligo 6.0 軟 件 在CDV的核蛋白編碼基因N 保守區(qū)內(nèi)設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物， 上下游引物分別為CDV-F:5`-CAAGCATTGTTACAAGGTCTCGACT-3`;CDV-R:5`-GATGCTTGGGATTACCTCTACTAAC-3`，引物由濰捷基（上海）生物技術(shù)有限公司測(cè)序合成。

1.4 病毒基因組RNA 的提取

應(yīng)用病毒基因組RNA/DNA 提取試劑盒，取200μL 的CDV 的Vero 細(xì)胞培養(yǎng)液，反復(fù)凍融，按照說明書，進(jìn)行CDV 基因組RNA 的提取和純化。

1.5 一步法RT-PCR 反應(yīng)條件優(yōu)化

依據(jù)設(shè)計(jì)引物時(shí)推薦的相關(guān)參數(shù)，采取梯度法和方陣法對(duì)進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)，反應(yīng)體系為25 μL，用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行觀察。

1.6 擴(kuò)增產(chǎn)物的TA 克隆、酶切與測(cè)序

應(yīng)用DNA 凝膠回收試劑盒將目的基因進(jìn)行回收與純化，通過TA 克隆將目的基因連接到pMD18-T載體，經(jīng)DH5α 感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化、涂板和搖菌，將菌液PCR 鑒定為陽(yáng)性的質(zhì)粒送英濰捷基（上海）生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

1.7 特異性試驗(yàn)

取犬瘟熱病毒（CDV）、狂犬病病毒（RABV）的基因組RNA，以及犬細(xì)小病毒（CPV）和鵝細(xì)小病毒（GPV）的基因組DNA，以最優(yōu)條件進(jìn)行一步法RT-PCR 檢測(cè)。

1.8 敏感性試驗(yàn)

應(yīng)用分光光度計(jì)對(duì)CDV 基因組RNA 進(jìn)行定量，然后進(jìn)行倍比稀釋，RNA 含量分別為10 μg、1 μg、0.1 μg、10 ng、1 ng 和0.1 ng，以最優(yōu)條件進(jìn)行一步法RT-PCR 檢測(cè)。

1.9 重復(fù)性試驗(yàn)

以CDV 基因組RNA 為模板，進(jìn)行批間和批內(nèi)重復(fù)試驗(yàn)，并設(shè)立陰性對(duì)照，計(jì)算變異系數(shù)。

1.10 臨床應(yīng)用

取36 份犬肛門拭子送檢樣本，進(jìn)行一步法RT-PCR 檢測(cè)法檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果送往測(cè)序公司測(cè)序，對(duì)結(jié)果進(jìn)行準(zhǔn)確認(rèn)定。

2 結(jié)果

2.1 擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)與鑒定

經(jīng)1%凝膠電泳檢測(cè)后，在約200 bp 處出現(xiàn)特異條帶，與預(yù)期結(jié)果相符（圖1）。將目的基因TA克隆獲得質(zhì)粒命名為pMD18-CDV-N-197，經(jīng)測(cè)序鑒定為CDV 的N 基因。

圖1 基因擴(kuò)增結(jié)果

2.2 一步法RT-PCR 反應(yīng)體系與反應(yīng)條件

經(jīng)方陣法和梯度法，確定最終的反應(yīng)體系為：2×one-step buffer 12.5 μL，one-step Enzyme Mix 1 μL，RNA 模板4 μL，CDV-F 與CDV-R 引物各1 μL，加水補(bǔ)齊至25 μL；最優(yōu)反應(yīng)程序?yàn)椋?0 ℃30 min；94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s、52 ℃ 30 s、72℃ 20 s，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

2.3 特異性試驗(yàn)結(jié)果

應(yīng)用建立的一步法 RT-PCR 檢測(cè)方法，對(duì)CDV模板可擴(kuò)增出長(zhǎng)度約為197bp 的目的基因，而對(duì)狂犬病病毒（RABV）、犬細(xì)小病毒（CPV）和鵝細(xì)小病毒（GPV）和水空白對(duì)照均未見擴(kuò)增（圖2）。

圖2 特異性試驗(yàn)結(jié)果

2.4 敏感性試驗(yàn)結(jié)果

取6 μL 倍比稀釋的一步法RT-PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，結(jié)果表明，已建立方法最低能檢測(cè)到1 ng 的CDV 基因組RNA（圖3）。

圖3 敏感性試驗(yàn)結(jié)果

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

結(jié)果顯示，批間與批內(nèi)試驗(yàn)的變異系數(shù)均小于2%，說明本研究建立CDV 一步法 RT-PCR 檢測(cè)法具有較好的重復(fù)性。

2.6 臨床檢測(cè)結(jié)果

應(yīng)用已建立的一步法RT-PCR 方法，對(duì)采自延邊地區(qū)多家動(dòng)物醫(yī)院36 份疑似CDV 感染的肛門拭子進(jìn)行檢測(cè)。檢出陽(yáng)性樣本4 個(gè)，并且4 份測(cè)序結(jié)果均為陽(yáng)性，陽(yáng)性率為11.11%。

3 討論

延邊朝鮮族自治州是朝鮮族的聚集地，由于朝鮮族喜歡食用狗肉的飲食文化特點(diǎn)，使養(yǎng)犬業(yè)在延邊地區(qū)比較普遍和盛行，加之和朝鮮、俄羅斯比鄰，與日本海相望的地域特點(diǎn)，使延邊地區(qū)犬瘟熱病毒的流行具有自身特征和變數(shù)。目前，犬瘟熱病毒呈世界范圍分布，最早于1905 年，由Carre 發(fā)現(xiàn)并提出該病病原體是一種病毒。經(jīng)隨后近50 年的研究，于1951 年Dedie 首次通過組織培養(yǎng)方法分離到CDV[1]。我國(guó)最早暴發(fā)犬瘟熱（CD）于1968 年，此后由華北地區(qū)蔓延至全國(guó)，現(xiàn)在CDV 感染已是犬及幼犬死亡的主要傳染病，其次是感染犬細(xì)小病毒（CPV）[3，5]。臨床上未免疫犬一旦感染CDV，幾乎死亡率達(dá)80%左右，給養(yǎng)犬業(yè)帶來了巨大損失，嚴(yán)重威脅著寵物犬的生命，建立一種能夠?yàn)镃DV 感染提供早期準(zhǔn)確分子診斷方法是控制CD發(fā)生的關(guān)鍵。

本研究建立的一步法RT-PCR 檢測(cè)方法，采用了PrimeScript 反轉(zhuǎn)錄酶和DNA 聚合酶不僅50 ℃較低退火溫度下抑制非特異性擴(kuò)增，還提高了RTPCR 擴(kuò)增效率，其敏感性也高達(dá)1ng 基因組RNA，比常規(guī)RT-PCR 敏感性高。通過臨床實(shí)踐應(yīng)用，對(duì)采自延邊地區(qū)多家動(dòng)物醫(yī)院36 份疑似CDV 感染的肛門拭子進(jìn)行檢測(cè)，陽(yáng)性率為11.11%，提示延邊地區(qū)CDV 感染率較高，應(yīng)該采取有效的免疫措施，控制CDV 的傳播與蔓延。因此，本研究建立的CDV一步法RT-PCR 檢測(cè)方法敏感性高，特異性和重復(fù)性好，可用于CDV 的臨床診斷和病原監(jiān)測(cè)。