新型NIH 稀毛小鼠行為學(xué)特性的研究報告

趙耀東，胡進(jìn)平，陶博強，，胡浩博，劉映坤，王東旭，陳 健*

1.吉林大學(xué)實驗室與設(shè)備管理處，吉林長春 130000；2.吉林大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，吉林長春 130062；3.吉林大學(xué)口腔醫(yī)院，吉林長春 130021

稀毛小鼠作為珍貴的動物模型，在生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)研究中具有重要的作用，尤其是在皮膚病模型、腫瘤模型方面。因為小鼠表現(xiàn)為無毛或被毛稀疏，所以在進(jìn)行很多疾病研究之前不需要脫毛，而且在研究過程中表型更容易觀察到。裸小鼠是一種常見的被毛突變小鼠，常用于神經(jīng)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)等疾病的模型構(gòu)建。除了裸小鼠外，最常用的無毛小鼠是SKH1。SKH1 小鼠的毛發(fā)缺失和色素沉著導(dǎo)致它們被廣泛用于光生物學(xué)和光致癌研究。然而，這種小鼠模型的一個主要缺點為它們是異種繁殖的。NIH 小鼠，即NIH Swiss mouse，是美國國立衛(wèi)生研究所培育的一種遠(yuǎn)交群小鼠。新型NIH 稀毛小鼠是2007 年在正常的NIH小鼠封閉群的繁育過程中發(fā)現(xiàn)的自發(fā)突變小鼠，表現(xiàn)為毛發(fā)稀疏、無胡須，之后就以近交系的繁育方式將這一自發(fā)突變小鼠保留了下來。自發(fā)基因突變小鼠模型缺少了人為因素的干擾，在疾病發(fā)生的過程與相應(yīng)人類疾病的發(fā)生更加貼合。由于對NIH 稀毛小鼠的遺傳規(guī)律、免疫能力等生物學(xué)特性尚不清楚，為了便于后續(xù)研究觀察，因此需要對新型NIH稀毛小鼠的生物學(xué)特性進(jìn)行研究。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

實驗所用NIH 稀毛小鼠保種繁育以及飼養(yǎng)于吉林大學(xué)實驗動物中心（SCXK（吉）2016-0001），SPF 級NIH 小鼠購買自長春生物制品所有限公司（SCXK（吉）2017-0005）。

1.2 實驗試劑與儀器

氯仿、無水乙醇、異丙醇（北京化工廠）；移液吸頭、EDTA 抗凝管和離心管購置NEST 公司。

高壓滅菌器購自廈門致微；電子天平購自Mettler Toledo；多功能酶標(biāo)儀購自Bio-Tek；恒溫培養(yǎng)箱和恒溫振蕩器購自上海一恒；血細(xì)胞分析儀購自IDEXX；獨立送風(fēng)籠具和超凈工作臺購自蘇州馮氏；干式生化儀購自FUJI DRI-CHEM NX500iVC，高速冷凍離心機(jī)購自Thermo；光學(xué)顯微鏡購自Nikon；Morris 水迷宮分析軟件選用Panlab，SMART 3.0。

1.3 實驗方法

1.3.1 葡萄糖耐量和胰島素耐量實驗

本文葡萄糖耐量實驗所用葡萄糖劑量為1 g/kg（一般用量為1.5 ～2 g/kg），配制10%葡萄糖的生理鹽水溶液，小鼠從前一天下午17:00 至次日上午9:00 共計禁食16 h，飲水正常。注射前稱重標(biāo)號，測定血糖，按體重腹腔注射0.01 mL/g 劑量的葡萄糖，每2 只之間間隔1 min，注射后在15、30、60、90 min各測一次血糖。實驗結(jié)束后正常飼養(yǎng)。根據(jù)小鼠的性別和年齡決定胰島素用量，以注射30 min 后葡萄糖水平下降至之前的40%左右為宜。小鼠上午不禁水，禁食4 h。下午稱重標(biāo)號，測定血糖含量。生理鹽水稀釋胰島素，根據(jù)體重注射劑量1 U/kg，注射后在15、45、60、90、160 min 各測一次血糖。實驗結(jié)束后正常飼養(yǎng)。

1.3.2 Morris 水迷宮實驗

實驗前加水開機(jī)調(diào)試水迷宮，加入6 mL 藍(lán)墨水以加深背景色。水池所有功能運行正常。加熱板預(yù)熱至50 ～60 ℃，使用白毛巾來為小鼠游泳后恢復(fù)狀態(tài)。

Morris 水迷宮實驗分為定向航行實驗和空間探索實驗共計兩部分內(nèi)容。先進(jìn)行為期3 d 的定向航行實驗。每只小鼠學(xué)習(xí)3 d 共計16 次，第1 天學(xué)習(xí)4 次，之后第2 ～3 天每天學(xué)習(xí)6 次。每兩次學(xué)習(xí)間隔至少30 min。水迷宮劃分為4 個象限，學(xué)習(xí)時小鼠面向壁，放入不同象限開始學(xué)習(xí)。在其中一個象限中央位置設(shè)置目標(biāo)平臺（目標(biāo)象限），實驗結(jié)束標(biāo)準(zhǔn)為小鼠游至平臺并停留1 s 或達(dá)到60 s的實驗時長。其中未到目標(biāo)平臺的小鼠引導(dǎo)到目標(biāo)平臺后使其停留10 s。每次實驗后將小鼠放在加熱板。記錄小鼠游動到平臺的時間和距離，其中游動時間即為逃避潛伏期。

定向航行實驗結(jié)束后的24 h 內(nèi)完成空間探索實驗。實驗時撤走目標(biāo)平臺，之后在目標(biāo)象限的對側(cè)象限輕輕放入小鼠，計時60 s。實驗記錄小鼠在目標(biāo)象限游動時間和游動距離的比例，以及小鼠進(jìn)入目標(biāo)象限的次數(shù)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

所有實驗數(shù)據(jù)均表示為平均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差（x±s)，并對各項數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗，實驗結(jié)果的性別及組間分析比較采用配對t 檢驗，所有數(shù)據(jù)分析使用SPSS 統(tǒng)計學(xué)軟件。其中p＜0.05 與p＜0.01 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 葡萄糖耐量和胰島素耐量實驗

在葡萄糖耐量實驗（GTT）中，NIH 稀毛小鼠（HL）空腹和靜息狀態(tài)下血糖值比正常NIH 小鼠低。并且NIH 稀毛小鼠腹腔注射葡萄糖鹽水溶液15 min 后，其血糖值與正常小鼠相比顯著降低，糖耐量增高（圖1 所示）。在胰島素耐量實驗中，NIH 稀毛小鼠與正常小鼠的胰島功能均正常，無區(qū)別（圖2 所示）。

圖1 葡萄糖耐量實驗結(jié)果

注：縱軸是血糖（mmol/L），橫軸是時間(min)，其中***表示p＜0.001。

圖2 胰島素耐量實驗結(jié)果

2.2 NIH 稀毛小鼠學(xué)習(xí)記憶能力

Morris 水迷宮的定向航行實驗表明，雄性NIH稀毛小鼠在訓(xùn)練第3 天逃避潛伏期比正常雄性NIH小鼠顯著降低，同時雌性NIH 稀毛小鼠比正常雌性小鼠極顯著降低（圖3B）。第3 天學(xué)習(xí)時雌性NIH稀毛小鼠比正常NIH 小鼠的游動距離顯著降低，這是因為游行時間縮短（圖3A）?？臻g探索實驗表明，NIH 稀毛小鼠比正常NIH 小鼠進(jìn)入目標(biāo)象限次數(shù)顯著增加（圖4B）。其中在目標(biāo)象限的游動時間和游動距離方面，雄性NIH 稀毛小鼠所占的比例高于正常NIH 小鼠，且差異顯著（圖4C，D）。

圖3 定向航行實驗結(jié)果

圖4 空間探索實驗

3 討論

迄今為止，一些無毛小鼠品系已被用于研究免疫反應(yīng)、腫瘤發(fā)生、皮膚發(fā)育及其他問題，其中一些最為常用的品系如SKH1 等。自發(fā)稀毛突變的小鼠是研究毛囊發(fā)育和毛發(fā)生長的重要的動物模型。皮膚作為人體的第一道免疫屏障，其功能與全身免疫系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)和內(nèi)分泌系統(tǒng)密切相關(guān)。NIH 稀毛小鼠作為一種新型的自發(fā)突變的實驗動物，可以為挑選疾病動物模型提供一種新的選擇。但是目前為止對NIH 稀毛小鼠的研究極少，其生物學(xué)特性還尚不確定，為此我們對NIH 稀毛小鼠的部分生物學(xué)特性進(jìn)行了研究。本課題從遺傳規(guī)律、保種方式、內(nèi)分泌系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)等方面入手，對NIH 稀毛小鼠進(jìn)行了初步了解。

在這之前有研究表明，NIH 稀毛小鼠在P7 和P42 時，毛發(fā)稀疏，特征明顯。我們的研究結(jié)果也支持這一觀點，在P7，P42 時NIH 稀毛小鼠表型為無毛、無胡須，與NIH 正常小鼠差異顯著，并能輕易區(qū)分。無毛小鼠非常適合進(jìn)行傷口愈合研究，因為正常小鼠需要脫毛可能造成二次創(chuàng)傷，并且毛發(fā)的再生會掩蓋傷口，導(dǎo)致傷口的愈合情況不容易直接觀察。糖尿病一個明顯特征就是傷口愈合緩慢。糖耐量實驗是識別糖耐量受損的唯一方法，也是判斷糖尿病患者的重要方法。根據(jù)給藥途徑的不同，可以分為口服葡萄糖耐量試驗（OGTT）和腹腔內(nèi)葡萄糖耐量實驗（IGTT）兩類。Andrikopoulos 曾研究了不同給藥途徑以及不同禁食時間對小鼠GTT 實驗的影響，結(jié)果表明GTT 可用來識別糖耐量受損和糖尿病。為了研究該NIH 稀毛小鼠血糖是否正常以及是否適用于建立糖尿病疾病模型，本研究進(jìn)行了葡萄糖耐量實驗和胰島素耐量實驗。結(jié)果顯示，NIH 稀毛小鼠腹腔注射葡萄糖后15 min 血糖值顯著低于正常小鼠，糖耐量增高，但是胰島功能是正常的。這提示NIH 稀毛小鼠可能存在糖代謝異常，其糖代謝異常的機(jī)制尚不明確，需要將其作為糖尿病模型的時候值得注意。

生物發(fā)光成像(BLI)是一種監(jiān)測小鼠大腦基因表達(dá)時空動態(tài)的強大技術(shù)。然而，在小鼠發(fā)育和日常檢查期間，脫毛后的黑毛、皮膚色素沉著和毛發(fā)再生干擾了BLI。先前有研究表明，在成人的大腦和皮膚中都可以檢測到Hr mRNA 的高表達(dá)。Morris水迷宮實驗是一項對嚙齒類動物的空間學(xué)習(xí)測試，并且已被證明是一項與海馬突觸可塑性和NMDA 受體功能密切相關(guān)的可靠測試。Duan、Ebrahimpour還有Chen 等通過Morris 水迷宮實驗，研究了小鼠在水迷宮路線的長度和老鼠找到站臺所需的時間與小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的關(guān)系。結(jié)果證明，隨著訓(xùn)練次數(shù)的增多，小鼠表現(xiàn)出了一定的空間學(xué)習(xí)能力。為了確定NIH 稀毛突變是否會對腦組織以及神經(jīng)發(fā)育產(chǎn)生影響進(jìn)而影響其作為神經(jīng)認(rèn)知有關(guān)的動物模型的價值，本研究進(jìn)行了Morris 水迷宮實驗來檢驗稀毛小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。研究結(jié)果顯示NIH 稀毛小鼠的學(xué)習(xí)能力較正常小鼠顯著增強，且NIH 稀毛小鼠記憶力的增強與性別無關(guān)，雄性和雌性的NIH稀毛小鼠均有所升高。然而Hr 基因突變是否與海馬神經(jīng)突觸有關(guān)以及影響小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的相關(guān)機(jī)制需要進(jìn)一步研究。

NIH 稀毛小鼠是一種新型的自發(fā)突變的小鼠。因為其毛發(fā)稀疏、無胡須的表型而受到研究人員的關(guān)注。在本研究中，確定NIH 稀毛小鼠符合孟德爾遺傳定律中單基因控制的，且根據(jù)近交系的交配法則，獲得了性狀顯著且穩(wěn)定遺傳的種群。葡萄糖耐量實驗和胰島素耐量實驗證明了NIH 稀毛小鼠與NIH 正常小鼠相比，糖耐量增高，代表其糖代謝受損或存在內(nèi)分泌異常，但是胰島素敏感性沒有明顯改變。Morris 水迷宮實驗證明了NIH 稀毛小鼠擁有一定的學(xué)習(xí)記憶能力。通過本次研究，明確了NIH 稀毛小鼠的部分生物學(xué)特性，為其近一步運用于生物發(fā)光成像、動物皮膚病模型、腫瘤模型等提供了新的模型。