花椒麻味素含量兩種檢測方法之比較

胡昕雨，溫向春，雷曉紅，紀(jì)道丹，單聰聰，王曉燕，王衛(wèi)利，李菲菲*，李孟樓

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)林學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.華州林業(yè)局，陜西 渭南 714100)

花椒(Zanthoxylumbungeanum)為蕓香科花椒屬香料樹種，我國約有約有 50 種、13 個變種、2 個變型[1]，主要分為青花椒和紅花椒2種類型[2]?；ń饭麑嵉幕钚曰瘜W(xué)成分復(fù)雜，主要有酰胺、揮發(fā)油、木質(zhì)素、生物堿、香豆素、黃酮、甾醇、脂肪酸、三萜和烴類等[3]，其中麻味成分酰胺類物質(zhì)又稱花椒麻味素(總酰胺)，是一系列結(jié)構(gòu)相似的鏈狀不飽和脂肪酸酰胺及其他連有芳環(huán)的酰胺[4]。

花椒麻味素的提取方法有水提法、有機(jī)溶劑提取法和超臨界提取法等[5-7]，花椒麻味素成分分析和含量檢測方法主要有高效液相色譜法(HPLC)[8]、薄層層析法[9]、紫外分光光度計法[10]、甲法滴定法[11]等。為比較不同檢測方法的優(yōu)缺點，并選擇較優(yōu)提取法，本文采用無水乙醇提取花椒麻味素，對甲醛滴定法[11]和凱氏定氮法麻味素檢測方法進(jìn)行了比較研究，結(jié)果如下。

1 材料與方法

1.1 樣品、主要試劑和儀器

樣品：韓城大紅袍、華州黃蓋、華州大紅袍成熟果品，均采摘于8月上旬。

主要試劑有：鄰苯二甲酸氫鉀，1 mol·l-1氫氧化鈉溶液，95%乙醇，18%甲醛溶液，75%濃硫酸溶液，準(zhǔn)確標(biāo)定0.091 3 mol·l-1氫氧化鈉溶液，18%(1+1)除酸甲醛，酚酞指示劑，甲基紅指示劑，顆粒狀活性炭，蒸餾水。

儀器有：CHJ-1磁力恒溫攪拌器，KQ-100數(shù)控超聲波清洗器，電子天平，RE-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，PHS-3B酸度計，300 ml-1/14*2球型冷凝器。全自動凱氏定氮儀。

1.2 測定方法

提?。簩⒒ń饭ご蛩?，稱取10 g(T)粉末放入500 ml容量瓶中，加入100 ml 95%乙醇浸泡10 h，在50 ℃下超聲提取2.5 h，過濾后經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮。使用20～30 ml 50%乙醇溶解浸膏，緩慢加入20 ml 50%濃硫酸，100 ℃下在磁力攪拌器下反應(yīng)30 min。反應(yīng)完全后，加入7 g活性炭，100 ℃下用球型冷凝器加熱脫色30 min，趁熱過濾，用蒸餾水定容至250 ml備用。

甲醛滴定法：按參考文獻(xiàn)[11]方法和步驟，即取上述定容溶液50 ml放入250 ml錐形瓶中，加入2～3滴甲基紅指示劑，用1 mol·l-1NaOH溶液滴定至pH值約等于6，除去濾液中剩余的酸；加入10 ml 18%(1+1)除酸甲醛、2～3滴酚酞指示劑，充分混勻后靜置反應(yīng)5 min，再用準(zhǔn)確標(biāo)定的0.091 3 mol·l-1NaOH溶液滴定，使得PHS-3B酸度計測定pH值約等于9，記錄所需溶液體積(V)。以上步驟重復(fù)3次。

凱氏定氮儀法：取上述定容溶液10 ml測定氮含量，直接稱取花椒粉末樣測定氮含量，每品種樣品均重復(fù)3次。

1.3 含量計算

甲醛滴定法中總酰胺Q按照文獻(xiàn)中的方法計算[11]，即：

式中Vi為滴定待測液pH值為9時所需NaOH體積，C為標(biāo)定的NaOH濃度，T為花椒粉末質(zhì)量。

凱氏定氮儀法中花椒總氮含量計算式為：

式中Wi為凱氏定氮儀含氮量讀數(shù)，總酰胺含量由Q與W的相關(guān)模型計算。

2 結(jié)果與分析

2.1 三個來源地花椒麻味素含量檢測結(jié)果

甲醛法測定表明，花椒麻味素含量華州黃蓋>韓城大紅袍>華州大紅袍，其測定值分別為(10.4182±0.5362)、(9.9809±0.7279)、(9.5856±0.094)mg·g-1，麻味素含量華州黃蓋花椒、韓城大紅袍分別較華州大紅袍高約8.69%、4.12%(表1)。表1顯示，甲醛法測定值平均為定氮儀法氮含量的19.56倍，用系數(shù)19.56將氮含量矯正為麻味素含量后，t測驗表明矯正值與甲醛法測定值間差異顯著，即不能采用常數(shù)19.56對定氮儀法測定的氮含量進(jìn)行矯正。

2.2 相同試樣、兩種測定方法結(jié)果的比較

定氮儀法測定的氮含量與甲醛法測定的麻味素值間有線性正相關(guān)性，即定氮儀法氮含量高、甲醛法測定的麻味素也高。由其分布趨勢可知，將定氮儀法氮含量矯正至麻味素含量時不能利用常數(shù)19.56直接矯正，應(yīng)利用其相關(guān)模型進(jìn)行矯正(圖1)。

圖1 花椒提取物N含量與麻味素含量的分布趨勢

因此，利用y′=2.3839x+8.8147模型將氮含量矯正為麻味素含量y′(表1)。t測驗表明，在P>0.05水平上，華州黃蓋和韓城大紅袍的y′值與y值間無差異；但華州大紅袍的y′值與y值間P≈0.05，表明兩種方法測定的華州大紅袍花椒麻味素含量有差異，但差異不顯著(表2)。說明采用相對簡單、容易操作的定氮儀法測定乙醇提取物的氮含量，也能夠計算出花椒麻味素含量。

表1 三個來源地花椒麻味素含量檢測結(jié)果(乙醇提取物)

表2 y′值與y值間的t檢驗結(jié)果

2.3 花椒粉末樣中麻味素含量的直接測定結(jié)果

定氮儀法檢測花椒粉末樣中的N含量x′，x′值遠(yuǎn)大于上述甲醛法測定的麻味素含量y值，但麻味素含量高的花椒品種其比值x′/y則小, 品種內(nèi)各重復(fù)間的比值x′/y幾乎無差異，說明花椒樣的N含量與麻味素含量由正相關(guān)關(guān)系(表3)。

建立x′與y的關(guān)聯(lián)模型，由模型可將N含量x′轉(zhuǎn)換為麻味素含量y″，華州黃蓋y″值>韓城大紅袍>華州大紅袍(圖2，表3)。按照上述方法對y″平均數(shù)與y值t測驗表明，在P>0.05水平上y″平均數(shù)與y間無差異。說明直接檢測花椒粉末樣的N含量，利用關(guān)系式y(tǒng)″=0.0151x′2-1.0216x′+26.8190即可計算出花椒樣品中麻味素含量。

圖2 花椒粉末樣N含量與麻味素含量的關(guān)系

表3 定氮儀法對花椒粉末樣中麻味素y″含量的測定結(jié)果

3 結(jié)論與討論

傳統(tǒng)的甲醛法與定氮儀法測定花椒麻味素含量結(jié)果表明，花椒乙醇提取物中N含量(x)與麻味素含量(y′)的關(guān)聯(lián)式為y′=2.3839x+8.8147，麻味素甲醛法測定值y與計算值y′無顯著差異；花椒粉末樣中N含量(x′)與麻味素含量(y″)的關(guān)聯(lián)式為y″=0.0151x′2-1.0216x′+26.8190，甲醛法測定值y與計算值y″無顯著差異。說明，可用定氮儀法間接測定花椒中的麻味素含量，但必須用關(guān)聯(lián)式將N含量轉(zhuǎn)換為麻味素含量。

本研究比較甲醛法與定氮儀法測定花椒麻味素含量時，測定了3個來源地花椒麻味素含量，結(jié)果為韓城大紅袍麻味素含量為(9.9809±0.7279)mg·g-1、高于文獻(xiàn)報道的(8.1165±0.05073)mg·g-1[11]；其原因在于本次測定樣品采集于8月中旬，而文獻(xiàn)中的樣品采摘于7月底。由此可見，花椒采摘時間不同，果實中積累的麻味素含量也不同。

花椒麻味素含量測定技術(shù)包括高效液相色譜法、紫外分光光度計法和甲醛滴定法[10-12]。其中，高效液相色譜法對麻味素含量的檢測精準(zhǔn)度高于紫外分光光度計法，兩者均要求有麻味素標(biāo)準(zhǔn)樣；甲醛滴定法測定麻味素含量的精度雖然低于高效液相色譜法，但不需要麻味素標(biāo)準(zhǔn)樣。本研究以定氮儀法測定花椒中的N含量，再以其與麻味素的關(guān)聯(lián)模型換算麻味素含量，同樣也不需要麻味素標(biāo)準(zhǔn)樣；定氮儀法儀器檢測結(jié)果更精確、步驟更少、操作更容易，降低了甲醛滴定法中靠觀察讀數(shù)產(chǎn)生的誤差。本研究檢測的花椒品種只有3種，所建立的花椒粉末樣N含量與麻味素關(guān)聯(lián)模型是否具有普遍的實用性還待驗證。此外，在測定花椒粉末樣N含量時，發(fā)現(xiàn)若粉末樣品質(zhì)量大于0.5 g，在硫酸消化過程中極易炭化，對后續(xù)N含量的檢測造成影響；因此為快速、準(zhǔn)確測定花椒粉末樣的N含量，還需要詳細(xì)研究花椒粉末樣的適宜用量。