胃癌差異表達(dá)miRNA及其相關(guān)基因的單核苷酸多態(tài)性與胃癌預(yù)后的相關(guān)性研究

呂燕萍，吳傳城，楊雙鳳，何陳周，韓仁杰，顏 偉，劉寶英，

(1．福建醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，福建 福州350108；2．福建省莆田市仙游縣總醫(yī)院，福建莆田 351200)

胃癌是全球范圍內(nèi)死亡率最高的消化道腫瘤，美國癌癥學(xué)會最新數(shù)據(jù)表明，2018年全球胃癌新發(fā)病例100萬，死亡病例約78.3萬[1]。我國是胃癌大國，前期研究發(fā)現(xiàn)福建省仙游縣2014～2018 年全死因調(diào)查發(fā)現(xiàn)胃癌死亡率居惡性腫瘤死亡率之首，達(dá)36.20/10 萬，明顯高于全國一般水平(21.48/10萬)。因此，迫切需要尋找有效的生物標(biāo)志物去準(zhǔn)確診斷和精準(zhǔn)預(yù)測胃癌預(yù)后，切實(shí)降低胃癌的發(fā)病率和死亡率。

微小RNA(microRNA，miRNA)是一類高度保守的、長度為16～29 nt的內(nèi)源性非編碼小RNA，大量研究發(fā)現(xiàn)其異常表達(dá)可影響癌基因表達(dá)及癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲能力、促進(jìn)化療耐藥等，有望成為胃癌的生物標(biāo)志物及預(yù)后指標(biāo)之一[2-5]。單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)是主要遺傳因素之一，miRNA 及其相關(guān)基因的SNPs 可能會影響miRNA的調(diào)控作用進(jìn)而改變癌癥的進(jìn)展，產(chǎn)生不同的致癌作用[6]。miRNA 及其相關(guān)基因SNPs 數(shù)量多，涉及范圍廣，其中主要包括miRNA 自身、miRNA 靶序列、miRNA 生物合成通路基因以及其他相關(guān)的SNPs 位點(diǎn)。前期研究已發(fā)現(xiàn)，miRNA靶序列EGFR基因3′非翻譯區(qū)的rs884225 多態(tài)性位點(diǎn)與賁門癌發(fā)生存在關(guān)聯(lián)，可能是胃癌患者的特異性生物標(biāo)志物[7-8]。然而目前關(guān)于miRNA及其相關(guān)基因SNPs與胃癌病人預(yù)后的相關(guān)性研究還較少，研究范圍也較窄，具體的機(jī)制也還不甚了解。本研究通過Affymetrix公司SNP芯片結(jié)合生物信息學(xué)分析全面系統(tǒng)的挖掘與胃癌關(guān)系密切的差異miRNA相關(guān)SNPs，采用病例-病例研究進(jìn)一步探討胃癌差異表達(dá)的miRNA及其相關(guān)基因SNPs與胃癌預(yù)后的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 研究對象

胃癌病例來源于福建省仙游縣醫(yī)院的胃癌新發(fā)病例。病例組納入標(biāo)準(zhǔn)為：經(jīng)手術(shù)或內(nèi)窺鏡取得組織標(biāo)本，經(jīng)病理確診的新發(fā)病例；確診日期為2013年4月—2014年3月；在仙游本地居住10年以上。芯片組納入標(biāo)準(zhǔn)是在此基礎(chǔ)上選擇男性，年齡50～70 歲之間，經(jīng)病理確診為胃腺癌的患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)病理確診為胃部炎癥、良性病變及病情危重或不能清晰回答問題者及腫瘤繼發(fā)病例和復(fù)發(fā)病例。芯片健康對照組納入標(biāo)準(zhǔn)：按性別、年齡、地區(qū)與病例進(jìn)行配對，選擇年齡±3 歲、在仙游本地居住10 年以上者與病例進(jìn)行配對。排除標(biāo)準(zhǔn)為：胃癌或慢性萎縮性胃炎的直系家屬。

以上研究對象均簽署了知情同意書，采集5 mL外周血，EDTA 抗凝，研究通過福建醫(yī)科大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究倫理委員會的審查及批準(zhǔn)。最后SNP芯片篩選階段我們納入96 例胃癌患者和96 例對照，均為男性，年齡分布在52～71 歲之間。其中病例組平均年齡(63.8±4.6)歲，對照組平均年齡(63.8±4.7)歲。

1.2 DNA提取

所采集的外周血由Affymetrix 公司提取基因組DNA，抽取的血樣置于EDTA 抗凝管，3 000 r/min離心10 min 后，分裝成血漿、白細(xì)胞、紅細(xì)胞，置-80 ℃低溫冰箱保存。

1.3 miRNA及其相關(guān)基因SNPs篩選

本研究基于Axiom?2.0 Precision Medicine Research Array(PMRA 芯片)、生物信息學(xué)方法以及公用數(shù)據(jù)庫全面系統(tǒng)挖掘胃癌差異表達(dá)的miRNA相關(guān)SNPs。

1.3.1 miRNA 自身多態(tài)性位點(diǎn)選擇以SNP 芯片注釋數(shù)據(jù)庫為基礎(chǔ)，篩選出所有miRNA 相關(guān)的SNPs 位點(diǎn)并進(jìn)行卡方檢驗，選取病例組和對照組中表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)的位點(diǎn)。進(jìn)一步將篩選出的miRNA SNPs 位點(diǎn)逐一在單核苷酸多態(tài)性數(shù)據(jù)庫(dbSNP)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/)查詢對應(yīng)位點(diǎn)是否明確注釋為miRNA自身SNPs。

1.3.2 miRNA 靶基因多態(tài)性位點(diǎn)選擇進(jìn)入MirSNP數(shù)據(jù)門戶主頁(http://bioinfo.bjmu.edu.cn/mirsnp/download/)，選擇“MirSNPInTarget.txt”，將含有miRNA靶基因SNPs的數(shù)據(jù)匯總，與芯片數(shù)據(jù)取交集，最后選取其中病例組和對照組中表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)的位點(diǎn)。

1.3.3 miRNA 合成通路基因多態(tài)性位點(diǎn)選擇針對miRNA 合成通路涉及的11 個主要基因(DROSHA、DGCRB、XPOS、RAN、DICER、TRBP、AGO1、AGO2、GEMIN3、GEMIN4、HIWI)，利用dbSNP數(shù)據(jù)庫選取這些基因功能性SNPs，納入位點(diǎn)條件如下：①編碼區(qū)SNP(同義突變的SNP 和錯義突變SNP)和調(diào)控區(qū)域SNP(5′側(cè)翼區(qū)、5′UTR 和 3′UT)；②中國人群最小等位基因頻率(minor allele frequency，MAF)在 0.05～0.45 之間。與芯片數(shù)據(jù)取交集，并根據(jù)在病例組和對照組中表達(dá)是否有差異，篩選出差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)的SNPs。

1.3.4 二次篩選將上述篩檢出的miRNA 自身SNPs、 miRNA 靶 序 列 SNPs 及 miRNA 合 成 通 路 相 關(guān)SNPs再結(jié)合文獻(xiàn)報道和生物信息學(xué)分析，進(jìn)一步篩選與胃癌關(guān)系最密切的miRNA-SNPs，篩選條件為：①根據(jù)dbSNP 數(shù)據(jù)庫查找各SNPs 位點(diǎn)在中國人群中的MAF，選擇MAF 范圍在0.15～0.40 之間的位點(diǎn)；②結(jié)合PubMed 網(wǎng)站篩選與消化道腫瘤相關(guān)的位點(diǎn)，并根據(jù)功能性單核苷酸多態(tài)性數(shù)據(jù)庫(F-SNP)網(wǎng)站篩選有相應(yīng)功能的位點(diǎn)。

1.4 miRNA基因分型原理與方法

將篩選得到的11 個SNPs 位點(diǎn)進(jìn)行基因分型，使用 Sequenom 公 司 Genotyping Tools 及 MassARRAY Assay Design 軟件設(shè)計待測SNP 位點(diǎn)的PCR 擴(kuò)增引物及單堿基延伸引物。通過基質(zhì)輔助激光解吸附電離飛行時間質(zhì)譜分析質(zhì)譜技術(shù)(MALDI-TOF-MS)，檢測延伸產(chǎn)物相對分子質(zhì)量，應(yīng)用專用的分析軟件，通過判斷分子大小的差異而進(jìn)行SNP的基因分型檢測。

1.5 現(xiàn)場流行病學(xué)調(diào)查

采用統(tǒng)一編制的調(diào)查表，由經(jīng)過培訓(xùn)并且考察合格的當(dāng)?shù)蒯t(yī)生對胃癌患者或(和)家屬解釋調(diào)查目的，取得病人家屬的同意后，進(jìn)行面對面的訪談式調(diào)查。調(diào)查內(nèi)容主要包括患者的病情和治療情況，如病理類型、大體分型、TNM分期、治療措施等；生活質(zhì)量情況，如吸煙、喝酒、飲茶、睡眠、康復(fù)鍛煉等；飲食習(xí)慣，如飲食量、次數(shù)、飲食結(jié)構(gòu)、使用腌制食品等。如患者已死亡，則由家屬配合調(diào)查。

1.6 質(zhì)量控制

基因型的檢測與判讀采用盲法?，F(xiàn)場流行病學(xué)調(diào)查通過統(tǒng)一培訓(xùn)調(diào)查員、制作調(diào)查員手冊、嚴(yán)格審核調(diào)查員；資料整理通過復(fù)核、雙錄入、邏輯糾錯、一致性檢驗、隨訪復(fù)查、數(shù)據(jù)分層分析、調(diào)整等方式來控制混雜因素對研究結(jié)果的影響。此外，本研究的患者病例資料來自醫(yī)院病案室存檔信息，由醫(yī)院病理科主任協(xié)助判定病理結(jié)果。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

采用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS 24.0 進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，利用壽命表法得出同一多態(tài)性位點(diǎn)不同基因型第1、3、5 年的生存率，通過Kaplan-Meier 法取得同一位點(diǎn)不同基因型患者的中位生存時間(中位生存時間)，logrank 檢測法主要用于對比兩個或多個基因模型對胃癌預(yù)后的影響，單因素和多因素COX回歸分析用于計算風(fēng)險比(hazard rate，HR)及其95%置信區(qū)間(95%confidence intervals，95%CI)以及調(diào)整混雜因素。聯(lián)合分層分析時，將胃癌患者按照年齡和TNM分期進(jìn)行分層再進(jìn)一步進(jìn)行生存分析?；蚵?lián)合作用分析時，按照患者攜帶的不良基因型數(shù)量進(jìn)行分組后再進(jìn)行分析。所有結(jié)果的P值選用雙側(cè)檢驗，統(tǒng)計學(xué)檢驗水準(zhǔn)α均設(shè)定為0.05。

2 結(jié)果

2.1 miRNA及其相關(guān)基因SNPs篩檢結(jié)果

芯片注釋數(shù)據(jù)庫中共包括47 960 個與miRNA 相關(guān)的SNPs位點(diǎn)，病例組和對照組中有差異的miRNASNPs有1 104個，最后經(jīng)dbSNP查詢后注釋為miRNA自身 SNPs 有 12 個。MirSNP 數(shù)據(jù)庫共包含 234 573 個miRNA靶序列SNPs，與芯片中的位點(diǎn)取交集，得到芯片中涉及miRNA靶序列SNPs共4 089個，最終篩選出病例組和對照組中99 個差異性表達(dá)的miRNA 靶基因SNPs。根據(jù)dbSNP數(shù)據(jù)庫檢索人類基因組中miRNA生物合成通路相關(guān)基因SNPs共142個，與芯片中的位點(diǎn)取交集，得到芯片中涉及miRNA 生物合成通路相關(guān)SNPs共10個，最后篩選出1個病例組與對照組有統(tǒng)計學(xué)差異的位點(diǎn)。

上 述 篩 檢 到 的 12 個 miRNA 自 身 SNPs、 99 個miRNA 靶序列 SNPs 以及 1 個 miRNA 生物合成通路基因相關(guān)SNPs，進(jìn)一步結(jié)合文獻(xiàn)報道和生物信息學(xué)分析，最終篩選得到11 個miRNA 及其相關(guān)基因的SNPs位點(diǎn)(見表 1)。

2.2 基本情況

本次研究共發(fā)出問卷401 份，其中因家遷往外地調(diào)查困難、拒絕調(diào)查者49例，剔除不完整、不合格的問卷8 份，最終納入本研究的共344 人。其中，男性患者共253 例，女性患者為91 例，年齡36～96 歲，第1、3、5 年生存率分別為73.47%、45.71%、39.67%，中位生存時間為30.73 月。對胃癌患者的一般情況與預(yù)后的相關(guān)性進(jìn)行生存分析檢驗，結(jié)果見表2，表明胃癌患者的年齡、TNM分期、手術(shù)與否均與胃癌預(yù)后相關(guān)(P＜0.05)。

2.3 miRNA 及其相關(guān)基因的單核苷酸多態(tài)性與胃癌預(yù)后的關(guān)系

2.3.1 單因素分析單因素分析結(jié)果見表3、4。等位基因模型統(tǒng)計分析結(jié)果顯示，攜帶miR-1297 多態(tài)性位點(diǎn)rs9536676的A突變基因的胃癌患者相對于攜帶野生型基因G的患者生存率較低(P＜0.05)。隱性模型統(tǒng)計分析結(jié)果顯示，MSH2的多態(tài)性位點(diǎn)rs17502941 基因型為GG 的胃癌患者比基因型為AA/AG 的患者生存率降低(P＜0.05)，其他位點(diǎn)對應(yīng)基因型的生存率差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。

表2 胃癌患者的一般情況與預(yù)后關(guān)系

2.3.2 多因素分析將上述有統(tǒng)計學(xué)意義的位點(diǎn)納入到多變量逐步COX回歸分析中，步進(jìn)概率按照進(jìn)入標(biāo)準(zhǔn)為0.05，除去標(biāo)準(zhǔn)為0.10，結(jié)果顯示，是否手術(shù)、TNM 分期、rs17502941 AA/AG 均是影響胃癌預(yù)后的獨(dú)立因素，其中，rs17502941隱性模型中的突變型GG相較于AA/AG 而言為影響胃癌預(yù)后的獨(dú)立危險因素(P＜0.05，見表5)。

表1 SNP芯片結(jié)合生物信息學(xué)分析篩選出的miRNA及其相關(guān)基因SNPs

表3 miR-1297的多態(tài)性位點(diǎn)rs9536676與胃癌預(yù)后的相關(guān)性

表4 MSH2的多態(tài)性位點(diǎn)rs17502941與胃癌預(yù)后的相關(guān)性

2.3.3 miRNA 及其相關(guān)基因的各多態(tài)性位點(diǎn)與胃癌預(yù)后的分層分析按年齡TNM分期聯(lián)合分層后：共顯性模型統(tǒng)計分析結(jié)果顯示，miR-1297 的多態(tài)性位點(diǎn)rs9536676 基因型AG 對＞65 歲的晚期胃癌患者是危險因素；miR-379 的多態(tài)性位點(diǎn)rs7143252 CG/GG 基因型對≤65 的晚期胃癌患者是保護(hù)因素；miRNA-519b的多態(tài)性位點(diǎn)rs10413288 GT/GG基因型對≤65歲的晚期胃癌患者是保護(hù)因素；FAS的多態(tài)性位點(diǎn)rs1468063 CT基因型對≤65歲的晚期胃癌患者是危險因素。顯性模型統(tǒng)計分析結(jié)果顯示，miR-1297 的多態(tài)性位點(diǎn)rs9536676 AG/AA 基因型對＞65 歲的晚期胃癌患者是危險因素；miR-379 的多態(tài)性位點(diǎn)rs7143252 CG/GG基因型對≤65的晚期胃癌患者是保護(hù)因素；miR-519b的多態(tài)性位點(diǎn)rs10413288 GT/GG基因型對≤65歲的晚期胃癌患者是保護(hù)因素；FAS的多態(tài)性位點(diǎn)rs1468063 CT/TT基因型對≤65歲的晚期胃癌患者是危險因素。隱性模型統(tǒng)計分析結(jié)果顯示，miRNA-519b 的多態(tài)性位點(diǎn)rs10413288 GG 基因型對≤65 歲的晚期胃癌患者是危險因素，而對＞65 歲的晚期胃癌患者是保護(hù)因素。其余多態(tài)性位點(diǎn)均無明顯差異，詳見表6～10。

表5 胃癌患者生存的逐步COX回歸分析

2.3.4 基因聯(lián)合作用根據(jù)以上分析，多態(tài)性位點(diǎn)rs9536676(AA/AG)、 rs7143252(CC)、 rs10413288(AA)、rs17502941(GG)、rs10277413(TT)、rs1468063(CC)為導(dǎo)致胃癌預(yù)后較差的基因型。為進(jìn)一步探知SNPs之間可能的交互作用，構(gòu)建新變量，具體見表11，結(jié)果顯示 同 時 攜 帶 rs9536676 和 rs10413288、 rs9536676 和rs17502941、rs10413288 和 rs17502941 不良基因型的胃癌患者胃癌預(yù)后不良的風(fēng)險大(P＜0.05)，其余基因多態(tài)性位點(diǎn)均無明顯聯(lián)合作用。

表6 miR-1297的多態(tài)性位點(diǎn)rs9536676與胃癌預(yù)后的分層分析

表7 miR-379的多態(tài)性位點(diǎn)rs7143252與胃癌預(yù)后的分層分析

表8 miRNA-519b的多態(tài)性位點(diǎn)rs10413288與胃癌預(yù)后的分層分析

表9 EGFR基因的多態(tài)性位點(diǎn)rs10277413與胃癌預(yù)后的分層分析

表10 FAS基因的多態(tài)性位點(diǎn)rs1468063與胃癌預(yù)后的分層分析

3 討 論

miRNA 的SNPs 可以通過調(diào)節(jié)Pri-miRNA 轉(zhuǎn)錄、影響Pri-miRNA 到Pre-miRNA 的加工、成熟進(jìn)而導(dǎo)致miRNA的異常表達(dá)。當(dāng)miRNA靶序列相關(guān)的基因出現(xiàn)變異，也可能使得miRNA 與靶基因mRNA 配對出錯，繼而使原本受調(diào)控的靶mRNA 失去結(jié)合能力，或原本不受調(diào)控的mRNA 成為新的結(jié)合靶點(diǎn)，最終作用于疾病的形成和發(fā)展進(jìn)程。本研究發(fā)現(xiàn)了6個miRNA 相關(guān)SNPs 與胃癌預(yù)后相關(guān)，即miR-1297 的多態(tài)性位點(diǎn)rs9536676、miR-379 的多態(tài)性位點(diǎn)rs7143252、miR-519b 的多態(tài)性位點(diǎn)rs10413288、MSH2基因的多態(tài)性位點(diǎn)rs17502941、EGFR基因的多態(tài)性位點(diǎn)rs10277413、FAS的多態(tài)性位點(diǎn)rs1468063。

miR-1297是近些年來發(fā)現(xiàn)的可抑制腫瘤的一種關(guān)鍵調(diào)控因素，其在胃癌組織中表達(dá)明顯下降，其表達(dá)異常影響AEG-1、PTEN、Meg3等基因進(jìn)而影響腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲作用[9-10]。miR-379 位于14q32.31，是多種腫瘤的抑制基因，其主要是通過靶向IGF-1R介導(dǎo)的AKT和ERK途徑或者作用于TCF來抑制癌細(xì)胞的增殖、浸潤、侵襲和轉(zhuǎn)移[11-12]，也可借助于靶向FAK/AKT 信號抑制胃癌轉(zhuǎn)移和上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)移[13]。miRNA-519b可作為抑癌因子，通過翻譯后抑制COX-2等調(diào)控因子表達(dá)而使細(xì)胞周期被阻滯在G2/M期，從而抑制細(xì)胞生長，阻礙腫瘤進(jìn)展[14]。

MSH2 是最重要的錯配修復(fù)蛋白，其相關(guān)基因?qū)蚪M保持穩(wěn)定起著至關(guān)重要的作用，錯配修復(fù)功能正常的胃癌患者腫瘤細(xì)胞分化程度高，不易出現(xiàn)淋巴轉(zhuǎn)移[15]。本研究發(fā)現(xiàn)其多態(tài)性位點(diǎn)rs17502941 突變基因型AA/AG均是影響胃癌預(yù)后的危險因素，可能是當(dāng)其發(fā)生突變，可使得基因的表達(dá)產(chǎn)物——錯配修復(fù)蛋白的表達(dá)量下降，DNA復(fù)制過程中的錯誤率增加，從而導(dǎo)致一些因癌癥而錯亂的基因無法得到及時的修復(fù)，可直接導(dǎo)致胃癌患者的生存時間減少[16]。

EGFR 即表皮生長因子受體，其相關(guān)基因在胃癌組織中表達(dá)增高，可以幫助腫瘤細(xì)胞逃離凋亡并促進(jìn)其增殖，還與腫瘤微血管生成有關(guān)[17]。本研究發(fā)現(xiàn)其多態(tài)性位點(diǎn)rs10277413 突變基因型GT/GG 對≤65 歲的晚期胃癌患者是保護(hù)因素，可能是當(dāng)其突變后，阻斷下游信號級聯(lián)的激活，使癌細(xì)胞增殖和分化進(jìn)程減緩，腫瘤細(xì)胞程序性死亡的量增多[18]。

FAS 是一種表達(dá)于細(xì)胞表面可誘發(fā)凋亡的蛋白，屬于死亡受體家族，與其配體結(jié)合可傳遞細(xì)胞死亡信號，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[19]。本研究發(fā)現(xiàn)其多態(tài)性位點(diǎn)rs1468063 CT/TT基因型對≤65歲的晚期胃癌患者是危險因素，可能是因為其基因多態(tài)性導(dǎo)致FAS相關(guān)因子表達(dá)異常，阻礙了轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合而使基因無法表達(dá)，此時，F(xiàn)AS 表達(dá)減少或增加，都可導(dǎo)致細(xì)胞增殖與凋亡平衡打破，從而促進(jìn)腫瘤的進(jìn)程，改變腫瘤的侵襲、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移程度[20]。

本研究發(fā)現(xiàn)了6個miRNA相關(guān)SNPs與胃癌預(yù)后的關(guān)系，也發(fā)現(xiàn)了胃癌病人兩個miRNA 相關(guān)SNPs 同時存在不利于預(yù)后的基因型。但基因多態(tài)性存在著種族、地區(qū)差異，基因檢測過程中的檢測技術(shù)、檢測方法的不同，也可能造成檢測結(jié)果的不同，故還需要在大樣本、多中心研究中進(jìn)一步驗證。