陶 燕,李蘭蘭,盧建中,劉善輝,付生軍,張 靜
(蘭州大學(xué)第二醫(yī)院,甘肅省泌尿系統(tǒng)疾病研究重點實驗室/甘肅省泌尿系臨床醫(yī)學(xué)中心,甘肅 蘭州 730030)
膀胱癌(bladder cancer,BLCA)是全球常見的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤之一。根據(jù)美國癌癥協(xié)會的統(tǒng)計,在美國膀胱癌預(yù)計占所有新發(fā)癌癥病例的5%,占所有癌癥死亡人數(shù)的3%;預(yù)計2020 年膀胱癌發(fā)病率占泌尿系癌癥的第2 位;膀胱癌患者的5 年存活率僅為14%[1]。膀胱癌一般分為兩類:淺表性膀胱癌和肌層浸潤性膀胱癌。盡管目前可用根治性膀胱切除術(shù)和新輔助化療治療膀胱癌,但由于其復(fù)發(fā)性高,預(yù)后依然比較差[2]。因此,迫切需要尋找對膀胱癌診斷和治療更有效的生物標志物。
近年來的研究發(fā)現(xiàn)叉頭轉(zhuǎn)錄蛋白O亞族(subfamily O of forkhead box transcription factors,F(xiàn)OXO)通過對轉(zhuǎn)錄過程的特異性激活參與調(diào)節(jié)細胞周期進程、能量代謝及腫瘤發(fā)生,F(xiàn)OXO 功能失調(diào)將導(dǎo)致細胞增殖失控和DNA 損傷積累,從而產(chǎn)生致癌作用[3]。其中FOXO3(或FOXO3a)是FOXO 亞家族中的重要成員之一,其與細胞凋亡、自噬、細胞周期、氧化應(yīng)激、細胞分化、機體代謝和免疫應(yīng)答等有重要關(guān)系[4]。研究表明FOXO3在多種腫瘤組織中異常表達,并與惡性腫瘤的不良預(yù)后密切相關(guān)[5-7]。本研究通過多種生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫挖掘FOXO3 在膀胱癌中的表達及相關(guān)信息,以探討其在膀胱癌中的表達及臨床意義。
通過GEPIA 基因表達譜動態(tài)分析數(shù)據(jù)庫(http://gepia.cancer-pku.cn/index.html)[8]分析 FOXO3 在膀胱癌中的表達情況。GEPIA 是基于癌癥基因組圖譜(TCGA)和GTEx項目的9 736個腫瘤樣本和8 587個正常樣本進行數(shù)據(jù)分析。通過GEPIA數(shù)據(jù)庫也可以進行一般的生存曲線分析,包括總生存率(overall survival,OS)和無疾病生存率(disease-free survival,DFS)。此外GEPIA 還可以分析目標基因與某些免疫檢查點基因表達的相關(guān)性。
利用UALCAN 數(shù)據(jù)庫(http://ualcan.path.uab.edu/)[9]分析FOXO3 在膀胱癌中的表達以及FOXO3 表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系。UALCAN 是一個有效的癌癥數(shù)據(jù)在線分析和挖掘的數(shù)據(jù)庫,主要是基于TCGA 數(shù)據(jù)庫中的相關(guān)癌癥數(shù)據(jù)進行分析。
通過TIMER 數(shù)據(jù)庫(https://cistrome.shinyapps.io/timer/)[10]中的基因模塊分析膀胱癌中FOXO3 表達與免疫細胞浸潤水平的相關(guān)性。TIMER 數(shù)據(jù)庫涵蓋了TCGA中的32種腫瘤,共計10 897個樣本。TIMER數(shù)據(jù)庫中分析的免疫細胞包括B 細胞、CD8+T 細胞、CD4+T細胞、中性粒細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞。
利用String數(shù)據(jù)庫探索蛋白間相互作用。String數(shù)據(jù)庫是由已知蛋白質(zhì)和預(yù)測蛋白質(zhì)之間相互作用的數(shù)據(jù)組成的數(shù)據(jù)庫,包括直接的相互作用和間接的相互作用。本研究通過使用String 數(shù)據(jù)庫分析FOXO3 蛋白-蛋白相互作用(protein-protein interaction,PPI),在數(shù)據(jù)庫中輸入“FOXO3”,物種類型選擇“Homo sapiens”,置信度選擇“Medium 0.400”,相互作用最大數(shù)選擇10。
利用GEPIA數(shù)據(jù)庫繪制生存曲線,兩組比較采用Log-rank 檢驗。通過GEPIA 數(shù)據(jù)庫基因分析工具中的Correlation 模塊,利用 Pearson、Spearman 和 Kendall 方法對給定的TCGA和GTEx表達數(shù)據(jù)進行成對基因表達相關(guān)分析。通過TIMER 數(shù)據(jù)庫中的Gene 模塊分析FOXO3基因與免疫浸潤水平的關(guān)系。以α=0.05為檢驗水準。
通過GEPIA 數(shù)據(jù)庫分析了FOXO3 在膀胱癌中的mRNA表達水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)FOXO3 mRNA在膀胱癌組織中的表達明顯低于正常膀胱組織(P<0.01,圖1)。
通過GEPIA數(shù)據(jù)庫分析了FOXO3與膀胱癌患者的預(yù)后關(guān)系,結(jié)果顯示FOXO3 高表達組患者總生存率(OS)和無疾病生存率(DFS)較FOXO3低表達組顯著降低(OS:HR=1.4,P<0.05;DFS:HR=1.5,P<0.05),見圖2,表明FOXO3 高表達與膀胱癌患者預(yù)后不良相關(guān)。
圖1 FOXO3 mRNA在膀胱癌中的表達
通過UALCAN 數(shù)據(jù)庫分析FOXO3 mRNA 表達水平與膀胱癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系,結(jié)果表明FOXO3在膀胱癌無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(N0)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(N1,N2,N3)的表達均顯著低于正常膀胱組織(P<0.01),見圖3。而 FOXO3 在 N0 與 N1、N2、N3 之間的表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義,這說明FOXO3在膀胱癌中的表達水平與腫瘤是否發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移并無顯著相關(guān)關(guān)系。
通過TIMER 數(shù)據(jù)庫分析得到FOXO3 表達與膀胱癌免疫細胞浸潤的相關(guān)性結(jié)果,表明FOXO3基因表達與細胞純度無明顯相關(guān)性,與B 細胞(r=0.133,P<0.05)、CD8+T細胞(r=0.262,P<0.01)、CD4+T細胞(r=0.12,P<0.05)、巨噬細胞(macrophages)(r=0.252,P<0.01)、中性粒細胞(neutrophils)(r=0.242,P<0.01)、樹突狀細胞(dendritic cells,DC)(r=0.162,P<0.01)的免疫浸潤水平呈顯著正相關(guān)(圖4)。這提示FOXO3 有可能參與膀胱癌細胞的免疫浸潤過程。
圖2 GEPIA數(shù)據(jù)庫分析FOXO3對膀胱癌患者總生存率和無疾病生存率的影響
圖3 FOXO3在膀胱癌中的表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系
同時我們收集了常見的40 多個免疫檢查點基因,通過GEPIA 數(shù)據(jù)庫的單基因分析工具中Correlation 模塊分析了FOXO3基因表達與膀胱癌中免疫檢查點基因表達水平的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)FOXO3基因與NRP1(r=0.16,P<0.01)、 CD200R1(r=0.17,P<0.01)、 CD276(r=0.096,P<0.05)、CD1604(r=0.17,P<0.05)4 個免疫檢查點基因的表達水平有顯著的正相關(guān)性(圖5)。
我們通過Sangerbox 單基因數(shù)據(jù)分析平臺,利用TCGA 的表達譜數(shù)據(jù)評估了5 個錯配修復(fù)系統(tǒng)(mismatch repairs,MMRs)基因:MLH1、MSH2、MSH6、PMS2、EPCAM突變與FOXO3基因表達的關(guān)系。結(jié)果顯示:在包括膀胱癌在內(nèi)的多數(shù)腫瘤中,F(xiàn)OXO3基因表達與MMRs基因的突變均呈現(xiàn)顯著正相關(guān)(P<0.05或P<0.01),圖6。
圖4 FOXO3表達與膀胱癌免疫細胞浸潤的關(guān)系
圖6 FOXO3表達與DNA錯配修復(fù)系統(tǒng)基因表達的相關(guān)性
String數(shù)據(jù)庫中使用PPI網(wǎng)絡(luò)分析,得到具有11個節(jié)點數(shù)的FOXO3 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(圖7),其中與FOXO3相 互 作 用 的 蛋 白 (score>0.900)包 括 AKT1、 SIRT1、EP300、 BCL2L11、 SOD2、 SGK1、 AKT2、 CREBBP、CDKN1B、SMAD4,大多數(shù)均參與細胞增殖、細胞凋亡、細胞自噬和細胞代謝等生理功能。
圖7 FOXO3蛋白相關(guān)的PPI網(wǎng)絡(luò)圖
膀胱癌具有較高的發(fā)病率和病死率,早期發(fā)現(xiàn)、診斷、治療和預(yù)后預(yù)測可以顯著改善患者的生命質(zhì)量。目前對膀胱癌的手術(shù)、放化療等綜合治療已獲得相當?shù)寞熜?,但存在手術(shù)治療復(fù)發(fā)率高、放療和化療不良反應(yīng)較大、放化療耐藥和轉(zhuǎn)移、預(yù)后差等問題,因此急需開展新的研究,發(fā)現(xiàn)有效的診斷標志物和診斷方法。
FOX轉(zhuǎn)錄因子家族通過對轉(zhuǎn)錄過程的特異性激活參與調(diào)節(jié)細胞周期進程、能量代謝及腫瘤發(fā)生[3]。在FOXO 亞家族中研究最多的是FOXO3,研究發(fā)現(xiàn)FOXO3的表達水平與多種腫瘤密切相關(guān)。與正常和良性腫瘤組織相比,高級別前列腺癌中FOXO3的表達和活性均受到抑制[11];AN等[12]發(fā)現(xiàn)SIRT1-AMPK/FOXO3信號通路在逆轉(zhuǎn)胃癌的化學(xué)抗性和腫瘤干細胞特性方面具有重要作用;LIU 等[13]發(fā)現(xiàn)FOXO3 可以通過抑制Nrf2/TR1 信號通路和增加細胞內(nèi)活性氧的水平來逆轉(zhuǎn)結(jié)腸癌對5-氟尿嘧啶的耐藥性;同時也有研究發(fā)現(xiàn)FOXO3高表達與膠質(zhì)母細胞瘤的進展有關(guān),且其預(yù)后較差[14]。
FOXO3與膀胱癌的相關(guān)研究日益受到關(guān)注。本研究通過GEPIA數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)FOXO3在膀胱癌組織的表達低于正常組織,這與相關(guān)文獻[15]通過免疫組織化學(xué)實驗得到的“FOXO3在膀胱癌組織中的表達低于其癌旁組織”結(jié)論是相符的。另外還有研究報道腫瘤抑制基因Nkx2.8通過上調(diào)FOXO3 的表達能夠抑制膀胱癌細胞的增殖[16];Polyphyllin I 可通過激活FOXO3 信號傳導(dǎo)途徑抑制膀胱腫瘤生長[17]。以上研究表明,F(xiàn)OXO3 信號途徑與膀胱癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),F(xiàn)OXO3在膀胱癌組織中低表達使其有望作為膀胱癌的診斷標志物。我們進一步利用GEPIA數(shù)據(jù)庫進行生存分析,發(fā)現(xiàn)膀胱癌患者中FOXO3高表達組患者總生存率和無疾病生存率較FOXO3低表達組顯著降低,提示其表達與患者預(yù)后密切相關(guān)。通過UALCAN數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)FOXO3在膀胱癌無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(N0)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(N1,N2,N3)之間的表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義,表明FOXO3在膀胱癌患者中的低表達與腫瘤是否發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移沒有特定的關(guān)系。
腫瘤免疫微環(huán)境在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中具有重要作用[18]。本研究利用TIMER數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)FOXO3基因表達與B細胞、CD4+T細胞、CD8+T細胞、樹突狀細胞、巨噬細胞和中性粒細胞的免疫浸潤水平均有顯著的正相關(guān)性,表明FOXO3有可能參與膀胱癌細胞的免疫浸潤過程。有文獻[19]報道FOXO1能促進B細胞的分化、增殖、存活,但FOXO3 對B 細胞的作用不大,這與數(shù)據(jù)庫的分析結(jié)果不一致,所以非常有必要深入研究FOXO3與這些免疫細胞浸潤水平的關(guān)系。進一步在GEPIA平臺分析發(fā)現(xiàn)在膀胱癌中FOXO3基因與NRP1、CD200R1、CD276、CD160這 4 個免疫檢查點基因的表達水平有顯著正相關(guān)性。因此關(guān)注FOXO3表達與免疫檢查點基因表達水平的關(guān)系可以為膀胱癌免疫治療提供新的方向。此外,MMRs 為細胞內(nèi)的錯配修復(fù)機制,該機制的關(guān)鍵基因功能喪失會導(dǎo)致DNA復(fù)制錯誤無法被修復(fù),進而導(dǎo)致較高的體細胞突變的產(chǎn)生[20]。我們利用TCGA 表達譜數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)FOXO3 表達與膀胱癌細胞中5 個錯配修復(fù)基因(MLH1、MSH2、MSH6、PMS2、EPCAM)突變有顯著正相關(guān)性。這也為FOXO3在膀胱癌的研究提供了新思路。
FOXO3 信號途徑參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程。我們使用String 數(shù)據(jù)庫預(yù)測與FOXO3 相互作用的蛋白,這些蛋白主要有AKT1、SIRT1、EP300、BCL2L11、SOD2、SGK1、AKT2、CREBBP、CDKN1B、SMAD4。其中,AKT 可抑制FOXO3 的轉(zhuǎn)錄活性,導(dǎo)致FOXO3向核外轉(zhuǎn)移并被泛素-蛋白酶體途徑降解,從而抑制前列腺癌細胞凋亡[21],表明靶向AKT 信號可以促進腫瘤細胞的凋亡。在膀胱癌中,microRNA-608可以通過激活A(yù)KT/FOXO3 信號誘導(dǎo)細胞周期阻滯于G1 期來抑制癌細胞的增殖[22]。此外,SIRT1 低表達與胃癌患者預(yù)后不良有關(guān),SIRT1 通過激活A(yù)MPK/FOXO3 信號途徑抑制腫瘤細胞化療耐藥[12];在乳腺癌細胞中過表達EP300能夠上調(diào)FOXO3的活性,從而增加細胞對拉帕替尼的敏感性[23];在前列腺癌細胞中,F(xiàn)OXO3位點的磷酸化可以抑制SGK1 誘導(dǎo)的細胞自噬和凋亡[24]。FOXO3與部分蛋白分子的關(guān)系是在非腫瘤模型中進行的,如在哺乳動物卵巢中,F(xiàn)OXO3通過促進卵巢顆粒細胞凋亡來調(diào)節(jié)卵泡閉鎖和卵泡生長,F(xiàn)OXO3表達下調(diào)會降低促凋亡因子BCL2L11 的mRNA 水平[25];在骨性關(guān)節(jié)炎模型中,F(xiàn)OXO3 過表達可誘導(dǎo)SOD2 和過氧化氫酶的表達,從而抑制軟骨損傷的發(fā)展[26];FOXO3還可通過激活CDKN1B(p27kip1)的表達來調(diào)節(jié)成年大鼠脊髓損傷后的再生[27]。膀胱癌中FOXO3與這些蛋白分子之間的相互作用鮮有報道,它們的具體作用機制需要進一步實驗驗證。
綜上所述,本研究通過對生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫的挖掘,發(fā)現(xiàn)FOXO3在膀胱癌組織中呈低表達,腫瘤患者中高表達與患者的不良預(yù)后密切相關(guān);FOXO3有可能參與膀胱癌細胞免疫浸潤過程,并與部分免疫檢查點基因的表達水平有顯著正相關(guān)性;FOXO3表達與DNA錯配修復(fù)基因的突變關(guān)系密切;FOXO3通過與其他蛋白的相互作用參與細胞增殖、凋亡、自噬和代謝等過程。這些表明FOXO3有望成為膀胱癌的診斷標志物和治療靶標。FOXO3作為一個潛在的抑癌基因,有必要深入研究該基因在膀胱癌中的作用機制和功能,以期為FOXO3在膀胱癌中的靶向治療提供理論基礎(chǔ)。