CD10蛋白在結(jié)直腸癌組織中的表達及其臨床意義

楊修遠，潘月龍

(1．泰州市人民醫(yī)院腫瘤科，江蘇 泰州225300；2．杭州市腫瘤醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，浙江杭州 310002)

腫瘤細胞的生長、浸潤和轉(zhuǎn)移是由腫瘤細胞、間質(zhì)細胞以及細胞外基質(zhì)共同作用的結(jié)果。腫瘤的生物學(xué)特性不僅是由癌基因和抑癌基因來調(diào)控，還依賴于由間質(zhì)形成的微環(huán)境的作用。CD10蛋白是一種細胞表面糖蛋白金屬結(jié)合酶，具有中性肽鏈內(nèi)切酶的功能，其作為一種腫瘤-間質(zhì)相互作用的參與因子，在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。CD10表達失調(diào)節(jié)可干擾細胞生長和分化調(diào)節(jié)，改變細胞間的信號通路[1]。其結(jié)構(gòu)與間質(zhì)基質(zhì)金屬蛋白酶相似，因此CD10 可改變細胞的微環(huán)境影響腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移潛能[2]。近年來CD10 在實體腫瘤中的應(yīng)用價值逐漸被挖掘，其與腫瘤預(yù)后及生物學(xué)行為密切相關(guān)，同時具有成為腫瘤藥物治療新靶點的潛力。

結(jié)直腸癌是常見的消化道惡性腫瘤，近年來發(fā)病率及死亡率呈上升趨勢?，F(xiàn)有研究普遍認(rèn)為癌組織CD10表達與多種腫瘤的不良預(yù)后及惡性生物學(xué)行為相關(guān)[3]，但亦有一些研究得出了相反結(jié)論[4]。因此，我們設(shè)計了本實驗，采用免疫組織化學(xué)的方法檢測CD10蛋白在結(jié)直腸癌組織中的表達強度及比例，并通過分析其與結(jié)直腸癌各臨床和病理特點之間的關(guān)系，來進一步了解CD10表達與結(jié)直腸癌發(fā)生及發(fā)展之間的關(guān)聯(lián)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本

收集杭州市腫瘤醫(yī)院2010年1月—2017年11月手術(shù)切除的結(jié)直腸癌組織石蠟包埋標(biāo)本78例，其中男49例，女29 例?；颊吣挲g30～96 歲，中位年齡66.5歲。所有標(biāo)本均經(jīng)病理證實，術(shù)前均未行放、化療。其中，右半結(jié)腸(包括升結(jié)腸、結(jié)腸肝曲和近端2/3 橫結(jié)腸)癌22例，左半結(jié)腸(包括遠端1/3橫結(jié)腸、結(jié)腸脾曲、降結(jié)腸和乙狀結(jié)腸)癌16 例，直腸癌40 例；低分化癌(包括低分化腺癌、黏液腺癌、印戒細胞癌和未分化癌)18 例，中分化癌51 例，高分化9 癌；按TNM 分期：Ⅰ期12 例，Ⅱ期30 例，Ⅲ期32 例，Ⅳ期4 例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移33 例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移45 例；有脈管侵犯者28 例，無脈管侵犯者50 例；所有標(biāo)本均經(jīng)10%福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋，按4 μm 厚度連續(xù)切片，分別進行HE 和免疫組化染色。同時取距離腫瘤組織＞3 cm 且經(jīng)病理學(xué)檢查證實無癌浸潤的正常結(jié)直腸黏膜22例作為對照組。

1.2 主要試劑

鼠抗人CD10 單克隆抗體、即用型非生物素免疫組化EliVisionTMplus 試劑盒及DAB 顯色劑，均為福州邁新生物技術(shù)公司產(chǎn)品。

1.3 檢測方法

采用快捷免疫組化EliVision 法，嚴(yán)格按照產(chǎn)品說明操作。具體染色步驟如下：二甲苯切片脫蠟；酒精梯度脫水到水化，用PBS 液(0.01 mmol/L，pH=7.4)沖洗3次，每次3 min；高壓鍋加熱抗原修復(fù)方法，修復(fù)液采用檸檬酸緩沖液；每張切片加1 滴3% H2O2，室溫下孵育10 min，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性。PBS沖洗3次，每次3 min；除去PBS液，每張切片分別滴加鼠抗人CD10 單克隆抗體一抗工作液，室溫下孵育60 min；PBS 沖洗3 次，每次5 min，除去PBS液，每張切片加1 滴即用型EliVisionTMplus 試劑，室溫下孵育20 min。PBS 沖洗3 次，每次3 min；除去PBS 液，每張切片加1 滴新鮮配制的DAB 溶液，顯色5 min，自來水沖洗；蘇木精復(fù)染5 min，自來水沖洗；浸入鹽酸酒精分化1 min，自來水沖洗；PBS 返藍后，脫水，透明，中性樹膠封固，用PBS 代替一抗作為陰性對照，陽性對照由試劑公司提供。

1.4 結(jié)果判定

每張切片隨機選擇10 個視野讀片(光鏡200 倍)，并選擇有代表性的切片拍照。癌組織切片可見癌細胞胞漿呈淡黃到深棕色陽性染色，間質(zhì)組織也有中量陽性表達。染色結(jié)果由2 位資深病理科醫(yī)師共同判定。按染色程度分級：+～+++分別為淡黃色、棕黃色、深棕色。按陽性染色癌細胞分布比例進行評分：0 為0分；0～33%為1分、＞33%～67%為2分；＞67%～100%為3分。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

用SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件包進行分析，不同分組間指標(biāo)差異的分析采用卡方檢驗，以α=0.05 為檢驗水準(zhǔn)。

2 結(jié) 果

2.1 結(jié)直腸癌組織中CD10蛋白的表達情況

免疫組織化學(xué)染色法檢測結(jié)果見圖1，正常癌旁組織中未見CD10 蛋白表達，癌組織切片染色陽性物質(zhì)呈淡黃色、棕黃色或深棕色顆粒，在癌性腺體的腔緣和癌細胞胞質(zhì)內(nèi)著色。CD10在結(jié)直腸癌組織和正常癌旁組織中的表達情況見表1，可見78 例結(jié)直腸癌組織中，36 例表達陽性，42 例陰性，陽性率為46.2%，其中按CD10蛋白表達強度分類有3例+，11例++，22例+++；按CD10 蛋白分布比例評分分類有15 例1 分，7例2分，14例3分。22例癌旁組織CD10表達均為陰性。癌組織CD10 表達顯著高于正常組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.001)。

圖1 免疫組織化學(xué)染色法檢測癌組織中CD10的表達情況(×200)

表1 CD10在結(jié)直腸癌組織和正常癌旁組織中的表達情況

2.2 CD10蛋白的表達與患者基本情況及臨床病理指標(biāo)的關(guān)系

CD10 蛋白表達情況的分類統(tǒng)計分析結(jié)果見表2。按患者性別分為男性組和女性組，不同性別癌組織中CD10 表達強度及比例無明顯差異(P＞0.05)；按患者年齡分為高齡組(≥65 歲)和非高齡組(＜65 歲)，各年齡組間癌組織中CD10 表達強度及比例無明顯差異(P＞0.05)；按腫瘤位置分為右半結(jié)腸組、左半結(jié)腸組和直腸組，不同位置癌組織中CD10 表達強度及比例無明顯差異(P＞0.05)；按腫瘤分化程度分為高分化組、中分化組和低分化組(包括低分化腺癌、黏液腺癌、印戒細胞癌和未分化癌)，不同分化癌組織中CD10 表達強度及比例無明顯差異(P＞0.05)；按TNM 分期分為早期組(Ⅰ期+Ⅱ期)和中晚期組(Ⅲ期+Ⅳ期)，中晚期結(jié)直腸癌CD10 蛋白表達強度高于早期腫瘤，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.033)，而CD10 蛋白表達比例則與結(jié)直腸癌分期無明顯相關(guān)(P＞0.05)；按腫瘤浸潤深度分為T1+T2組(腫瘤局限于固有肌層)和T3+T4 組(腫瘤穿透固有肌層到達或穿透漿膜層，或侵犯無腹膜覆蓋的結(jié)直腸旁組織)，浸潤深度不同的結(jié)直腸癌癌組織中CD10 表達強度及比例無明顯差異(P＞0.05)；按周圍淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況分為有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，周圍淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性的結(jié)直腸癌CD10 蛋白表達強度高于淋巴結(jié)陰性組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.023)，而CD10蛋白表達比例則與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況無明顯相關(guān)(P＞0.05)；按脈管受侵犯情況分為有脈管侵犯組和無脈管侵犯組，存在脈管侵犯的結(jié)直腸癌CD10 蛋白表達強度高于無脈管侵犯組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.004)，而CD10 蛋白表達比例則與脈管浸潤情況無明顯相關(guān)(P＞0.05)。

3 討 論

結(jié)直腸癌是一種常見的消化道惡性腫瘤，在全球范圍內(nèi)為男性第3 位、女性第2 位高發(fā)惡性腫瘤，每年新發(fā)病例約120 萬例，死亡約60 萬例[5]。隨著社會經(jīng)濟發(fā)展、環(huán)境污染加重、居民生活方式的轉(zhuǎn)變，以及人口老齡化加劇等原因，我國結(jié)直腸癌的發(fā)病和死亡有明顯上升趨勢，且發(fā)病年齡呈現(xiàn)年輕化趨勢。中國結(jié)直腸癌新發(fā)病例占全球的18.6%，致死原因居于惡性腫瘤的第5 位[6]，嚴(yán)重威脅著人民群眾的生命健康。

CD10 蛋白是一種細胞表面鋅依賴性金屬蛋白酶，屬于肽酶類家族成員之一，它可以水解結(jié)合于疏水氨基酸氨基殘基的多肽，從而達到降低與受體結(jié)合和信號傳導(dǎo)肽類濃度的作用，α-氨基的碳是其酶切位點。CD10可以切斷很多生理活性多肽，包括心房鈉尿肽、血管緊張素Ⅰ和Ⅱ、血管舒緩激肽、P 物質(zhì)、神經(jīng)降壓素、后葉催產(chǎn)素和腦啡肽等[7]。其表達機制是通過調(diào)節(jié)局部肽的濃度來介導(dǎo)細胞對激素產(chǎn)生應(yīng)答，因此許多激素敏感或肽敏感細胞以及相應(yīng)的腫瘤均表達CD10 抗原，在不同組織CD10 表現(xiàn)的功能也不盡相同。CD10在人類中期胚胎的上皮和間充質(zhì)細胞上有表達，在腎臟、呼吸道及外生殖器的細胞分化和增殖過程中發(fā)揮作用[8]。CD10表達在中樞神經(jīng)系統(tǒng)起到腦啡肽酶作用。在肺氣管上皮細胞，CD10蛋白可以抑制正常胚胎支氣管上皮細胞增殖和成熟[7]。還有研究發(fā)現(xiàn)，CD10蛋白對乳腺干細胞的表達有重要作用，可作為正常乳腺干細胞/祖細胞中具有功能性的調(diào)節(jié)因子，促進乳腺干細胞/祖細胞向腔上皮細胞和肌上皮細胞分化[9]。

表2 CD10蛋白的表達與患者基本情況及臨床病理指標(biāo)的關(guān)系

CD10蛋白最初作為普通急性淋巴細胞白血病抗原(common acute lymphoblastic leukemia antigen，CALLA)被發(fā)現(xiàn)，主要作為急性淋巴細胞白血病的標(biāo)志，用于白血病及淋巴瘤的免疫分型診斷及預(yù)后判斷。近年來隨著研究深入，CD10蛋白在實體瘤中的應(yīng)用也愈加廣泛。Jana等[10]研究結(jié)果表明，乳腺癌基質(zhì)細胞CD10表達與腫瘤高分級、腫瘤細胞有絲分裂速度增加、較差的預(yù)后、雌激素受體(estrogen receptor，ER)陰性、人類表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor-2，HER2)陽性和分子亞型(CD10陽性與HER2過表達型，CD10陰性與Luminal型)顯著相關(guān)。國內(nèi)黃雯等[11]亦證實CD10在乳腺癌中高表達與乳腺癌進展相關(guān)。此外，在膀胱癌、胃癌、胰腺癌及其他惡性實體瘤中，各項研究也提示CD10 的表達與腫瘤的不良預(yù)后密切相關(guān)[12]。

CD10蛋白在結(jié)直腸癌中的研究也頻見報端。早在2002 年，Ogawa 等[13]就發(fā)現(xiàn)在結(jié)直腸重度不典型增生腺瘤、黏膜內(nèi)癌和浸潤性癌的基質(zhì)細胞表達CD10 的比例均遠高于輕度或中度不典型增生腺瘤，CD10的表達與p53蛋白積累、腫瘤體積顯著相關(guān)，提示CD10的表達可能是結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展過程中的一個組成部分，并且有助于腫瘤浸潤性生長，從而導(dǎo)致腫瘤轉(zhuǎn)移。同年，Yao 等[14]的研究發(fā)現(xiàn)，伴肝轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌患者的CD10 表達率(58.1%)顯著高于無肝轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌患者(21.7%)，提示表達CD10 的結(jié)直腸癌患者的肝轉(zhuǎn)移風(fēng)險增大。Sasaki等[3]研究提示，在結(jié)直腸癌患者中，血清CD10 水平是提示同時性和異時性肝轉(zhuǎn)移的可靠指標(biāo)。Fujita 等[15]的研究結(jié)果也提示，CD10與結(jié)直腸癌患者無病生存率顯著相關(guān)，CD10陰性患者肝轉(zhuǎn)移的發(fā)生率為3%，CD10 陽性患者肝轉(zhuǎn)移發(fā)生率為28%。Ohji 等[16]的一項病例對照研究顯示結(jié)直腸癌伴肝轉(zhuǎn)移病例中CD10、VEGF 和CD44 表達的比例均顯著高于無肝轉(zhuǎn)移結(jié)直腸癌患者。Logistic回歸分析顯示，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、CD10表達和VEGF表達均是結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移的獨立危險因素，若上述3 個標(biāo)記均為陽性，肝轉(zhuǎn)移的概率將達到92.7%。Raposo 等[17]的實驗則提示上皮細胞CD10 在原發(fā)性腫瘤中的表達與淋巴結(jié)浸潤和較晚分期有關(guān)，并發(fā)現(xiàn)CD10 在早期腫瘤中抑制細胞運動，而在晚期腫瘤中反而促進細胞活力。

由于條件限制，本研究缺乏入組患者術(shù)后的相關(guān)隨訪信息，無法探究CD10 蛋白的表達與腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移及生存時間之間的關(guān)系，但以上諸多大樣本臨床研究和基礎(chǔ)研究足以證明CD10 表達是結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移的獨立危險因素，可作為結(jié)直腸癌的一項預(yù)后指標(biāo)。關(guān)于CD10 表達增加結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移風(fēng)險的機制，Kuniyasu 等[18]提出，CD10蛋白在結(jié)直腸癌細胞表達可降解肝內(nèi)具有抗腫瘤作用的甲硫氨酸腦啡肽(methionine enkephalin，MENK)從而降低肝臟抗腫瘤能力，并導(dǎo)致CD10 陽性的結(jié)直腸癌細胞肝轉(zhuǎn)移發(fā)生率增加。

本研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌組織中CD10 蛋白表達強度與患者性別、年齡、腫瘤部位、分化程度、浸潤深度無明顯相關(guān)關(guān)系(P＞0.05)，而與腫瘤細胞的臨床分期、有無脈管侵犯及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P＜0.05)，中晚期結(jié)直腸癌CD10 蛋白表達強度高于早期腫瘤(P=0.033)，周圍淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性的結(jié)直腸癌CD10蛋白表達強度高于淋巴結(jié)陰性病例(P=0.023)，存在脈管受侵犯的結(jié)直腸癌CD10 蛋白表達強度高于無脈管受侵病例(P=0.004)。其機制可能是癌細胞通過分泌CD10 蛋白降解了腫瘤周圍的細胞外基質(zhì)和脈管基膜，導(dǎo)致癌細胞更易于浸潤和轉(zhuǎn)移。本研究未能得出CD10 蛋白表達在不同腫瘤分化程度和浸潤深度之間存在明顯差異，可能受到總樣本量小、高分化或腫瘤局限于肌層的病例數(shù)少等因素影響?？偨Y(jié)實驗結(jié)果提示，CD10蛋白表達與結(jié)直腸癌的不良生物學(xué)行為以及不良預(yù)后相關(guān)，與國內(nèi)外大多數(shù)研究的結(jié)論相近。Hirano 等[19]的研究表明高度異型性結(jié)直腸腫瘤的總體CD10 表達率(60.6%)遠高于低度異型性腫瘤(28.9%)，數(shù)據(jù)充分提示CD10的表達水平對于預(yù)測早期大腸癌的生物學(xué)特性有應(yīng)用價值。Nishida等[20]的研究表明，CD10陽性的腫瘤相較于CD10 陰性顯示出更容易出現(xiàn)浸潤，并與T1 期結(jié)直腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移風(fēng)險密切相關(guān)。得到陰性結(jié)果的相關(guān)報道不多，Bernescu等[4]的一項回顧性研究收集了191例T1N0期～T3N2期無遠處轉(zhuǎn)移結(jié)直腸癌患者，提示，CD10表達并未顯示與結(jié)直腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)(P=0.33)，并不優(yōu)于單純根據(jù)腫瘤原發(fā)灶淋巴管浸潤情況預(yù)測淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的風(fēng)險，但該研究同時指出，CD10 表達情況對于評判淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有較高的特異性(75.7%)。與主流觀點不完全一致的原因可能是組織差異或者此研究中淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性者例數(shù)不足。

本研究提示結(jié)直腸癌組織中CD10 蛋白高表達可能是結(jié)直腸癌發(fā)生的重要因素，并且可能與結(jié)直腸癌的局部侵襲和遠處轉(zhuǎn)移相關(guān)。其可能機制包括：①CD10蛋白降解腫瘤周圍的細胞外基質(zhì)和脈管基膜，改變細胞微環(huán)境從而影響腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移潛能；②CD10蛋白降解癌細胞分泌的具有抑制惡性腫瘤細胞生長功能的腦啡肽，從而避免抑制信號；③表達CD10的腫瘤間質(zhì)細胞通過活化肌纖維母細胞協(xié)助癌細胞逃避人體免疫系統(tǒng)的清除。本實驗初步探討了CD10 蛋白在結(jié)直腸癌中的表達及其意義，因樣本量偏小、隨訪資料不全等原因，得出的結(jié)論非常有限，但與國內(nèi)外的大多數(shù)相關(guān)研究結(jié)果相近。后續(xù)仍需更大樣本量的病例研究佐證和明確目前所得結(jié)論，并可通過更為系統(tǒng)的術(shù)后隨訪來探索CD10 蛋白表達對結(jié)直腸癌患者復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移及生存時間的影響。同時，我們?nèi)孕枰嗟幕A(chǔ)實驗來進一步明確CD10 蛋白在結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展及浸潤轉(zhuǎn)移中的作用機制。