高溫環(huán)境對通城豬血清生化指標及空腸組織HSP70與HSP90mRNA 表達的影響

高登營 ，連維思，康亭亭，李文超，邢文凱，趙展展，黃 程，雷明剛,2*，李 勝

（1.華中農業(yè)大學動物遺傳育種與繁殖國家重點實驗室，湖北武漢 430000；2.華中農業(yè)大學國家家畜工程技術研究中心，湖北武漢 430000；3.通城縣國營種畜場，湖北咸寧 437400）

隨著畜禽養(yǎng)殖業(yè)向著集約化、規(guī)?；D型，形成了飼養(yǎng)密度高、控溫難的養(yǎng)殖環(huán)境，高溫環(huán)境應激對動物的影響最廣泛也最難以避免。豬無汗腺，對高溫異常敏感，極易發(fā)生熱應激。當豬只的產(chǎn)熱總量超過其散熱能力時，便會發(fā)生熱應激，體溫升高，采食量下降，生理機能紊亂，組織器官損傷[1]。熱應激狀態(tài)下，機體會自主調節(jié)增加體表和組織器官的血流量，促進熱量散失，從而維持體溫穩(wěn)定[2]，但長時間持續(xù)高溫會使皮溫和直腸溫度升高。由于血液是動物機體內各種因子運輸?shù)妮d體，也是實現(xiàn)體液調節(jié)的途徑，所以檢測豬只的血液生化指標可以直觀反映出豬只生理機能的變化[3]。發(fā)生熱應激時，流經(jīng)腸道的血流量顯著下降，腸道組織會因缺血、缺氧而產(chǎn)生損傷[4]，使組織細胞膜通透性提高，加快胞內活性酶逸出流入血液[5]。熱應激蛋白（Heat Shock Proteins，HSPs）是保護機體免受應激損傷的一類多肽類蛋白質，HSP70 和HSP90 是HSPs 家族中最重要的蛋白[6]。熱應激發(fā)生后小腸組織中HSP70、HSP90mRNA 表達量顯著升高，表明熱應激可以促進組織中HSP70和HSP90的表達[7]。

通城豬是長江流域地方豬種，繁殖力強，易受孕，母性好，在-15℃和40℃的環(huán)境下均表現(xiàn)出極強的適應性[8]，是我國優(yōu)秀的地方品種。在夏季，通城豬長期處于高溫高濕環(huán)境，研究熱應激對通城豬的影響以及其耐熱性機制具有重要的經(jīng)濟價值和現(xiàn)實意義。目前，有關熱應激對通城豬的影響的研究鮮有報道。因此本試驗旨在研究熱應激對通城豬體溫、呼吸頻率、血清生化指標和空腸組織HSP70、HSP90 的影響，為研究通城豬的耐熱機制提供參考，也為通城豬的健康養(yǎng)殖實踐提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 試驗設計與飼養(yǎng)管理 選取30 頭100 日齡、體重（45±5）kg、血統(tǒng)相近的雌性通城豬，隨機分為6 組，分為對照組和熱應激組（熱應激2、4、6、8、10 d），每組5 頭。將試驗豬（28±1）℃下適應性飼養(yǎng)7 d，全部自由采食，自由飲水，于第8 天開始，對照組仍置于（28±1）℃條件下，處理組迅速升溫至（39±1）℃并分別熱應激處理2、4、6、8、10 d（每天09：00—16：00）。

1.2 體表皮溫度、直腸溫度和呼吸頻率的測定 于試驗開始，利用紅外線測溫槍（MT-4606），購自臺灣寶工工具旗艦店；獸用肛溫計購自中農康蓄牧業(yè)專營店，分別在熱應激2、4、6、8、10 d，在每天10：00—16：00每個整點對每組（5 頭）熱應激豬只進行額頭、耳、鼻、背、臀和直腸溫度的測定，以豬腹部的每分鐘起伏次數(shù)，記錄呼吸頻率，并對豬舍內外溫度進行記錄。

1.3 血清生化指標的測定 在對照組和各熱應激組到達相應時間點，對每組豬進行空腹前腔靜脈采血10 mL，3 000 r/min 離心10 min，分離血清，-80℃冰箱保存，利用血清生化測定儀器（貝克曼庫爾特AU5811）和美國貝克曼庫爾特公司的原裝試劑測定各組血清總蛋白（Total Protein，TP）、白蛋白（Albumin，ALВ）、球蛋白（Globulin，GLВ）、谷草轉氨酶（Aspartate Transaminase，AST）、堿性磷酸酶（Alkaline Phosphate，ALP）、乳酸脫氫酶（Lactic Dehydrogenase，LDH）、肌酸激酶（Creatine Kinase，CK）。

1.4 空腸組織HSP70、HSP90 mRNA 表達測定

1.4.1 組織樣RNA 提取 試驗結束后實驗豬屠宰取空腸組織，用PВS 溶液反復沖洗，至殘留血液和內容物完全去除，立刻放入液氮，冷凍后進行組織研磨，Trizol法提取總RNA，使用微量分光光度計檢測RNA 濃度后-80℃保存。

1.4.2 cDNA 合成 利用Prime Kit with gDNA Eraser 試劑盒（TaKaRa 公司）進行反轉錄合成cDNA，-20℃保存。

1.4.3 引 物 設 計 與 合 成 根 據(jù)GenВank 中HSP70、HSP90和β-actin基因序列，利用Primer Premier5.0 軟件設計3 對引物，并由武漢擎科生物公司合成，引物序列見表1。

1.4.4 實時熒光定量RCR 檢測 以cDNA 為模板，采用Light Cycler?480ΙΙ/96（Roche）實時定量PCR 系統(tǒng) 檢測基因表達情況。熒光定量反應體系為20 μL：SYВR Mix10 μL，10 μmol/L 上、下游引物各1 μL，cDNA 模板1 μL，ddH2O 補至20 μL。擴增程序為95℃預變性10min，95℃變性15s，60℃退火20 s，共40 個循環(huán)?；蛳鄬Ρ磉_量采用2△△Ct法計算，以β-actin 作為內參基因。每組試驗重復3 次。

表1 基因引物信息

1.5 統(tǒng)計分析 數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 處理后，采用ΙВM Spss Statistics 21 進行單因子方差分析，試驗數(shù)據(jù)均以平均值± 標準誤差（SEM）表示。以P＜0.05 作為差異顯著性標準。

2 結果與分析

2.1 熱應激對通城豬皮溫、直腸溫度和呼吸頻率的影響如圖1 所示，隨著環(huán)境溫度的升高，豬只各部位表皮溫度變化不大；熱應激使豬只直腸溫度升高，并超出最高正常值；熱應激使豬只呼吸頻率顯著增加，隨著熱應激時間增長呼吸頻率變快且不穩(wěn)定。

2.2 熱應激對通城豬血清生化指標的影響 如表2 所示，與對照組相比，熱應激2、4 d 組血清TP、ALВ 和GLO顯著降低，且4 d 組達最低值；AST 在熱應激第4、10 天含量降低，熱應激第8 天升高，呈現(xiàn)波動性變化（P＜0.05）；堿性磷酸酶含量在熱應激2、4、6、8 d顯著升高，且4 d 時達到峰值；與對照組相比，LDH 含量在2、4、6 d 顯著升高，且4 d 時達峰值；血清CK含量在所有熱應激組顯著升高，且在4 d 時達峰值。

2.3 熱應激對通城豬空腸組織HSP70、HSP90mRNA 表達的影響 如圖2 所示，與對照組相比，熱應激處理第4 天，空腸組織HSP70、HSP900 mRNA 表達水平顯著升高。與對照組相比其他熱應激組HSP70、HSP90mRNA 表達水平略有升高但差異不顯著。

3 討論

當豬遭受熱應激時，會對環(huán)境溫度的升高做出適應性反應，如通過增加呼吸頻率蒸發(fā)體內更多熱量、增加飲水降低體內熱量、減少采食量減少產(chǎn)熱等[9-10]。正是因為這種適應性反應，隨著環(huán)境溫度升高，豬的皮膚溫度會隨之升高，呼吸頻率加快。Yan[11]報道，豬在熱應激條件下直腸溫度、呼吸率顯著高于適溫水平，其中直腸溫度相差0.3～0.8℃，平均皮溫相差4～5℃。Patience 等[12]研究高溫下豬的代謝試驗，發(fā)現(xiàn)38℃高溫下熱應激10 d 后，與20℃常溫相比，高溫組呼吸速率達105.2 次/min，對照組為15 次/min，直腸溫度從38.4℃升高到39.7℃。本試驗發(fā)現(xiàn)熱應激使妊娠早期通城豬直腸溫度升高，呼吸速率大大增加且不穩(wěn)定，但是皮溫變化不明顯，提示通城豬在熱應激條件下對自身皮溫的調節(jié)能力較強，猜測與通城豬是夏季高溫高濕地區(qū)的地方豬種有關系。

血清生化指標常用來反映動物體內物質代謝和組織器官機能變化，并廣泛應用于研究熱應激對機體的影響。熱應激可以抑制動物機體的免疫機制，促進皮質醇的分泌，進而增強蛋白分解代謝，降低血清TP、ALВ、GLВ 含量[13-14]。Mahesh 等[15]研究發(fā)現(xiàn)山羊在短期熱應激后血清TP、ALВ、GLВ 含量出現(xiàn)不同程度的降低，而延長熱應激時間則會增加血清TP、ALВ、GLВ 含量。本研究發(fā)現(xiàn)通城豬在熱應激2、4 d 期間血清TP、ALВ、GLВ 含量顯著降低，而在第6～10 天呈現(xiàn)上升趨勢恢復至對照組水平。說明通城豬在2～4 d 短期熱應激期間體內皮質醇分泌增多，使血清蛋白的分解能力加強，血清蛋白含量顯著降低；在6～10 d 長期熱應激期間，皮質醇含量降低使血清蛋白含量恢復正常水平。猜測因為通城豬對持續(xù)性高溫抗逆性強，適應能力好，具體的抗逆性機制需進一步研究。機體正常情況下，酶存在于細胞內，作為代謝所需的催化劑，應激會使細胞膜通透性增加或者破損，加快酶進入血液，使血液中酶含量升高，進而造成代謝紊亂[16]，因此血清中酶的活性可以反映熱應激程度。Sevi[17]和Helal 等[18]研究表明熱應激使動物血清中ALP 活性下降，也對LDH 的活性產(chǎn)生影響，從而影響機體代謝。Sharma 等[19]研究發(fā)現(xiàn)山羊在熱應激時血清AST 水平?jīng)]有顯著變化。李俊杰等[20]研究表明熱應激使牛血清CK 活性增加。本研究發(fā)現(xiàn)通城豬在熱應激期間，除AST 呈波動性變化外，血清ALP、LDH、CK 含量均顯著升高，且在熱應激4 d 達到峰值，表明熱應激對通城豬組織器官造成損傷，使酶加快進入血液。熱應激4 d 后，隨熱應激時間增長，酶含量逐漸恢復至對照組水平，說明在長期熱環(huán)境下的通城豬對熱應激的調節(jié)能力較好。

表2 熱應激對通城豬血清生化指標的影響

通城豬空腸組織HSP70、HSP90mRNA 表達水平都在熱應激第4 天達到峰值，其作為HSP 家族中最具代表性的具有分子伴侶和抗細胞凋亡作用的成員，可以對熱應激產(chǎn)生一定的耐受作用，但這種耐受能力被限制在一定范圍內[21]。本研究結果表明，熱應激第4 天空腸組織HSP70、HSP90mRNA 表達水平顯著升高，隨后表達量降低，表明通城豬在熱應激第4 天左右會通過提高HSP70、HSP90的表達來應對機體的應激狀況，但在4 d 之后表達量隨之下降，所以得出通城豬對熱應激的最大耐受天數(shù)在4 d 左右。

4 結論

本試驗結果顯示，熱應激使通城豬的直腸溫度升高，皮溫無顯著變化，呼吸頻率增強；熱應激顯著降低TP、ALВ 和GLO 濃度，并在第4 天達最低值，血清ALP、LDH 和CK 隨熱應激處理時間增加顯著升高，并在第4 天達峰值；空腸組織HSP70、HSP90mRNA 表達水平在熱應激第4 天顯著升高，隨后降低。通城豬作為優(yōu)秀的地方豬品種，在高溫環(huán)境下，可通過調節(jié)皮溫、血清蛋白和HSP70、HSP90 的變化來應對應激，并推測熱應激第4 天是應激反應的重要節(jié)點，具體的調控機制值得深入研究。