莫諾苷對(duì)大鼠原代皮層神經(jīng)元氧糖剝奪模型線粒體質(zhì)量控制體系的影響

王明洋,牛紅妹,張 麗,李雅莉,李 林,張 蘭

(首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院藥學(xué)部；北京市神經(jīng)藥物工程技術(shù)研究中心；北京腦重大疾病研究院；神經(jīng)變性病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100053)

腦卒中是導(dǎo)致中國(guó)居民死亡和殘疾的第一致病因素，同時(shí)給社會(huì)和病患家庭帶來極重的經(jīng)濟(jì)壓力[1]。在腦缺血導(dǎo)致的多種病理損傷中，線粒體能量代謝障礙被當(dāng)作是引發(fā)系列損傷的源頭[2]。且日益增多的研究證據(jù)表明，腦缺血后線粒體功能障礙可直接影響神經(jīng)元的存活或死亡狀態(tài)[3]，調(diào)控并維持正常線粒體網(wǎng)絡(luò)穩(wěn)態(tài)有助于神經(jīng)系統(tǒng)功能的執(zhí)行，靶向線粒體的新藥研發(fā)有可能為腦缺血治療帶來新的突破。

細(xì)胞內(nèi)線粒體網(wǎng)絡(luò)穩(wěn)態(tài)依賴于嚴(yán)密精準(zhǔn)的線粒體質(zhì)量控制系統(tǒng)(mitochondria quality control，MQC)調(diào)控，主要包括線粒體自噬及分裂、融合等線粒體動(dòng)力學(xué)過程[4]。線粒體自噬是受損或者老化的線粒體被選擇性降解的途徑，經(jīng)由激活的AMPK-ULK-Beclin通路啟動(dòng)自噬作用，細(xì)胞將受損線粒體部分隔離成為自噬小體，隨后通過溶酶體途徑降解，防止受損線粒體在細(xì)胞內(nèi)堆積[5]。而線粒體經(jīng)過不斷的分裂融合可保證各個(gè)線粒體之間內(nèi)容物的互換，促進(jìn)健康線粒體的生成并分離受損部分。且有研究表明，激活的線粒體分裂可進(jìn)一步刺激線粒體自噬過程來加速清除受損的線粒體[6]。受損線粒體的及時(shí)清除可有效阻斷其引起的細(xì)胞死亡。因此，通過調(diào)控MQC過程，減輕線粒體損傷，對(duì)于促進(jìn)腦缺血后的神經(jīng)功能恢復(fù)有著重要意義。

傳統(tǒng)中藥山茱萸中含有大量的具有多種生物活性的環(huán)烯醚萜類化合物，莫諾苷是其中重要成分之一。研究表明，莫諾苷具有抗炎、抗凋亡、促血管生成等活性作用[7-8]。同時(shí)，本研究室前期研究發(fā)現(xiàn)，莫諾苷具有神經(jīng)保護(hù)作用[9]，但具體作用機(jī)制尚未完全闡明。本研究在體外培養(yǎng)的大鼠原代皮層神經(jīng)元上建立氧糖剝奪(oxygen-glucose deprivation，OGD)模型，模擬腦缺血損傷后神經(jīng)元的病理改變，研究莫諾苷對(duì)OGD后神經(jīng)元損傷的影響，并進(jìn)一步從調(diào)控維持線粒體穩(wěn)態(tài)的線粒體質(zhì)量控制體系的角度探討其發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑莫諾苷(morroniside)(B20872)購于上海源葉生物科技有限公司，純度>97%。多聚賴氨酸(P6407)、連二亞硫酸鈉(Na2S2O4)(71699)等購于Sigma公司；Neurobasal(含/不含葡萄糖)(21103049，A2477501)、B27添加劑(17504044)等細(xì)胞用試劑購于Gibco公司；CCK-8檢測(cè)試劑盒購于北仁化學(xué)科技(北京)有限公司(CK04)；線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒(C2006)、Fluo-4 AM(鈣離子熒光探針)(S1060)、蛋白酶磷酸酶抑制劑(P1045)、苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF)(ST506)、RIPA(P0013B)、BCA蛋白濃度測(cè)定kit(P0010)等購于碧云天生物技術(shù)有限公司；抗體AMPKα(#5832)、Phospho-AMPKα(Thr172)(#2535)、ULK1(#8054)、Phospho-ULK1(Ser555)(#5869)、Beclin1(#3495)、p62(#39749)、Nix(#12396)、OPA(#80471)、MFF(#84580)、β-actin(#3700)等購于CST公司。

1.2 儀器倒置熒光顯微鏡購于日本Olympus公司; CO2培養(yǎng)箱、臺(tái)式高速離心機(jī)購自美國(guó)Thermo公司;全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀購于法國(guó)巴德斯公司；恒溫振蕩培養(yǎng)搖床購于武漢科學(xué)儀器廠；電子天平購于北京賽多利斯天平有限公司；凝膠電泳槽、電泳儀等購于美國(guó)Bio-Rad公司；化學(xué)發(fā)光成像儀購于上海天能公司。

1.3 原代神經(jīng)元培養(yǎng)取24 h內(nèi)新生SD乳鼠(購于斯貝福生物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK(京)2019-0010)，用75%酒精消毒后斷頭，取出大腦，在預(yù)冷的D-Hanks液中漂洗后，去除中腦和海馬，剩余皮層部分，小心剔除腦膜后，將腦組織剪成約1 mm3的組織塊，用1～2 mL組織消化裂解液在37 ℃作用15 min后，加入DMEM高糖培養(yǎng)基終止消化，并吹打成單個(gè)細(xì)胞懸液，然后用70 μm網(wǎng)篩過濾收集懸液，離心5 min(1 000 r·min-1)，棄上清，用DMEM高糖培養(yǎng)基吹打重懸細(xì)胞，并計(jì)算母液細(xì)胞密度。調(diào)整合適細(xì)胞密度種板。接種后4 h將DMEM高糖培養(yǎng)基全部換成Neurobasal培養(yǎng)基(添加有2% B27)，隨后每隔2～3 d半量更換培養(yǎng)基。體外培養(yǎng)8～10 d用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 大鼠原代皮層神經(jīng)元氧糖剝奪模型的制備所有細(xì)胞培養(yǎng)成熟后分為5組：正常對(duì)照組，對(duì)照+莫諾苷25 μmol·L-1組，OGD模型組，OGD+莫諾苷12.5 μmol·L-1組，OGD+莫諾苷25 μmol·L-1組。OGD模型制備時(shí)棄去各細(xì)胞原培養(yǎng)基，除正常對(duì)照及對(duì)照+莫諾苷組細(xì)胞更換新的Neurobasal外，其余各組替換為含5 mmol·L-1Na2S2O4(氧剝奪)的 Neurobasal無糖培養(yǎng)基(糖剝奪)，在37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱孵育1 h建立OGD模型，后換為Neurobasal培養(yǎng)基，同時(shí)各給藥組分別加入終濃度為25、50 μmol·L-1的莫諾苷，正常對(duì)照組給予相應(yīng)同體積Neurobasal，對(duì)照+莫諾苷組細(xì)胞給予含50 μmol·L-1莫諾苷的同體積Neurobasal。于培養(yǎng)箱中正常培養(yǎng)12 h或24 h后進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)。

1.5 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞存活率采用CCK-8試劑檢測(cè)細(xì)胞存活率。上述細(xì)胞處理24 h后，將各組細(xì)胞原有培養(yǎng)基除去，按100 μL/孔加入含10%(體積分?jǐn)?shù))CCK-8的新鮮neurobasal，37 ℃孵育2 h后測(cè)定450 nm處吸光度(OD值)。以不含細(xì)胞的空白培養(yǎng)基組吸光度為基準(zhǔn)調(diào)零，各組取平均值后按下式計(jì)算細(xì)胞相對(duì)存活率：細(xì)胞相對(duì)存活率/ % =(實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值)×100%。

1.6 線粒體膜電位檢測(cè)采用JC-1法檢測(cè)神經(jīng)元內(nèi)線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential，MMP)的變化。上述細(xì)胞處理12 h后，除去原有培養(yǎng)基，PBS洗2遍，加入適量1×JC-1試劑，于37 ℃反應(yīng)30 min，之后再用PBS洗2遍，在倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照。使用Image-Pro Plus軟件定量分析圖像中紅色及綠色熒光強(qiáng)度，各組MMP的變化以紅/綠熒光強(qiáng)度比值顯示。

1.7 鈣離子濃度檢測(cè)采用Fluo-4 AM法檢測(cè)神經(jīng)元內(nèi)鈣離子濃度的變化。上述細(xì)胞處理12 h后，除去原有培養(yǎng)基，PBS洗2遍，加入適量1 μmol·L-1Fluo-4 AM工作液，于37 ℃反應(yīng)30 min，之后再用PBS洗2遍，繼續(xù)于37 ℃培養(yǎng)箱孵育約20～30 min后，在倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照。使用Image-Pro Plus軟件定量分析圖像中綠色熒光強(qiáng)度。

1.8 Western blot法檢測(cè)蛋白表達(dá)上述細(xì)胞處理12 h后，用細(xì)胞裂解液(RIPA ∶蛋白磷酸酶抑制劑 ∶PMSF=100 ∶2 ∶1)裂解收集；BCA法定量后變性；取相同質(zhì)量蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜，5% BSA封閉后，孵育上述適當(dāng)濃度的一抗，4 ℃過夜；TBST 洗膜3次，加入相應(yīng)的二抗室溫下孵育1 h；棄去二抗，TBST洗膜3次；加ECL化學(xué)發(fā)光試劑曝光，保存適宜條帶圖像，使用GelPro 3.1定量分析圖像中目的蛋白豐度。

2 結(jié)果

2.1 莫諾苷對(duì)大鼠原代皮層神經(jīng)元氧糖剝奪(OGD)模型細(xì)胞存活率的影響本研究采用CCK-8法檢測(cè)OGD損傷后各組神經(jīng)元存活率。結(jié)果顯示，OGD損傷明顯抑制細(xì)胞活性，模型組皮層神經(jīng)元細(xì)胞存活率與對(duì)照組相比明顯降低(P<0.01)；莫諾苷(3.125、6.25、12.5、25 μmol·L-1)孵育24 h能夠明顯增高OGD細(xì)胞的存活率(P<0.05，P<0.01；Fig 1)。由于莫諾苷在12.5、25 μmol·L-1濃度時(shí)藥效最佳，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用這兩個(gè)濃度進(jìn)行作用機(jī)制研究。

Fig 1 Effects of morroniside on cell viability in OGD model of rat primary cortical Cells were incubated with serial concentrations of morroniside for 24 h after OGD damage. Cell viability was measured by CCK-8 assay. The cell viability in the control group was set as 100%.##P<0.01 vs CON group;*P<0.05,**P<0.01 vs OGD group.OGD, oxygen-glucose deprivation; CON: control group.

2.2 莫諾苷對(duì)大鼠原代皮層神經(jīng)元OGD模型線粒體損傷的影響本研究采用JC-1熒光染色法檢測(cè)神經(jīng)元MMP。結(jié)果顯示，正常對(duì)照組中紅色熒光較強(qiáng)，綠色熒光較弱，紅/綠熒光比值為4.41±0.46，而OGD損傷使得模型組中紅色熒光強(qiáng)度明顯降低，綠色熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，紅/綠熒光比值明顯降低至1.68±0.32(P<0.01)，表明模型組細(xì)胞MMP明顯下降。12.5、25 μmol·L-1莫諾苷孵育12 h可分別使OGD細(xì)胞的紅/綠熒光比值明顯增高至3.49±0.31、3.96±0.52(P<0.01；Fig 2)，表明MMP明顯增高。

Fig 2 Effects of morroniside on mitochondrial membrane potential in OGD model of rat primary cortical 25 μmol·L-1;c:OGD;d:OGD+Mor 12.5 μmol·L-1;e:OGD+Mor 25 μmol·L-1.Cells were incubated with morroniside for 12 h after OGD damage.(A) Representative images of JC-1-labeled mitochondrial membrane potential staining. Scale bar=50 μm.(B) Quantitative analysis of mitochondrial membrane potential(the fluorescent intensity ratio of red/green).##P<0.01 vs CON group;**P<0.01 vs OGD group.OGD:oxygen-glucose deprivation;CON:control group; Mor: morroniside.

此外，采用Fluo-4 AM檢測(cè)神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)鈣濃度變化。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，OGD模型組熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)(P<0.05)，表明細(xì)胞內(nèi)鈣濃度明顯增高。莫諾苷(12.5、25 μmol·L-1)孵育12 h使OGD細(xì)胞的熒光強(qiáng)度明顯降低(P<0.05，P<0.01；Fig 3)，表明細(xì)胞內(nèi)鈣濃度明顯下降。

Fig 3 Effects of morroniside on intracellular calcium ion concentration in OGD model of rat primary cortical 25 μmol·L-1;c:OGD;d:OGD+Mor 12.5 μmol·L-1;e:OGD+Mor 25 μmol·L-1.A:Representative images of Fluo 4-AM fluorescence for intracellular calcium ion. Scale bar=50 μm.B:Quantitative analysis of fluorescence intensity of intracellular calcium ion. The fluorescence intensity in the control group was set as 1.0.#P<0.05 vs CON group;*P<0.05,**P<0.01 vs OGD group. OGD: oxygen-glucose deprivation; CON: control; Mor: morroniside.

2.3 莫諾苷對(duì)大鼠原代皮層神經(jīng)元OGD模型線粒體質(zhì)量控制體系的影響線粒體MQC主要包含線粒體自噬及分裂、融合等調(diào)控線粒體穩(wěn)態(tài)的過程。本研究采用Western blot方法檢測(cè)MQC相關(guān)蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，OGD模型組神經(jīng)元內(nèi)線粒體自噬受體蛋白Nix及線粒體裂變因子MFF的表達(dá)明顯下降(P<0.05，P<0.01)，自噬底物標(biāo)志蛋白p62明顯增加(P<0.01)，表明線粒體自噬及分裂過程被抑制，但線粒體融合蛋白OPA的表達(dá)無明顯變化。莫諾苷孵育12 h使OGD細(xì)胞的Nix和MFF表達(dá)明顯增高(P<0.01，P<0.05)，p62表達(dá)明顯減低(P<0.01，F(xiàn)ig 4)，表明莫諾苷能夠增強(qiáng)線粒體自噬和分裂。

Fig 4 Effects of morroniside on mitochondria quality control in OGD model of rat primary cortical A:Representative images of Western blot for Nix, p62, MFF, and OPA;B:Quantitative analysis of Nix and p62;C:Quantitative analysis of MFF and OPA. β-actin served as an internal loading control.#P<0.05,##P<0.01 vs CON group;*P<0.05,**P<0.01 vs OGD group. OGD: oxygen-glucose deprivation; CON: control; Mor: morroniside.

AMPK-ULK-Beclin通路是調(diào)控自噬啟動(dòng)的重要通路。本研究的Western blot結(jié)果顯示，OGD模型組AMPKα在Thr172位點(diǎn)的磷酸化、ULK1在Ser555位點(diǎn)的磷酸化及Beclin 1的表達(dá)均明顯降低(P<0.05，P<0.01，P<0.05)，表明AMPK/ULK/Beclin 1通路被抑制。莫諾苷孵育能使OGD細(xì)胞中AMPKα和ULK1的磷酸化以及Beclin 1的表達(dá)水平明顯增高(P<0.01，P<0.05；Fig 5)，表明莫諾苷可激活A(yù)MPK-ULK-Beclin通路。

Fig 5 Effects of morroniside on AMPKα/ULK1/Beclin1 pathway in OGD model of rat primary cortical A:Representative images of Western blot for phosphorylated(p-) AMPKα(at Thr172 site),total AMPKα, p-ULK1(at Ser555 site), total ULK1, and Beclin1;B:Quantitative analysis of p-AMPKα(Thr172), AMPKα, andp-AMPKα(Thr172)/AMPKα;C:Quantitative analysis of p-ULK1(Ser555), ULK1, and p-ULK1(Ser555)/ULK1.(D) Quantitative analysis of Beclin1. β-actin served as an internal loading control.#P<0.05,##P<0.01 vs CON group;*P<0.05,**P<0.01 vs OGD group. OGD: oxygen-glucose deprivation; CON: control; Mor: morroniside; AMPK: adenosine monophosphate-activated protein kinase.

3 討論

腦缺血導(dǎo)致各種損傷的始動(dòng)因素是細(xì)胞或組織缺乏氧及能量的供應(yīng)。本研究首先在大鼠原代皮層神經(jīng)元上建立OGD損傷模型，模擬神經(jīng)元在缺血損傷后的病理改變。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，OGD損傷后加入莫諾苷干預(yù)可明顯增加神經(jīng)元細(xì)胞存活率，表明莫諾苷可對(duì)抗缺氧缺糖損傷，保護(hù)神經(jīng)元。

腦缺血引起神經(jīng)元損傷的諸多機(jī)制學(xué)說復(fù)雜，各學(xué)說之間互為因果，互相關(guān)聯(lián)[10]，其中能量代謝障礙是各損傷機(jī)制的首發(fā)環(huán)節(jié)。腦缺血發(fā)生后，最先影響的是缺血組織的血氧供應(yīng)下降，持續(xù)缺血缺氧狀態(tài)可嚴(yán)重?fù)p害腦氧合狀態(tài)及線粒體功能，致使大腦細(xì)胞能量耗竭，進(jìn)一步引發(fā)系列復(fù)雜的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡及神經(jīng)功能障礙[2]。線粒體作為細(xì)胞的“能量中心”，首當(dāng)其沖成為腦缺血后受損的首要靶區(qū)，其功能狀態(tài)同時(shí)是影響神經(jīng)元是否可以存活的重要元素[11]。神經(jīng)元內(nèi)線粒體在缺血后迅速發(fā)生病理變化，其中線粒體膜電位(MMP)下降反映線粒體早期損傷，決定線粒體的功能狀態(tài)。MMP的改變可進(jìn)一步誘發(fā)細(xì)胞離子代謝異常，引起細(xì)胞內(nèi)鈣超載等。而過多的鈣離子沉積在線粒體上更加重了膜電位的崩解并引起細(xì)胞凋亡[11-12]。本研究結(jié)果顯示，OGD損傷引起神經(jīng)元MMP下降，細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度異常增高；莫諾苷處理能有效恢復(fù)MMP及細(xì)胞內(nèi)鈣濃度至正常水平，減輕OGD誘導(dǎo)的線粒體損傷。

MQC負(fù)責(zé)調(diào)控細(xì)胞內(nèi)線粒體的形態(tài)及功能的完整性，及時(shí)處理各種病理生理狀態(tài)下包括腦缺血后引起的線粒體損傷，維持線粒體穩(wěn)態(tài)[4]。本研究基于MQC理論，進(jìn)一步探討莫諾苷減輕線粒體損傷的作用機(jī)制，檢測(cè)了各過程的標(biāo)記蛋白─線粒體自噬相關(guān)蛋白Nix、線粒體分裂因子MFF、線粒體融合蛋白OPA等的表達(dá)變化情況。Nix是定位于線粒體外膜的線粒體膜表面結(jié)合蛋白，主要負(fù)責(zé)調(diào)控缺氧或饑餓狀態(tài)下的線粒體自噬[13]。p62是自噬底物標(biāo)志物。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)自噬過程正常進(jìn)行時(shí)，p62在自噬體與溶酶體快速結(jié)合后即被降解；而當(dāng)自噬過程被抑制，自噬體的過多積累，使得p62不能被及時(shí)降解，其表達(dá)水平升高。因此，可以用p62的蛋白表達(dá)水平作為自噬能力變化的指征[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，OGD模型組神經(jīng)元線粒體自噬相關(guān)蛋白Nix表達(dá)減低，自噬底物蛋白p62表達(dá)增高，提示線粒體自噬受到抑制。莫諾苷能夠減輕OGD誘導(dǎo)的Nix表達(dá)下降，同時(shí)降低自噬底物蛋白p62的表達(dá)，提示莫諾苷可激活線粒體自噬，促進(jìn)受損線粒體的清除。另一方面，OGD損傷對(duì)線粒體融合蛋白OPA無明顯影響，但減少了負(fù)責(zé)線粒體分裂過程的MFF表達(dá)，阻礙線粒體分裂；而莫諾苷可改善這一變化，增高M(jìn)FF的表達(dá)。

已有研究表明，自噬的啟動(dòng)需要ULK復(fù)合物的激活，AMPK-ULK-Beclin通路在其中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。AMPK活化后可促進(jìn)ULK1在Ser555的磷酸化使ULK1激活，活化的ULK1進(jìn)一步促進(jìn)Beclin1誘導(dǎo)自噬啟動(dòng)[15-16]。本研究結(jié)果顯示，OGD損傷導(dǎo)致神經(jīng)元內(nèi)AMPK和ULK1的磷酸化水平以及Beclin1的表達(dá)降低，提示AMPK-ULK-Beclin通路活性降低，被OGD損傷所抑制。莫諾苷可明顯增高OGD細(xì)胞AMPKα和ULK1的磷酸化以及Beclin1的表達(dá)水平，提示莫諾苷可能通過上調(diào)AMPK-ULK-Beclin通路而激活神經(jīng)元線粒體自噬。

綜上所述，本研究在原代神經(jīng)元OGD模型中發(fā)現(xiàn)，莫諾苷能夠增高細(xì)胞存活率，具有神經(jīng)保護(hù)作用，其作用機(jī)制包括通過上調(diào)AMPK-ULK-Beclin通路，激活線粒體自噬，促進(jìn)線粒體分裂，改善MQC，從而減輕線粒體損傷，保護(hù)神經(jīng)元抵抗缺氧缺糖損傷。