三七多糖的微波輔助提取工藝

李佳笑, 胡宇琳, 喬春雷, 李 璐, 楊曉華, 張華峰，*

(1.陜西師范大學(xué) 中俄食品與健康科學(xué)國(guó)際聯(lián)合研究中心/食品工程與營(yíng)養(yǎng)科學(xué)學(xué)院， 陜西 西安 710062； 2.西安交通大學(xué) 醫(yī)學(xué)部， 陜西 西安 710061)

三七(Panaxnotoginseng)又名田七，是國(guó)家衛(wèi)生部(現(xiàn)國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì))批準(zhǔn)的可用于保健食品的藥用植物。據(jù)《本草綱目拾遺》記載，人參補(bǔ)氣第一，三七補(bǔ)血第一。一般認(rèn)為，三七的主要活性成分為皂苷和三七素[1]。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，三七多糖也具有顯著的生物活性。陳為等[2]給高強(qiáng)度微波輻射大鼠飼喂三七粗多糖，發(fā)現(xiàn)大鼠血清內(nèi)丙二醛含量顯著降低，羥基自由基清除能力顯著提高。陳新霞等[3]研究發(fā)現(xiàn)，三七多糖能夠增強(qiáng)小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖轉(zhuǎn)化作用，促進(jìn)遲發(fā)性變態(tài)反應(yīng)，提高免疫力。姜文茹等[4]將三七多糖與自固化磷酸鈣人工骨的復(fù)合物植入骨缺損模型大鼠，發(fā)現(xiàn)三七多糖具有促進(jìn)骨缺損修復(fù)的作用。研究三七多糖的提取工藝、分析多糖的理化性質(zhì)，對(duì)于三七多糖的科學(xué)開(kāi)發(fā)以及三七資源的綜合利用具有積極意義。微波輔助提取具有提取時(shí)間短、提取率高、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，在植物多糖提取方面具有較高的應(yīng)用價(jià)值[5]。本研究采用微波輔助提取分離三七多糖，采用激光粒度分析法探討提取機(jī)理，采用薄層色譜法分析多糖的單糖組成，并測(cè)定多糖的溶解性，為三七多糖的研究與開(kāi)發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

三七，2017年采收自云南文山，洗凈陰干并于干燥陰涼處保存。硅膠G薄層板(預(yù)制板)購(gòu)自青島海洋化工廠分廠；葡萄糖、鼠李糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖標(biāo)準(zhǔn)品，分析純，購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；無(wú)水乙醇、濃硫酸、苯酚、正丁醇、乙酸乙酯、吡啶、鹽酸、NaOH、對(duì)氨基苯甲酸、冰醋酸、正磷酸等均為分析純。

CW2000型超聲-微波聯(lián)合萃取儀(本實(shí)驗(yàn)中未使用超聲功能)，上海新拓儀器科技有限公司；BS224S型電子天平，德國(guó)Sartorius公司；722S型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海儀電分析儀器有限公司；MS2000型激光粒度分析儀，英國(guó)Malvern儀器公司。

1.2 三七多糖的提取

1.2.1微波輔助提取

三七用自來(lái)水、蒸餾水依次清洗后晾干，研磨后過(guò)篩(20、40、80、120、160、200目)，在50 ℃烘干。取4 g三七粉末，加入溫度為30 ℃的蒸餾水(80、120、160、180、240 mL)，混勻后浸泡(1.0、5.0、10.0、30.0、60.0 min)。然后將混合物移入超聲-微波聯(lián)合萃取儀，進(jìn)行微波輔助提取(0.5、1.0、3.0、5.0、10.0、20.0 min)。提取結(jié)束后，在4 000 r/min條件下離心10 min。取上清液，加入4倍體積的無(wú)水乙醇，在4 ℃冰箱放置12 h。而后在4 000 r/min條件下離心15 min，取沉淀，冷凍干燥后即得三七多糖樣品。

1.2.2傳統(tǒng)提取

除不施加微波輻照外，傳統(tǒng)提取的操作條件與微波輔助提取相同。三七清洗、晾干后，研磨過(guò)篩200目得到粉末。取4 g三七粉末，加入120 mL蒸餾水(30 ℃)，混勻后浸泡60.0 min，提取8.0 min(無(wú)微波處理)。離心，取上清液，醇沉后再次離心，取沉淀，冷凍干燥后得到多糖樣品。

1.3 三七多糖的定性分析

1.3.1Molish反應(yīng)

參考Caunii等[6]的方法，取α-萘酚3.75 g，用95%乙醇溶解，定容至25 mL，制得Molish試劑。取1 mg多糖，傾入試管，加蒸餾水1 mL溶解，然后加入Molish試劑2 mL，混勻后沿著試管壁緩緩加入1 mL濃硫酸，觀察顏色變化。

1.3.2單糖組分分析

參考Chang等[7]的方法，采用薄層色譜法測(cè)定三七多糖樣品的單糖組成。在安瓿瓶中加入1 g多糖和10 mL 4 mol/L三氟乙酸的水溶液，充氮?dú)? min后封口，搖勻，置120 ℃烘箱中水解3 h。然后冷卻至室溫，將水解液轉(zhuǎn)移到50 mL的圓底燒瓶中，用2 mL蒸餾水洗滌安瓿瓶，洗滌液并入圓底燒瓶，在60 ℃減壓蒸干，所得固體用2 mLφ=70%的乙醇充分溶解，用0.45 μm濾膜過(guò)濾后即得多糖水解物樣品溶液。以0.1 mg/mL的葡萄糖、鼠李糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖的乙醇溶液作為單糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液。吸取多糖水解物樣品溶液和標(biāo)準(zhǔn)品溶液各3 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，用展開(kāi)劑V(正丁醇)∶V(乙酸乙酯)∶V(吡啶)∶V(水)=6∶1∶5∶4展開(kāi)，待展開(kāi)劑滲透至距離薄層板上緣2 cm左右時(shí)取出薄層板，晾干后用相同展開(kāi)劑進(jìn)行二次展開(kāi)。展開(kāi)結(jié)束后將薄層板取出晾干，噴以對(duì)氨基苯甲酸溶液(0.5 g對(duì)氨基苯甲酸溶于9 mL冰醋酸中，依次加入10 mL水和0.5 mL 85%磷酸溶液，混勻)，置105 ℃烘箱中加熱10 min后觀察。

1.4 三七多糖的定量分析

參考本實(shí)驗(yàn)室建立的苯酚硫酸比色法[8]，以葡萄糖為對(duì)照單糖測(cè)定多糖含量。

1.5 激光粒度分析

參考Kwak等[9]的方法，對(duì)微波輔助提取、傳統(tǒng)提取處理后的三七粉末樣品以及未處理樣品進(jìn)行激光粒度分析，得到樣品粒度分布圖。

1.6 三七多糖溶解性的測(cè)定

采用本實(shí)驗(yàn)室方法[10]測(cè)定多糖溶解性。用鹽酸和NaOH配制pH值為1、3、5、7、9、11和13的水溶液。將45 mg三七多糖樣品分別傾入30 mL不同pH值的水溶液中(25 ℃)，立即以100 r/min的速度攪拌，記錄完全溶解所需時(shí)間。

1.7 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與數(shù)據(jù)分析

采用單因素試驗(yàn)方法考察浸泡時(shí)間、微波處理時(shí)間、液固比(即水體積與三七樣品質(zhì)量的比例)和粒度對(duì)三七多糖提取率的影響。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用4因素3水平即L9(34)正交試驗(yàn)方法優(yōu)化微波輔助提取的工藝條件，見(jiàn)表1。使用Yang等[10]方法計(jì)算多糖提取率。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)2～5次，求平均值。使用Microsoft Excel和SPSS 12.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，其中多重比較采用One-Way ANOVA分析，p<0.05、p<0.01分別表示差異顯著、極顯著。

2 結(jié)果與討論

2.1 微波輔助提取工藝優(yōu)化

2.1.1單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1.1 微波輔助提取時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響

在浸泡時(shí)間為60 min、液固比為50 mL/g、粒度為80目的條件下，微波輔助提取時(shí)間對(duì)三七多糖提取率的影響如圖1?？梢钥闯?，微波輔助提取時(shí)間短于10 min時(shí)，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，多糖提取率顯著升高(p<0.01)，在10 min時(shí)達(dá)到峰值；微波輔助提取時(shí)間超過(guò)10 min時(shí)，提取率顯著下降(p<0.01)。這可能是由于三七樣品中的多糖在微波輔助提取10 min后，大多數(shù)已經(jīng)溶出，繼續(xù)延長(zhǎng)微波處理時(shí)間加劇了微波對(duì)多糖的降解[5]，從而使提取率明顯下降。綜合考慮提取率、提取時(shí)間和能耗等因素，將微波輔助提取時(shí)間控制在10 min左右較適宜。

表1 正交試驗(yàn)的因素水平

圖1 微波處理時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響Fig.1 Effect of microwave duration on extraction yield of polysaccharides

2.1.1.2 浸泡時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響

在微波處理時(shí)間為10 min、液固比為50 mL/g、粒度為80目的條件下，浸泡時(shí)間對(duì)三七多糖提取率的影響如圖2。三七多糖的提取率隨著浸泡時(shí)間的延長(zhǎng)而升高。當(dāng)浸泡時(shí)間為60 min時(shí)，提取率最高(p<0.05)。為了增加多糖提取率，浸泡時(shí)間維持在60 min左右為宜。

圖2 浸泡時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響Fig.2 Effect of soaking time on extraction yield of polysaccharides

2.1.1.3 液固比對(duì)多糖提取率的影響

在微波處理時(shí)間為10 min、浸泡時(shí)間為30 min、粒度為80目的條件下，液固比對(duì)三七多糖提取率的影響如圖3。由圖3可知，當(dāng)液固比小于30 mL/g時(shí)，隨著液固比的增加，三七多糖的提取率顯著升高(p<0.01)；當(dāng)液固比大于30 mL/g時(shí)，提取率明顯下降(p<0.01)；當(dāng)液固比為30 mL/g時(shí)，提取率最高(11.5 mg/g)。Li等[11]在研究文冠果種子的微波輔助提取時(shí)發(fā)現(xiàn)，液固比對(duì)三萜皂苷提取率的影響也呈現(xiàn)出先增加后降低的趨勢(shì)。在常規(guī)的溶劑提取過(guò)程中，液固比越高，提取溶劑越多，提取率通常就越大[5]。但是，在微波輔助提取過(guò)程中，如果液固比超過(guò)一定范圍，提取溶劑的體積過(guò)大，可能會(huì)帶來(lái)以下問(wèn)題：1)提取溶劑吸收微波能量后的升溫幅度減?。?)攪拌混勻效果變差，不利于植物材料與提取溶劑的充分接觸，也不利于目標(biāo)化合物的擴(kuò)散、溶出[5]。這可能是液固比過(guò)高時(shí)三七多糖提取率反而降低的原因。綜合考慮提取率、溶劑用量等因素，將液固比控制在30 mL/g較為合適。

圖3 液固比對(duì)多糖提取率的影響Fig.3 Effect of ratio of liquid to solid on extraction yield of polysaccharides

2.1.1.4 粒度對(duì)多糖提取率的影響

在微波處理時(shí)間為10 min、浸泡時(shí)間為30 min、液固比為30 mL/g的條件下，粒度對(duì)三七多糖提取率的影響如圖4。當(dāng)粒度在20～160目區(qū)間內(nèi)逐漸增加時(shí)，三七多糖的提取率不斷升高(p<0.01)；但是，當(dāng)粒度超過(guò)160目時(shí)，增加粒度不會(huì)使提取率明顯提高(p>0.05)。因此，粒度選在160目左右較好，不宜超過(guò)200目。

圖4 粒度對(duì)多糖提取率的影響Fig.4 Effect of particle sizes on extraction yield of polysaccharides

2.1.2正交試驗(yàn)

由單因素實(shí)驗(yàn)可見(jiàn)，微波處理時(shí)間、浸泡時(shí)間、液固比、粒度對(duì)三七多糖的提取均有較大影響。為了進(jìn)一步優(yōu)化微波輔助提取工藝，選擇微波處理時(shí)間(A)、浸泡時(shí)間(B)、液固比(C)、粒度(D)4個(gè)因素進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)，見(jiàn)表2。由表2的極差分析結(jié)果可知，三七多糖的優(yōu)化提取工藝方案為A2B2C2D3，即微波處理時(shí)間為8 min，浸泡時(shí)間為60 min，液固比為30 mL/g，粒度為200目。方差分析結(jié)果見(jiàn)表3，可知4個(gè)因素對(duì)三七多糖的提取都具有極顯著影響(p<0.01)。雖然優(yōu)化提取方案(A2B2C2D3)在正交試驗(yàn)的9次實(shí)驗(yàn)中并未出現(xiàn)，但是與優(yōu)化提取方案最為接近的第4次實(shí)驗(yàn)(A2B1C2D3)的提取率(20.4 mg/g)顯著高于其他8次實(shí)驗(yàn)(p<0.01)，提示優(yōu)化提取方案很可能是較佳工藝條件。為了進(jìn)一步驗(yàn)證優(yōu)化提取方案，在該提取條件(A2B2C2D3)下進(jìn)行了提取實(shí)驗(yàn)，所得多糖提取率為21.0 mg/g，顯著高于正交試驗(yàn)中的最高提取率(20.4 mg/g)(p<0.05)，證明正交試驗(yàn)優(yōu)選的提取方案的確為較佳工藝條件。

2.2 微波輔助提取機(jī)理探究

為了比較微波輔助提取與傳統(tǒng)提取的提取效果，在浸泡時(shí)間為60 min、提取時(shí)間為8 min(無(wú)微波處理)、液固比為30 mL/g、粒度為200目的條件下進(jìn)行了5次傳統(tǒng)提取實(shí)驗(yàn)，所得平均提取率為12.7 mg/g，顯著低于微波輔助提取的平均提取率(21.0 mg/g)(p<0.05)。

表2 正交試驗(yàn)極差分析

表3 正交試驗(yàn)方差分析

為了探討微波輔助提取的機(jī)理，采用激光粒度分析法比較分析了微波輔助提取處理后的三七樣品、傳統(tǒng)提取處理后的三七樣品和未經(jīng)處理的三七樣品粉末的粒度分布，見(jiàn)圖5。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在小粒度范圍內(nèi)(0～50 μm)，傳統(tǒng)提取處理后樣品粉末的分布頻率高于微波輔助提?。辉诖罅６确秶鷥?nèi)(50～2 000 μm)，微波輔助提取處理后樣品粉末的分布頻率普遍高于傳統(tǒng)提取?？梢?jiàn)，同傳統(tǒng)提取相比，微波輔助提取可使三七樣品的粒度普遍增大。微波處理可能促進(jìn)了樣品粉末的水化和溶脹過(guò)程，使樣品結(jié)構(gòu)變得松散、膨脹，促進(jìn)了多糖從樣品中擴(kuò)散和溶出，從而提高了多糖的提取率。

圖5 不同方法制得樣品的激光粒度分布Fig.5 Particle sizes distribution of samples obtained from different extraction methods

2.3 多糖性質(zhì)表征

2.3.1Molish實(shí)驗(yàn)

采用較佳微波輔助提取工藝條件制得的多糖樣品為淺黃褐色固體，其Molish反應(yīng)呈陽(yáng)性，證明其含糖類物質(zhì)。

2.3.2單糖組成分析

三七多糖經(jīng)過(guò)酸水解后，其薄層色譜呈現(xiàn)出3個(gè)斑點(diǎn)，分別與葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖相對(duì)應(yīng)。這說(shuō)明，微波輔助提取得到的三七多糖主要由葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖3種單糖構(gòu)成，這與盛卸晃等[12]采用傳統(tǒng)提取得到的三七多糖的單糖組分相一致。

2.3.3溶解性分析

圖6 pH值對(duì)三七多糖溶解時(shí)間的影響Fig.6 Effect of different pH values on solubility of polysaccharides from Panax notoginseng

研究pH值對(duì)多糖溶解性的影響，對(duì)于多糖研究與開(kāi)發(fā)具有重要的參考意義[10]。pH值對(duì)三七多糖溶解時(shí)間的影響見(jiàn)圖6，可以看出，pH值對(duì)三七多糖樣品的溶解性影響較大。pH=3時(shí)，多糖的溶解時(shí)間最長(zhǎng)；pH>3時(shí)，溶解時(shí)間隨著pH值的增加而減少；pH=13時(shí)，溶解時(shí)間最短(60 s)?？梢?jiàn)，堿性環(huán)境比酸性環(huán)境可能更有利于三七多糖的溶解，原因可能是堿性環(huán)境下溶液中的氫氧根離子較多，使得富含羥基的多糖更易與水結(jié)合[13]，其具體機(jī)制需要進(jìn)一步探討。

3 結(jié) 論

微波處理時(shí)間、浸泡時(shí)間、液固比、粒度4個(gè)因素對(duì)三七多糖的微波輔助提取具有顯著影響。三七多糖的較佳微波輔助提取工藝條件為：微波處理時(shí)間，8 min；浸泡時(shí)間，60 min；液固比，30 mL/g；粒度，200目。微波輔助提取的多糖提取率顯著高于傳統(tǒng)提取。同傳統(tǒng)提取相比，微波輔助提取可使三七樣品的粒度普遍增大，說(shuō)明微波處理可能促進(jìn)了樣品粉末的水化和溶脹過(guò)程，使樣品結(jié)構(gòu)變得松散、膨脹，從而促進(jìn)了多糖從樣品中擴(kuò)散和溶出。三七多糖主要由葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖3種單糖構(gòu)成，pH值對(duì)其溶解性影響較大。本研究為三七資源的開(kāi)發(fā)與利用提供了參考。

致謝：實(shí)驗(yàn)材料中的三七由云南七丹藥業(yè)股份有限公司高明菊總工程師贈(zèng)送，在此表示衷心感謝。

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