俄羅斯卡爾梅克共和國傳統(tǒng)奶酪中細(xì)菌多樣性研究

任 敏， 李 晶， 侯強(qiáng)川， 孫志宏， 孫天松， 劉文俊

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)部奶制品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018)

俄羅斯卡爾梅克共和國是一個(gè)以草原畜牧業(yè)為主的國家，擁有豐富的羊奶和牛奶資源，當(dāng)?shù)貍鹘y(tǒng)奶酪是最古老的發(fā)酵食品之一[1]。傳統(tǒng)奶酪是以天然乳清作為發(fā)酵劑添加到牛奶中進(jìn)行發(fā)酵，排出乳清后將凝乳放入模具中成型制成[2]。眾所周知，微生物間的相互作用對傳統(tǒng)奶酪形成尤為重要，而作為發(fā)酵劑的天然乳清中包含著豐富且復(fù)雜的微生物群落。Masoud等[3]對丹麥原奶酪的研究表明，發(fā)酵劑中的細(xì)菌會(huì)成為奶酪中的優(yōu)勢菌群。然而，Almeida等[4]研究不同傳統(tǒng)奶酪時(shí)發(fā)現(xiàn)靜止嗜冷桿菌(Psychrobacterimmobilis)和假單胞菌(Pseudoalteromonashaloplanktis)等雖然最初并沒有作為發(fā)酵劑接種，但卻是發(fā)酵過程中的優(yōu)勢菌種。因此，了解傳統(tǒng)奶酪中的細(xì)菌群落組成，獲得優(yōu)勢菌群[5]，了解其發(fā)酵機(jī)理，同時(shí)挖掘新的微生物資源，對傳統(tǒng)奶酪產(chǎn)品的工業(yè)化、標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)和益生菌開發(fā)利用具有重要的意義，但目前針對俄羅斯卡爾梅克共和國傳統(tǒng)奶酪樣品中細(xì)菌多樣性的研究卻少之又少。

454焦磷酸測序技術(shù)被廣泛應(yīng)用于許多發(fā)酵產(chǎn)品中微生物多樣性的分析，例如發(fā)酵蔬菜、發(fā)酵乳以及奶酪等[6-9]。本研究應(yīng)用6份俄羅斯卡爾梅克共和國傳統(tǒng)奶酪樣品的454焦磷酸測序數(shù)據(jù)，通過生物信息學(xué)分析，以地域和奶酪中細(xì)菌群落的關(guān)系研究為側(cè)重點(diǎn)，對樣品中細(xì)菌多樣性進(jìn)行詳細(xì)分析，希望能夠充實(shí)俄羅斯傳統(tǒng)奶酪理論研究數(shù)據(jù)，為其中微生物的開發(fā)應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

6份傳統(tǒng)奶酪樣品采自俄羅斯卡爾梅克共和國，具體信息見表1。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

以本研究團(tuán)隊(duì)采用454焦磷酸測序技術(shù)獲得的6份奶酪樣品序列數(shù)據(jù)為分析對象，序列已上傳至MG-RAST數(shù)據(jù)庫，編號(hào)為No.4682839.3—4682844.3。

1.2.1高質(zhì)量序列的篩選

測序得到的原始數(shù)據(jù)確認(rèn)引物所在位置，認(rèn)為引物之間的區(qū)域?yàn)榭勺儏^(qū)，從原始序列中篩選可變區(qū)長度大于300 bp的序列，tag按照樣本-tag編號(hào)篩選，必須為首7位且不允許錯(cuò)配。控制整條序列上質(zhì)量大于20的堿基所占比例高于93%。經(jīng)過篩選，可以認(rèn)為提取出長度、質(zhì)量、引物、tag各方面均有效的高質(zhì)量序列[10-11]。

1.2.2高質(zhì)量序列的生物信息學(xué)分析

應(yīng)用QIIME(quantitative insights into microbial ecology)軟件對得到的高質(zhì)量序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析。用PyNAST[12]進(jìn)行校準(zhǔn)、排齊，在序列100%相似性下進(jìn)行UCLUST[13]歸并，建立無重復(fù)的16S rRNA序列，在給定相似度97%的水平上劃分分類操作單元(operational taxonomic units，OTU)。將去除含有嵌合體序列的OTU序列使用RDP(ribosomal database project)[14]和Greengenes(Version_3.8)[15]數(shù)據(jù)庫進(jìn)行序列同源性比對，并在分類學(xué)的門、綱、目、科、屬和種水平上進(jìn)行鑒定。使用FastTree[16]軟件構(gòu)建基于OTU代表性序列的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，隨后計(jì)算香農(nóng)指數(shù)(Shannon-Wiener index)、發(fā)現(xiàn)物種數(shù)(observed species)、超1(chao1)指數(shù)和辛普森(Simpson)指數(shù)共4個(gè)Alpha多樣性指標(biāo)，分別對樣品菌群構(gòu)成的豐度和多樣性進(jìn)行評(píng)價(jià)。同時(shí)，采用香農(nóng)多樣性指數(shù)(Shannon,s diversity index)和稀疏曲線(rarefaction curve)評(píng)估每個(gè)樣本測序的多樣性，并判斷當(dāng)前測序量是否能夠滿足后續(xù)分析的需要。使用UniFrac距離進(jìn)行加權(quán)(weighted)和非加權(quán)(unweighted)的主坐標(biāo)分析，揭示各個(gè)樣本之間菌群結(jié)構(gòu)的差異[17]。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌序列豐度和多樣性

6份奶酪樣品的454焦磷酸測序序列信息和α多樣性指數(shù)如表2。

由表2可知，6份奶酪樣品共得到89 393條高質(zhì)量細(xì)菌基因序列，每個(gè)樣品平均序列為14 899條(序列數(shù)范圍：13 485～17 261)。根據(jù)97%的序列相似度劃分分類操作單元(OTU)，共得到369條具有代表性的細(xì)菌OTU序列。結(jié)果顯示，R6號(hào)樣品的α多樣性指數(shù)均高于其余5份樣品，表明R6號(hào)樣品微生物多樣性最高。根據(jù)表2信息繪制樣品稀疏曲線圖(a)和香農(nóng)指數(shù)圖(b)分別用于分析樣品中微生物的豐度和多樣性，結(jié)果如圖1。

由圖1(a)可知，6份奶酪樣品的稀疏曲線均未進(jìn)入平臺(tái)期，這表明隨著測序量的增加，新的細(xì)菌種系將被發(fā)現(xiàn)。而圖1(b)顯示的Shannon曲線已經(jīng)飽和，這表明隨著測序量的增加細(xì)菌多樣性將不再改變，因此當(dāng)前測序量可以滿足后續(xù)分析的需要。

表2 樣品的測序序列信息和α多樣性指數(shù)

圖1 稀疏曲線和香農(nóng)指數(shù)圖Fig.1 Rarefaction curves and Shannon diversity index curves

2.2 樣品中細(xì)菌相對含量和構(gòu)成

進(jìn)一步使用BLAST同源性比對，采用RDP和Greengenes數(shù)據(jù)庫，將所有序列鑒定到7個(gè)門、50個(gè)屬。在門水平上，6份樣品主要由硬壁菌門(Firmicutes，80.15%)和變形菌門(Proteobacteria，19.80%)組成，如圖2。值得注意的是，R1-R4號(hào)樣品中Firmicutes都占有絕對優(yōu)勢(相對含量均在95%以上)，R6號(hào)樣品Firmicutes含量為74.6%，而R5號(hào)樣品中相對含量最高的菌門為Proteobacteria(85.1%)而并非Firmicutes(14.8%)。

除Proteobacteria和Frimicutes兩個(gè)菌門外，其余菌門相對含量較少，圖中未明顯顯示。圖2 門水平上奶酪樣品的細(xì)菌組成Fig.2 Relative abundance of major bacteria in cheeses at phylum level

在屬水平上，6份樣品中相對含量大于1%的優(yōu)勢菌屬包括乳球菌屬(Lactococcus，42.81%)、鏈球菌屬(Streptococcus，29.44%)、檸檬酸桿菌屬(Citrobacter，8.88%)、不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter，5.04%)、醋酸桿菌屬(Acetobacter，2.00%)、腸球菌(Enterococcus，1.96%)、巨型球菌(Macrococcus，1.89%)、明串珠菌屬(Leuconostoc，1.47%)和乳桿菌屬(Lactobacillus，1.23%)，如圖3。除此之外還鑒定到了一些相對含量較低的罕見菌屬。這些菌屬的鑒定豐富了本研究團(tuán)隊(duì)前期對該地區(qū)傳統(tǒng)奶酪樣品中優(yōu)勢菌屬的描述，更加全面地揭示了樣品的細(xì)菌多樣性。值得一提的是，6份樣品的優(yōu)勢菌屬出現(xiàn)了與門水平中大致相同的情況，即R1-R4號(hào)以及R6號(hào)樣品中的優(yōu)勢菌屬為Lactococcus或Streptococcus，而R5號(hào)樣品中的優(yōu)勢菌屬為Citrobacter和Acinetobacter。

圖3 屬水平上奶酪樣品的細(xì)菌組成Fig.3 Relative abundance of major bacteria in cheeses at genus level

2.3 基于OTU水平上傳統(tǒng)奶酪樣品中細(xì)菌組成

由于α多樣性分析是基于OTU水平的，因此基于OTU水平對樣品中細(xì)菌菌群做進(jìn)一步分析，見圖4。由圖4可知，6份樣品共產(chǎn)生369個(gè)OTU，6份樣品共享的OTU僅有11個(gè)，占OTU總數(shù)的2.98%，但其包含的序列數(shù)為40 671，占質(zhì)控合格總序列數(shù)的45.5%。每份樣品獨(dú)有的OTU有239個(gè)，占OTU總數(shù)的64.8%。由此可知，6份樣品中共同存在的OTU數(shù)目很少，但是包含的序列信息卻很多，那么這部分OTU很有可能反映出了樣品中的核心菌群，但還有很大一部分OTU是每份樣品獨(dú)有的。因此，即使6份樣品的核心菌群在很大程度上相似，但其特有的微生物使樣品間存在差異。

圖4 奶酪樣品中OTU出現(xiàn)次數(shù)Fig.4 Frequency of occurences of OTU in cheeses

圖5進(jìn)一步反映了奶酪樣品中核心OTU的相對含量，結(jié)果顯示6份樣品主要的菌群為Lactococcus和Streptococcus，是發(fā)酵乳制品中常用的發(fā)酵劑菌種。

圖5 奶酪樣品間核心OTU的相對含量 Fig.5 Relative abundance of core OTU in cheeses

為了探究6份傳統(tǒng)奶酪樣品中核心菌群間的相關(guān)關(guān)系，根據(jù)核心菌屬的相對含量計(jì)算其相關(guān)性，結(jié)果如圖6。由圖6可知，克雷伯氏菌屬(Klebsiella)與腸桿菌屬(Enterobacter)和Lactobacillus之間有極顯著的正相關(guān)關(guān)系(p<0.01)。

** p<0.01，上方和左側(cè)的非加權(quán)組平均法聚類樹均依照各核心菌屬相對含量進(jìn)行計(jì)算。圖6 奶酪樣品間核心菌屬的相關(guān)性Fig.6 Correlation of core bacterial community among cheeses

2.4 基于多元統(tǒng)計(jì)方法的傳統(tǒng)奶酪樣品細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)比較

基于UniFrac距離的加權(quán)和非加權(quán)主坐標(biāo)(principal coordinate analysis, PCoA)法對6份傳統(tǒng)奶酪樣品細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。之前的研究僅僅將這些樣品數(shù)據(jù)看作一個(gè)整體與其他國家和地區(qū)發(fā)酵產(chǎn)品進(jìn)行比較，并未詳細(xì)分析6份樣品本身存在的菌群結(jié)構(gòu)差異。本研究基于加權(quán)和非加權(quán)UniFrac距離進(jìn)行主坐標(biāo)分析，結(jié)果如圖7 。由圖7可見，第一主成分和第二主成分的貢獻(xiàn)率分別為88.33%、6.91%和29.86%、23.63%，從圖7(a)可知，采自卡爾梅克共和國亞什庫爾鎮(zhèn)地區(qū)的大部分樣品有明顯聚類趨勢。

圖7 基于非加權(quán)與加權(quán)UniFrac距離的主坐標(biāo)分析得分圖Fig.7 PCoA scores plot based on unweighted and weighted UniFrac analysis

3 討 論

目前，采用454焦磷酸測序技術(shù)對發(fā)酵乳制品細(xì)菌多樣性的研究越來越多，本研究團(tuán)隊(duì)也采用該測序技術(shù)對俄羅斯卡爾梅克共和國地區(qū)的發(fā)酵酸牛奶[18]以及傳統(tǒng)奶酪樣品中的細(xì)菌微生物進(jìn)行了一些研究。但對該地區(qū)的傳統(tǒng)奶酪樣品只進(jìn)行了優(yōu)勢菌屬的簡要描述，并將其作為對照與其他國家和地區(qū)的發(fā)酵乳[19]和奶酪[20]進(jìn)行了比較，并沒有對奶酪樣品本身細(xì)菌群落的構(gòu)成進(jìn)行詳細(xì)分析。

本研究基于454焦磷酸測序數(shù)據(jù)對俄羅斯卡爾梅克共和國的6份傳統(tǒng)奶酪樣品進(jìn)行細(xì)菌多樣性的分析。在門水平上，F(xiàn)irmicutes和Proteobacteria為優(yōu)勢菌門；在屬水平上，6份傳統(tǒng)奶酪樣品共鑒定到50個(gè)細(xì)菌屬。楊彥榮等[21]使用純培養(yǎng)方法對該地區(qū)的傳統(tǒng)奶酪樣品進(jìn)行乳酸菌分離鑒定，共得到37株乳酸菌，分別歸屬于Enterococcus、Lactobacillus和Leuconostoc3個(gè)菌屬。侯強(qiáng)川等[6]利用純培養(yǎng)和454焦磷酸測序技術(shù)結(jié)合的方法對俄羅斯卡爾梅克共和國的2份發(fā)酵蔬菜進(jìn)行細(xì)菌多樣性研究，結(jié)果顯示，與傳統(tǒng)方法相比，采用高通量測序技術(shù)的確能夠鑒定到更多的細(xì)菌種類，從而全面了解樣品中的細(xì)菌多樣性。

依據(jù)這6份傳統(tǒng)奶酪樣品中細(xì)菌相對含量的不同，可以將這些細(xì)菌分為三大類。第一類是由Lactococcus和Streptococcus組成的優(yōu)勢菌屬(相對含量大于10%)，這個(gè)結(jié)果與許多地區(qū)奶酪中的優(yōu)勢菌屬一致，例如Quigley 等[22]采用454焦磷酸測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)愛爾蘭奶酪中的優(yōu)勢菌屬為Lactococcus。Dalmasso等[23]對意大利傳統(tǒng)奶酪的研究發(fā)現(xiàn)其優(yōu)勢菌屬也是由Lactococcus、Streptococcus和Lactobacillus組成。有研究表明，這兩個(gè)菌屬的某些菌株有助于奶酪的酸化、凝乳以及酪蛋白水解，而這些功能對奶酪的形成至關(guān)重要；此外，奶酪的風(fēng)味也會(huì)受到菌株代謝產(chǎn)物的影響，例如氨基酸和脂肪代謝等[24]。第二類是傳統(tǒng)奶酪樣品中的次優(yōu)勢菌屬(相對含量在1%～10%)，包括Citrobacter、Acinetobacter、Acetobacter、Enterococcus、Macrococcus、Leuconosto和Lactobacillus。有研究顯示Leuconosto與Enterococcus能夠?qū)δ汤业奈兜篮唾|(zhì)地產(chǎn)生影響[25]，Lactobacillus中瑞士乳桿菌(Lactobacillushelveticus)憑借其蛋白水解能力可以減少奶酪苦味[26]。值得一提的是，在個(gè)別樣品中發(fā)現(xiàn)了Macrococcus，該菌屬中最典型的菌種為溶酪大球菌(Macrococcuscaseolyticus)，吳燕濤等[27]對Macrococcuscaseolyticus的發(fā)酵特性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)該菌種具有脂肪與蛋白分解活性，由此推斷在奶酪中也可能起到相同作用。第三類是在個(gè)別樣品中檢出含量很低的菌屬(相對含量在0.1%～1%)，包括有克呂沃菌屬(Kluyvera)、漫游球菌屬(Vagococcus)、泛生菌屬(Pantoea)、金黃桿菌屬(Chryseobacterium)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、葡糖桿菌屬(Gluconobacter)、Enterobacter、Klebsiella、假單胞菌(Pseudomonas)、水細(xì)菌屬(Enhydrobacter)和勞特菌屬(Raoultella)等罕見的菌屬。Dalmasso等[23]對意大利奶酪進(jìn)行454焦磷酸測序分析時(shí)也鑒定到了相對含量較低的Vagococcus和Klebsiella等菌屬。這些菌屬的存在大多意味著產(chǎn)品加工過程中衛(wèi)生條件較差，但這些菌屬所占比例較少，并且也沒有出現(xiàn)主要的食源性病原體。基于本研究結(jié)果，俄羅斯卡爾梅克共和國地區(qū)可能需要加快對傳統(tǒng)奶酪制品的現(xiàn)代化和工業(yè)化，使其品質(zhì)得到保證。

與其他采自同一地區(qū)的5份樣品不同，R5號(hào)樣品的優(yōu)勢菌屬是Citrobacter和Acinetobacter。此外，基于多元統(tǒng)計(jì)方法對6份樣品中的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較分析，結(jié)果顯示采自同一區(qū)域的4份樣品(R1-R4)有明顯的聚類趨勢，與R5號(hào)樣品存在明顯的分離趨勢。這可能是由于不同地區(qū)之間的氣候因素、制作工藝以及地理環(huán)境不同等因素導(dǎo)致的。目前也有越來越多的研究表明，環(huán)境因素也是影響乳制品微生物多樣性的原因。Sun等[28]采用高通量測序技術(shù)對采自中國內(nèi)蒙古、四川、甘肅以及蒙古國的17個(gè)傳統(tǒng)酸奶樣品進(jìn)行分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，傳統(tǒng)酸奶中菌群多樣性與其所在地理位置有密切的聯(lián)系。Liu等[18]和Xu等[29]的研究表明，來自不同地理位置的自然發(fā)酵乳中微生物多樣性存在明顯差異。

4 結(jié) 論

本研究應(yīng)用454焦磷酸測序數(shù)據(jù)對6份采自俄羅斯卡爾梅克共和國的傳統(tǒng)奶酪樣品進(jìn)行細(xì)菌多樣性的分析。研究發(fā)現(xiàn)，其中5份樣品的優(yōu)勢菌屬與其他國家和地區(qū)的奶酪樣品基本一致，證實(shí)了傳統(tǒng)奶酪中的優(yōu)勢菌屬大多為Lactococcus和Streptococcus，但僅有R5號(hào)樣品其優(yōu)勢菌屬為Citrobacter和Acinetobacter。此外，本研究在奶酪樣品中鑒定到的Vagococcus和Klebsiella等菌屬，意味著該地區(qū)奶酪制作過程中衛(wèi)生條件較差，提示當(dāng)?shù)貍鹘y(tǒng)奶酪產(chǎn)品急需現(xiàn)代化和工業(yè)化。6份傳統(tǒng)奶酪樣品之間存在的菌群結(jié)構(gòu)差異，這可能意味著地理環(huán)境不同對奶酷菌群產(chǎn)生了影響，進(jìn)一步的原因需增加樣品量進(jìn)行深入分析。

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