香菇柄中5′-核苷酸的酶法提取及組成分析

李順峰， 王安建， 張雪彥， 田廣瑞， 劉麗娜， 魏書信， 高帥平

(1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)副產(chǎn)品加工研究中心， 河南 鄭州 450002； 2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院， 河南 鄭州 450002)

香菇是一種營養(yǎng)豐富、風(fēng)味獨(dú)特的藥食同源食用菌[1]，其含有的多糖、多酚、不飽和脂肪酸和膳食纖維等功能活性成分，在提高人體免疫力、抗腫瘤、降血脂、抗氧化等方面都具有良好的保健功效[2-6]，深受消費(fèi)者喜愛。而且，文獻(xiàn)[7]指出，與其他可食蘑菇相比，香菇中的5′-核糖核苷酸含量較高，尤其是5′-鳥苷酸(5′-GMP)、5′-肌苷酸(5′-IMP)和5′-黃苷酸(5′-XMP)和5′-腺苷酸(5′-AMP)對(duì)香菇的鮮味有增效作用。鮮味是人體味覺的第五感，具有開胃、可口和令人愉悅的感覺[8]。近年來的研究表明，鮮味可以調(diào)控人體的食欲和對(duì)食物的滿足感，可減少對(duì)高能量和高糖高脂食物的攝取量，從而降低肥胖，也可幫助病人或老年人改善食欲[9]。

香菇柄是香菇深加工過程中的副產(chǎn)物，約占香菇干質(zhì)量的15%～30%。研究表明，香菇柄不僅在營養(yǎng)成分上與香菇菇蓋基本接近，而且膳食纖維含量遠(yuǎn)高出香菇菇蓋[10]。然而，由于菇柄中含有較多的纖維素類物質(zhì)，致其口感粗糙，咀嚼度差，大多數(shù)被廢棄處理，全國每年廢棄的香菇柄有數(shù)萬噸，造成了極大的資源浪費(fèi)[11]。也正是由于菇柄中纖維類物質(zhì)的包裹，使得菇柄中的風(fēng)味成分很難釋放，其鮮香味遠(yuǎn)不如香菇菇蓋濃郁醇厚[12]。

與香菇開發(fā)利用的研究報(bào)道相比，對(duì)香菇柄加工利用的報(bào)道現(xiàn)在較少。目前，僅有關(guān)于香菇柄面包[13]、香菇柄蜜餞[14]、香菇柄松[15]、香菇柄酒精飲料[16]等菇柄加工產(chǎn)品的報(bào)道，而關(guān)于香菇柄中呈鮮物質(zhì)提取和利用的報(bào)道較少[12, 17]。相較于香菇菇蓋，香菇柄中纖維含量較高，本文采用纖維素酶酶解香菇柄提取5′-核苷酸，并分析其組成比例和含量，以期為香菇柄風(fēng)味物質(zhì)的利用和香菇柄調(diào)味料的開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

香菇柄，購自鄭州信基調(diào)味品城；纖維素酶(食品級(jí)，10 000 U·g-1)，南寧龐博生物工程有限公司；磷酸二氫鉀、高碘酸鈉、乙二醇、抗壞血酸、四水合鉬酸銨等均為國產(chǎn)分析純；5′-鳥苷酸(5′-GMP)、5′-尿苷酸(5′-UMP)、5′-胞苷酸(5′-CMP)、5′-腺苷酸(5′-AMP)、5′-肌苷酸(5′-IMP)，購自Sigma-Aldrich公司；5′-黃苷酸(5′-XMP)，購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；實(shí)驗(yàn)用水為蒸餾水。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1纖維素酶酶解提取香菇柄中5′-核苷酸單因素實(shí)驗(yàn)

香菇柄40 ℃烘干后，粉碎過60目篩，稱取香菇柄粉2.0 g，分別考察纖維素酶不同加酶量(0.1%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%)、液固比(mL∶g)(10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1)、酶解溫度(30、40、50、60、70 ℃)、酶解時(shí)間(0.5、1、2、3、4、5 h)、酶解pH值(3.0、3.8、4.6、5.4、6.2、7.0)對(duì)香菇柄中5′-核苷酸提取得率的影響。采用過碘酸氧化法[18]測(cè)定5′-核苷酸，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.2.2纖維素酶酶解提取香菇柄中5′-核苷酸正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取加酶量、酶解溫度、酶解pH值、酶解時(shí)間4個(gè)因素，采用L9(34)正交設(shè)計(jì)對(duì)纖維素酶酶解提取5′-核苷酸工藝進(jìn)行優(yōu)化。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與水平見表1。

表1 正交因素水平

1.2.3纖維素酶酶解提取香菇柄中5′-核苷酸的組成分析

5′-核苷酸的組成測(cè)定參考Taylor等[19]和Mau等[20]方法并稍作修改。

1.2.3.1 色譜條件

HPLC為美國戴安Ultimate 3000，配有PDA-3000檢測(cè)器；色譜柱為安捷倫ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱(5 μm，4.6×250 mm)；流動(dòng)相為0.2 mol·L-1磷酸二氫鉀∶水=30∶70；檢測(cè)波長為254 nm；進(jìn)樣量10 μL；柱溫30 ℃；流速1.0 mL·min-1。

1.2.3.2 標(biāo)品及混合標(biāo)品的配制

準(zhǔn)確稱取5′-GMP、5′-UMP、5′-CMP、5′-AMP、5′-IMP、5′-XMP各0.100 g，用超純水溶解后配成1mg·mL-1各核苷酸標(biāo)準(zhǔn)液。取核苷酸標(biāo)準(zhǔn)液各1 mL，定容至10 mL，得6混標(biāo)溶液，各單核苷酸質(zhì)量濃度為100 μg·mL-1，并依次配成70、50、30、10 μg·mL-1核苷酸混合標(biāo)準(zhǔn)液，分別吸取10 μL測(cè)定，依據(jù)峰面積繪制各5′-核苷酸標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3.3 香菇柄5′-核苷酸組成測(cè)定

纖維素酶酶解提取得到的香菇柄5′-核苷酸過0.2 μm濾膜，取10 μL上樣測(cè)定，并依據(jù)保留時(shí)間確定各5′-核苷酸，然后按峰面積計(jì)算各5′-核苷酸含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1加酶量對(duì)5′-核苷酸得率的影響

在液固比為20∶1，酶解溫度為50 ℃，酶解時(shí)間為2 h，酶解pH值為5.4的條件下，采用不同加酶量(0.1%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%)進(jìn)行酶解提取，考察加酶量對(duì)香菇柄中5′-核苷酸提取得率的影響。加酶量對(duì)5′-核苷酸得率的影響見圖1。

圖1 加酶量對(duì)5′-核苷酸得率的影響Fig.1 Effect of cellulase amount on 5′-nucleotides content

從圖1可以看出，在加酶量為0.1%～0.6%時(shí)，隨著加酶量的增大，5′-核苷酸得率呈逐漸增大的趨勢(shì)，并在加酶量為0.6%時(shí)，5′-核苷酸得率達(dá)到較高水平(2.62 mg·g-1)，此后繼續(xù)增大加酶量，5′-核苷酸得率雖有所增加，但與加酶量為0.6%時(shí)的得率相比較無顯著差異(p>0.05)。這可能是由于在較低酶濃度條件下，底物能夠完全與酶結(jié)合破壞細(xì)胞壁，促使內(nèi)容物釋放，但在較高酶濃度情況下，底物不能對(duì)酶達(dá)到飽和而使一部分酶分子無法發(fā)揮作用[12, 21]。因此，從經(jīng)濟(jì)方面考慮，選擇加酶量為0.6%較為適宜。

2.1.2液固比對(duì)5′-核苷酸得率的影響

在加酶量為0.6%，酶解溫度為50 ℃，酶解時(shí)間為2 h，酶解pH值為5.4條件下，考察不同液固比10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1對(duì)香菇柄中5′-核苷酸提取得率的影響(見圖2)。由圖2可知，當(dāng)液固比由10∶1增加到20∶1時(shí)，5′-核苷酸得率由2.44 mg·g-1顯著升高至2.76 mg·g-1，此后繼續(xù)增大液固比，5′-核苷酸得率呈緩慢升高趨勢(shì)，與液固比為20∶1時(shí)相比較，5′-核苷酸得率均未達(dá)到顯著水平(p>0.05)，并且當(dāng)液固比增大至50∶1時(shí)，5′-核苷酸得率僅比液固比為20∶1時(shí)增加了0.16 mg·g-1，考慮后續(xù)工作和節(jié)約資源等綜合因素，選擇液固比20∶1較為合適。

圖2 液固比對(duì)5′-核苷酸得率的影響Fig.2 Effect of liquid-solid ratios on yield of 5′-nucleotides

2.1.3酶解溫度對(duì)5′-核苷酸得率的影響

在加酶量為0.6%，液固比(mL∶g)為20∶1，酶解時(shí)間為2 h，酶解pH值為5.4條件下，考察不同酶解溫度(30、40、50、60、70 ℃)對(duì)香菇柄中5′-核苷酸提取得率的影響。隨著酶解溫度的升高，5′-核苷酸得率呈先升高后下降的趨勢(shì)(見圖3)。在酶解溫度為40 ℃時(shí)，5′-核苷酸得率最高，為3.18 mg·g-1，這一結(jié)果可能與酶的性質(zhì)有關(guān)，每種酶都有一個(gè)最適作用溫度，在較低溫度下，隨著溫度上升酶活不斷增強(qiáng)，酶解破壁作用加強(qiáng)，但溫度超過最適溫度后，隨著溫度的上升酶部分或全部變性而失去酶活力[12,17,21]。故選擇40 ℃作為適宜的酶解溫度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖3 酶解溫度對(duì)5′-核苷酸得率的影響Fig.3 Effect of enzymatic hydrolysis temperatures on yield of 5′-nucleotides

2.1.4酶解時(shí)間對(duì)5′-核苷酸得率的影響

在加酶量為0.6%，液固比20∶1，酶解溫度為40 ℃，酶解pH值為5.4條件下，考察不同酶解時(shí)間(0.5、1、2、3、4、5 h)對(duì)香菇柄中5′-核苷酸提取得率的影響(見圖4)。從圖4可以看出，隨酶解時(shí)間的延長，5′-核苷酸得率呈逐漸升高趨勢(shì)，當(dāng)酶解時(shí)間為4 h時(shí)，5′-核苷酸得率達(dá)到較高水平(3.66 mg·g-1)，為酶解時(shí)間在0.5 h時(shí)得率的1.77倍，此后繼續(xù)延長酶解時(shí)間至5 h時(shí)，其5′-核苷酸得率僅比4 h時(shí)高了1.45%。這是由于隨著酶解時(shí)間的延長，纖維素酶能充分地與底物反應(yīng)，破壞細(xì)胞壁，從而使5′-核苷酸不斷溶出；當(dāng)細(xì)胞壁被破壞到一定程度時(shí)，繼續(xù)延長酶解時(shí)間，5′-核苷酸得率升高趨緩[12,17,21]。故選取4 h作為較佳酶解時(shí)間。

圖4 酶解時(shí)間對(duì)5′-核苷酸得率的影響Fig.4 Effect of enzymatic hydrolysis time on yield of 5′-nucleotides

2.1.5酶解pH值對(duì)5′-核苷酸得率的影響

在加酶量為0.6%，液固比20∶1，酶解溫度為40 ℃，酶解時(shí)間為4 h條件下，考察不同酶解pH值(3.0、3.8、4.6、5.4、6.2、7.0)對(duì)香菇柄中5′-核苷酸提取得率的影響(見圖5)。由圖5可知，在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)，隨著pH值升高，5′-核苷酸得率逐漸升高，在pH值 4.6時(shí)，5′-核苷酸得率達(dá)到最大(3.89 mg·g-1)，隨著pH值繼續(xù)增大，5′-核苷酸得率呈逐漸下降的趨勢(shì)。這可能是由于在適宜的pH值作用范圍內(nèi)，酶活性較高，能充分發(fā)揮酶的專一水解作用[21]，故選擇4.6作為較適宜酶解pH值。

圖5 酶解pH值對(duì)5′-核苷酸得率的影響Fig.5 Effect of enzymatic hydrolysis pH values on yield of 5′-nucleotides

2.2 正交優(yōu)化試驗(yàn)

以5′-核苷酸得率為指標(biāo)，對(duì)香菇柄5′-核苷酸的纖維素酶酶解條件進(jìn)行優(yōu)化，正交試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

從表2中的極差R可以看出，各因素對(duì)5′-核苷酸得率影響大小依次為B>D>C>A，即影響5′-核苷酸得率的最主要因素是酶解溫度，其他依次為酶解時(shí)間、酶解pH值、加酶量。由表2中的k值可以看出，在液固比20∶1條件下，纖維素酶酶解提取香菇柄中5′-核苷酸的優(yōu)化工藝組合為A3B2C3D2，即加酶量0.8%，酶解溫度40 ℃，pH值為5.4，酶解時(shí)間4 h。經(jīng)驗(yàn)證，在此優(yōu)化條件下纖維素酶酶解提取香菇柄中5′-核苷酸得率為(4.08±0.11)mg·g-1，高于單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果和正交表內(nèi)組合結(jié)果。但這一結(jié)果，顯著低于吳關(guān)威等[17]采用分光光度法測(cè)定纖維素酶提取的香菇柄中呈味核苷酸(I+G)的含量(32.8 mg·g-1)，這可能與采用的測(cè)定方法不同有關(guān)[18]，本文采用的過碘酸氧化法可以專一測(cè)定5′-核苷酸。

2.3 5′-核苷酸組成分析

圖6 纖維素酶酶解提取香菇柄中5′-核苷酸各組分含量Fig.6 Contents of 5′-nucleotides components from shiitake mushroom stipe extracted by cellulase

研究采用HPLC測(cè)定纖維素酶酶解提取香菇柄5′-核苷酸含量(4.57 mg·g-1)，如圖6。高于分光光度法所測(cè)結(jié)果，說明5′-核苷酸含量高低受所采用測(cè)定方法的影響。因HPLC法可直接測(cè)定各5′-單核苷酸含量，是一種比較適宜的5′-核苷酸測(cè)定方法。與前人研究相比，本研究結(jié)果與Chen等[22]所測(cè)定香菇柄5′-核苷酸含量(4.23 mg·g-1)相近，高于趙靜等[23]香菇菌湯中5′-核苷酸含量(1.50 mg·g-1)。本研究所得5′-核苷酸由5′-GMP、5′-UMP、5′-CMP、5′-AMP、5′-IMP和5′-XMP組成，且所提取5′-核苷酸主要由5′-CMP、5′-AMP和5′-XMP組成，分別占5′-核苷酸的36.67%、43.69%和16.01%。而Chen等[22]僅檢測(cè)到香菇柄中的4種5′-核苷酸，未檢測(cè)到5′-IMP和5′-XMP。本研究所測(cè)定纖維素酶酶解香菇柄所得的5′-GMP和5′-AMP含量為2.00mg·g-1，高于Andō[24]報(bào)道的香菇柄中5′-GMP和5′-AMP的含量(0.8 mg·g-1)。呈鮮味核苷酸由5′-GMP、5′-IMP、5′-XMP和5′-AMP組成[20]，本研究所測(cè)香菇柄中含有所有的呈鮮味核苷酸，所提取的香菇柄中呈鮮味核苷酸質(zhì)量比為2.86 mg·g-1，占5′-核苷酸的62.63%，高于Chen等[22]所測(cè)定香菇柄中呈鮮味核苷酸質(zhì)量比1.00 mg·g-1，其占5′-核苷酸23.64%的結(jié)果，這可能與所測(cè)定到的5′-核苷酸組成有關(guān)。

3 結(jié) 論

通過單因素實(shí)驗(yàn)和正交試驗(yàn)纖維素酶酶解反應(yīng)條件的優(yōu)化，得出纖維素酶酶解提取香菇柄中5′-核苷酸的優(yōu)選工藝條件為液固比20∶1，加酶量0.8%，酶解溫度40 ℃，pH值5.4，酶解時(shí)間4 h，此時(shí)5′-核苷酸得率為4.08 mg·g-1。

經(jīng)HPLC檢測(cè)，纖維素酶酶解提取香菇柄5′-核苷酸由5′-GMP、5′-UMP、5′-CMP、5′-AMP、5′-IMP和5′-XMP組成，5′-核苷酸含量高于采用過碘酸氧化法所測(cè)定結(jié)果，其中呈鮮味核苷酸占5′-核苷酸的62.63%。

參考文獻(xiàn)：

[1] 弋淮. 香菇栽培技術(shù)研究[J]. 農(nóng)業(yè)科技與信息, 2017(6): 60-61.

[2] WANG X M, ZHANG J, WU L H, et al. A mini-review of chemical composition and nutritional value of edible wild-grown mushroom from China[J]. Food Chemistry, 2014, 151(s): 279-285.

[3] ZHANG Z, Lü G, PAN H, et al. Effects of different drying methods and extraction condition on antioxidant properties of shiitake (Lentinusedodes)[J]. Food Science and Technology Research, 2009, 15(5): 547-552.

[4] CHEN H, JU Y, LI J, et al. Antioxidant activities of polysaccharides fromLentinusedodesand their significance for disease prevention[J]. International Journal of Biological Macromolecules, 2012, 50(1): 214-218.

[5] ZHAO Y M, WANG J, WU Z G, et al. Extraction, purification and anti-proliferative activities of polysaccharides fromLentinusedodes[J]. International Journal of Biological Macromolecules, 2016, 93: 136-144.

[6] CHIEN R C, YEN M T, MAU J L. Antimicrobial and antitumor activities of chitosan from shiitake stipes, compared to commercial chitosan from crab shells[J]. Carbohydrate Polymers, 2016, 138: 259-264.

[7] DERMIKI M, PHANPHENSOPHON N, MOTTRAM D S, et al. Contributions of non-volatile and volatile compounds to the umami taste and overall flavour of shiitake mushroom extracts and their application as flavour enhancers in cooked minced meat[J]. Food Chemistry, 2013, 141(1): 77-83.

[8] PHAT C, MOON B, LEE C. Evaluation of umami taste in mushroom extracts by chemical analysis, sensory evaluation, and an electronic tongue system[J]. Food Chemistry, 2016, 192: 1068-1077.

[9] POOJARY M M, ORLIEN V, PASSAMONTI P, et al. Improved extraction methods for simultaneous recovery of umami compounds from six different mushrooms[J]. Journal of Food Composition and Analysis, 2017, 63: 171-183.

[10] 戴龍. 香菇柄纖維低聚化及其產(chǎn)品的研制[D]. 長春: 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué), 2014.

[11] 劉麗娜, 王安建, 李順峰, 等. 香菇柄熱風(fēng)干燥特性及微粉性質(zhì)研究[J]. 食品工業(yè)科技, 2016, 37(5): 126-131.

LIU L N, WANG A J, LI S F, et al. Study on hot air drying characteristics of mushroom stem and its properties of micro-powder[J]. Science and Technology of Food Industry, 2016, 37(5): 126-131.

[12] 高虹, 程薇, 史德芳, 等. 香菇柄復(fù)合酶解工藝研究[J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué), 2014,23: 5823-5827.

GAO H, CHENG W, SHI D F, et al. Hydrolysis effects of cellulase and nuetral protease onLentinusedodesstipe[J]. Hubei Agricultural Sciences, 2014,23: 5823-5827.

[13] LIN L Y, TSENG Y H, LI R C, et al. Quality of shiitake stipe bread[J]. Journal of Food Processing and Preservation, 2008, 32(6): 1002-1015.

[14] 翟洪民. 香菇柄蜜餞制作工藝[J]. 保鮮與加工, 2006(1): 20.

[15] 王安建, 劉麗娜, 魏書信, 等. 香菇柄松加工工藝的研究[J]. 農(nóng)產(chǎn)品加工(學(xué)刊), 2013(1): 48-50.

WANG A J, LIU L N, WEI S X, et al. Processing technology of the mushroom stem floss[J]. Academic Periodical of Farm Products Processing, 2013(1): 48-50.

[16] LIN P H, HUANG S Y, MAU J L, et al. A novel alcoholic beverage developed from shiitake stipe extract and cane sugar with variousSaccharomycesstrains[J]. LWT-Food Science and Technology, 2010, 43(6): 971-976.

[17] 吳關(guān)威, 李敏, 劉吟, 等. 纖維素酶法提取香菇柄中呈味核苷酸工藝研究[J]. 中國調(diào)味品, 2010, 35(12): 41-43,59.

WU G W, LI M, LIU Y, et al. Studies on extraction of flavor nucleotide from the foot body ofLentinusedodeswith cellulose enzyme[J]. China Condiment, 2010, 35(12): 41-43,59.

[18] 陳鈞輝, 陶力, 李俊, 等. 生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)：第3版[M]. 北京: 科學(xué)出版社, 2003：131-134.

[19] TAYLOR M W, HERSHEY H V, LEVINE R A, et al. Improved method of resolving nucleotides by reversed-phase high-performance liquid chromatography[J]. Journal of Chromatography, 1981, 219(1): 133-139.

[20] MAU J L, LIN H C, CHEN C C. Non-volatile components of several medicinal mushrooms[J]. Food Research International, 2001, 34(6): 521-526.

[21] PAN S, WU S. Cellulase-assisted extraction and antioxidant activity of the polysaccharides from garlic[J]. Carbohydrate Polymers, 2014, 111: 606-609.

[22] CHEN W, LI W, YANG Y, et al. Analysis and evaluation of tasty components in the pileus and stipe ofLentinulaedodesat different growth stages[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2015, 63(3): 795-801.

[23] 趙靜, 丁奇, 孫穎, 等. 香菇菌湯及酶解液中滋味成分及呈味特性的對(duì)比分析[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(24): 99-104.

ZHAO J, DING Q, SUN Y, et al. Comparison of taste compounds and taste characteristics of shiitake mushroom soup and enzymatic hydrolysate[J]. Food Science, 2016, 37(24): 99-104.