調控油茶果生刺盤孢bZIP轉錄因子CfAp1的生物學功能*

高亞蘭 何苑皋 李 河

(南方人工林病蟲害防控國家林業(yè)和草原局重點實驗室 森林有害生物防控湖南省重點實驗室經(jīng)濟林培育與保護省部共建教育部重點實驗室 中南林業(yè)科技大學 長沙 410004)

油茶(Camelliaoleifera)是我國特有的木本食用油料樹種，與油棕、油橄欖和椰子并稱為世界四大木本食用油料植物。油茶主要分布于我國長江流域以南的高山及丘陵地帶，與糧食作物生態(tài)位互補；另外還有保持水土、涵養(yǎng)水源、調節(jié)氣候等各種生態(tài)功能，在我國區(qū)域經(jīng)濟中具有重要地位(陳永忠等2013)。油茶種子可榨油供食用，是我國特有的優(yōu)質植物油，富含角鯊烯和黃酮類物質等多種生理活性物質，具有降血脂、降膽固醇、延緩動脈粥樣硬化、增強人體免疫力等營養(yǎng)保健作用(許俊道， 2018)。

油茶炭疽病是我國油茶種植區(qū)的主要病害，可引起油茶大量落果、落蕾，甚至整株衰亡，對油茶生長、產(chǎn)量和品質具有嚴重影響。我國油茶產(chǎn)區(qū)每年因炭疽病造成油茶籽減產(chǎn)20%左右，重病區(qū)可達40%以上。油茶病果種子含油量僅為健康種子的一半，甚至更低(靳愛仙等， 2009)。筆者課題組于2014年首次報道果生刺盤孢(Colletotrichumfructicola)是油茶炭疽病的病原菌(李河等， 2014)，進一步研究發(fā)現(xiàn)我國油茶炭疽病是由多種刺盤孢屬真菌侵染所致，病原菌種類主要有果生刺盤孢(C.fructicola)、暹羅刺盤孢(C.siamense)、 膠孢刺盤孢(C.gloeosporioides)、 山茶刺盤孢(C.camelliae)和卡斯特刺盤孢(C.karstii)等，其中果生刺盤孢分離率最高，為70%左右，分布在全國90%以上的油茶種植區(qū)(Lietal., 2016; 李河等， 2016; 2017; 李河， 2018)。致病力測試結果表明，果生刺盤孢對油茶葉的致病力最強 (李河等， 2019)。上述研究結果表明果生刺盤孢是我國油茶炭疽病的主要流行致病菌。

目前，主要采用化學殺菌劑防治油茶炭疽病(陳紹紅等， 2007)。但由于病原菌易變，我國油茶炭疽病原菌已產(chǎn)生比較嚴重的抗藥性(李河等， 2019)。因此，闡明油茶炭疽病原菌的致病分子機制，對開發(fā)新的殺菌劑靶標具有重要意義。然而，調控植物病原菌致病的基因網(wǎng)絡十分復雜，往往多種基因協(xié)同作用。bZIP(Basic leucine zipper)轉錄因子是普遍存在于動植物及微生物中的一類轉錄因子，包含參與寡聚化作用的亮氨酸拉鏈區(qū)以及與特異DNA序列相結合堿性區(qū)，這2個區(qū)域以二聚體的形式結合DNA。bZIP轉錄因子在病原真菌中大量存在，主要參與調控病菌生長發(fā)育和致病等過程(Natorffetal.， 2003; Etxebesteetal.， 2008; Guoetal.， 2010; Xiaoetal.， 2010)。本文擬以油茶果生刺盤孢菌bZIP轉錄因子CfAp1為對象，研究其生物學功能，為揭示其致病分子機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

野生型(wild type，WT)菌株為筆者實驗室首次分離鑒定的油茶炭疽病優(yōu)勢流行致病菌果生刺盤孢菌CFLH16菌株，前期已完成全基因組測序。突變體及回補菌株為本試驗獲得。

1.2 CfAP1基因序列分析

根據(jù)稻瘟病菌(Magnaportheoryzae)中MoAp1蛋白的氨基酸序列(MGG_12814)在果生刺盤孢菌全基因組數(shù)據(jù)庫中進行Blastp分析，獲得與其同源的CfAp1蛋白序列。根據(jù)CfAp1蛋白的氨基酸序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中獲得其他物種的同源蛋白的氨基酸序列，利用Mega7.0軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3 CfAP1基因敲除突變體的獲得

根據(jù)同源重組原理構建CfAP1基因敲除載體。以野生型菌株CFLH16的基因組DNA為模板，分別用引物對bZIP45-1F/bZIP45-2R和bZIP45-3F/bZIP45-4R進行PCR擴增獲得上、下臂片段，PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后作模板；利用引物Hyg F/Hyg R擴增潮霉素抗性篩選基因HPH，最后以上下臂片段和潮霉素基因片段為模板，以引物對bZIP45-1F/bZIP45-4R進行over-lap PCR擴增出CfAP1基因敲除載體，經(jīng)純化后用于果生刺盤孢菌的原生質體轉化。

采用PEG介導法把敲除載體片段轉化至果生刺盤孢菌的原生質體中，在含有潮霉素的TB3培養(yǎng)基中培養(yǎng)3天。利用基因內引物bZIP45-7F/bZIP45-8R和臂外引物bZIP45-5F/H885R分別進行PCR擴增篩選潮霉素抗性轉化子，電泳驗證。引物bZIP45-7F/bZIP45-8R不能擴增出目的條帶，同時滿足引物bZIP45-5F/H885R可擴增出目的條帶的轉化子為CfAP1基因敲除突變體。本文所涉及的引物見表1。

1.4 CfAP1基因敲除突變體回補菌株的獲得

設計引物對bZIP45-9F/bZIP45-10R，從果生刺盤孢菌中擴增含有啟動子CfAP1基因回補片段，PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后與線性pYF11共轉入酵母感受態(tài)細胞XK-125形成pYF11::CfAP1互補載體，酵母細胞涂布于SD-Trp固體培養(yǎng)基上篩選，置于28 ℃、黑暗條件下培養(yǎng)3天，將SD-Trp固體培養(yǎng)基上長出的酵母置于YPD液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)12 h，利用引物bZIP45-7F/GFPR進行PCR鑒定陽性克隆，提取轉化成功的質粒轉入感受態(tài)大腸桿菌(Escherichiacoli)JM109中；經(jīng)轉化后的大腸桿菌細胞涂布于LB平板上，并置于37 ℃、黑暗條件下培養(yǎng)3天，然后將LB固體平板上長出的大腸桿菌置于LB液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)10 h，提取大腸桿菌質粒，利用引物bZIP45-9F/GFPR驗證后送至測序驗證；經(jīng)測序驗證正確后，采用PEG介導法將質粒轉入ΔCfap1-8菌株原生質體中，對在含有博來霉素培養(yǎng)基上能生長的轉化子進行綠色熒光篩選、PCR驗證回補菌株。

表1 引物序列Tab.1 Primers used in this study

1.5 轉錄因子CfAp1的生物學表型測定

1.5.1 PDA培養(yǎng)基上生長測定 使用打孔器(Φ=8 mm)分別取野生型菌株CFLH16、突變體菌株ΔCfap1-8及基因回補菌株ΔCfap1/AP1的菌餅接種到PDA培養(yǎng)基上，并置于28 ℃黑暗倒置培養(yǎng)3天，每個菌株3個重復，試驗重復3次。

1.5.2 突變體產(chǎn)孢率測定 用PDB搖瓶培養(yǎng)野生型菌株CFLH16、突變體菌株ΔCfap1-8及基因回補菌株ΔCfap1/AP1產(chǎn)孢(Wangetal.， 2017)。使用血小板計數(shù)板計數(shù)法分別統(tǒng)計分生孢子產(chǎn)量，每個菌株3個重復，試驗重復3次。

1.5.3 突變體對H2O2耐受性測定 將野生型菌株 CFLH16、突變體菌株ΔCfap1-8及基因回補菌株ΔCfap1/AP1活化后，從菌落邊緣取菌餅(Φ=8 mm)分別接種到含0、2.5和5 mmol·L-1的H2O2的PDA培養(yǎng)基中央，置于28 ℃、黑暗倒置培養(yǎng)3天。每個菌株3個重復，試驗重復3次。測量記錄菌落直徑，分別計算其在含不同濃度H2O2的PDA培養(yǎng)基上的抑制率。

1.5.4 突變體對滲透壓脅迫測定 將野生型菌株 CFLH16、突變體菌株ΔCfap1-8及基因回補菌株ΔCfap1/AP1活化后，從菌落邊緣取菌餅(Φ=8 mm)分別接種到含0、0.7 mol·L-1NaCl的PDA平板中央，置于28 ℃、黑暗倒置培養(yǎng)3天，測量記錄菌落直徑，計算在NaCl PDA培養(yǎng)基上的抑制率。每個菌株3個重復，試驗重復3次。

1.5.5 突變體致病力測定 為了評估突變體菌株對油茶葉的致病力變化，將野生型菌株 CFLH16、突變體菌株ΔCfap1-8及基因回補菌株ΔCfap1/AP1活化后，從菌落邊緣取菌餅(Φ=8 mm)接種至油茶葉片背面邊緣，置于黑暗中28 ℃下保濕培養(yǎng)，觀察并測量病斑大小。為明確傷口對侵染結果的影響，針刺油茶葉片，將菌絲塊接種至油茶葉傷口處，黑暗中28 ℃下保濕培養(yǎng)，觀察并測量病斑大小。每個菌株3個重復，試驗重復3次。

1.5.6 突變體附著胞的形成率及膨壓測定 將CFLH16、ΔCfap1-8及ΔCfap1/AP13種菌的分生孢子分別用無菌水洗滌3次，調節(jié)孢子液濃度至1×105個·mL-1，取10 μL滴至疏水玻片中央，28 ℃下保濕孵育8 h后，觀察附著胞的形成并統(tǒng)計數(shù)量；取20 μL 2 mol·L-1的甘油浸泡附著胞，10 min后統(tǒng)計塌陷率。每個菌株3個重復，試驗重復3次。

1.6 數(shù)據(jù)分析

圖1 CfAp1結構域預測以及系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.1 Domain prediction and phylogenetic analysis of CfAp1A： 通過SMART網(wǎng)站(http:∥smart.embl-heidelberg.de/)預測CfAp1蛋白的結構域；BRLZ為堿性亮氨酸拉鏈結構域，數(shù)字代表氨基酸的序號. B： Mega7.0軟件的鄰近相連法構建CfAp1及其他參考菌種同源蛋白氨基酸序列系統(tǒng)進化樹，自舉檢驗重復1 000次以獲得各分支的支持率；進化樹分支上的數(shù)字表示支持率；0.1為標尺，表示分支長度；每個參考菌株名稱前的編號是該菌株CfAp1同源蛋白氨基酸序列的GenBank登錄號。A: The structure of CfAp1 was predicted using the SMART website (http:∥smart.embl-heidelberg.de/); BRLZ: basic-leucine zipper domain; the number represents the serial number of the amino acid. B: The phylogenetic tree was constructed using the neighbour-joining (NJ) method and analysed with 1 000 bootstrap replicates in Mega7.0; the number on the branch is the support calculated with 100 bootstrap replicates in the NJ analysis; the scale bar indicates the branch length. The number in front of each reference taxon is GenBank accession number of amino acid sequence orthologous to CfAp1.

使用Microsoft Excel 2010對試驗數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，顯著性差異水平設定為0.05，當P≤0.05時對比組間有差異顯著性；顯著性差異水平設定為0.01, 當P≤0.01時對比組間有差異極顯著性。

2 結果及分析

2.1 CfAp1的鑒定及系統(tǒng)發(fā)育樹分析

根據(jù)稻瘟菌中MoAp1蛋白的氨基酸序列(bZIP_Mo0045/MGG_12814)，在油茶果生刺盤孢菌全基因組數(shù)據(jù)庫中進行BLASTP比對，鑒定到1個同源的蛋白，命名為CfAp1。CfAP1基因全長1 804 bp，編碼566個氨基酸。該蛋白含有1個堿性亮氨酸拉鏈結構域(BRLZ)和2個PAP1結構域以及2個未知功能的結構域(圖1A)。系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)，果生刺盤孢菌中的轉錄因子CfAp1氨基酸序列與膠孢刺盤孢菌的bZIP轉錄因子PAP1同源性最高(圖1B)，支持率高達到100%，而與稻溫病菌距離較遠。

2.2 CfAP1基因敲除突變體的獲得及驗證

敲除載體的構建策略見圖2A。目標基因內引物bZIP45-7F/bZIP45-8R在野生型基因組中能擴增出單一的目的條帶，突變體中擴增不出目的條帶；采用目標基因上游引物bZIP45-5F和潮霉素基因上引物H855R通過PCR方法在突變體基因組中能擴增出單一的條帶，而野生型中檢測不到條帶(圖2B)。綜合2對引物的檢測結果，表明轉化子Cfap1-8中CfAP1基因已經(jīng)被成功敲除。為驗證突變體的表型是否為CfAP1基因敲除引起，選擇ΔCfap1-8作為受體菌株，將構建好的互補質粒導入突變體中，轉化子在博萊霉素平板上篩選?？共┤R霉素的轉化子通過PCR驗證，獲得CfAP1基因成功互補的轉化子ΔCfap1/AP1。

圖2 CfAP1基因敲除突變體的獲得Fig.2 Generation of the gene deletion mutants of CfAP1A： 基因敲除策略的模式圖; B： Primer1是bZIP45-5F/H855R；Primer2是bZIP45-7F/ bZIP45-8R。M： 分子量為5 000 Marker；-： H2O陰性對照；+： WT陽性對照；ΔCfap1-8： 突變體。A: Schematic diagram of the deletion strategy for the CfAP1 gene. B: primer1 is bZIP45-5F/H855R, primer2 is bZIP45-7F/ bZIP45-8R; M: DL5000 marker; -: H2O negative control; +: WT positive control; ΔCfap1-8: mutant.

2.3 CfAP1基因對果生刺盤孢菌營養(yǎng)生長的影響

在PDA培養(yǎng)基上，果生刺盤孢菌突變體菌株ΔCfap1-8生長速率與野生型及回補菌株間無明顯差異(圖3A、3C)，但氣生菌絲顯著減少(圖3B)。以上結果表明CfAP1基因不影響果生刺盤孢菌的營養(yǎng)生長，但調控其氣生菌絲的生長。

圖3 CfAP1基因敲除突變體菌絲體生長Fig.3 Growth of CfAP1 gene-deletion mutantsA： 野生型菌株(CFLH16)、突變體及回補菌株在PDA培養(yǎng)基上28 ℃黑暗倒置培養(yǎng)3天的生長情況。 B： 野生型菌株(CFLH16)、突變體及回補菌株的菌落側視圖。C： 野生型菌株(CFLH16)、突變體及互補菌菌落直徑差異統(tǒng)計分析。字母相同者表示在0.05水平上差異不顯著。A: The wild-type strain (CFLH16),ΔCfap1-8, and complemented strains were inoculated on PDA media and cultured at 28 ℃ in the dark for 3 days. B: Colony side views are displayed. C： Statistical analysis of the colony diameter variations. Error bars are standard deviation and the same capitals represent no significant difference on P>0.05．

2.4 CfAP1基因參與調控果生刺盤孢菌分生孢子的形成

在真菌侵染過程中分生孢子起著十分重要的作用(Huangetal.， 2016； Fangetal.， 2018； Yangetal.， 2018)。本文研究CfAP1基因對果生刺盤孢菌分生孢子的形成情況，結果發(fā)現(xiàn)突變體ΔCfap1-8只能產(chǎn)生較少量分生孢子，與野生型和回補菌株相比差異顯著(圖4)，表明CfAP1基因參與調控果生刺盤孢菌分生孢子的形成。

2.5 CfAP1基因缺失降低了果生刺盤孢菌對H2O2脅迫應答

CfAP1基因敲除突變體對H2O2耐受性較野生型顯著降低，突變體ΔCfap1-8在含2.5、5 mmol·L-1H2O2的PDA平板上菌絲生長受到明顯抑制(圖5A)；敲除突變體菌絲生長抑制率較野生型及回補菌株分別增加13.5%(2.5 mmol·L-1)和22.7%(5 mmol·L-1)(圖5B)，表明CfAP1基因參與果生刺盤孢菌對外源H2O2脅迫的應答。

圖4 CfAP1基因缺失突變體分生孢子數(shù)量統(tǒng)計分析Fig.4 The conidial quantitative statistical diagram of CfAP1 gene deleted mutants.不同小寫字母者表示在0.01水平上差異極顯著。 Error bars are standard deviation and different lowercases represent significantly difference at P≤0.01.

2.6 CfAP1基因參與應答果生刺盤孢菌的滲透壓脅迫

CfAP1基因敲除突變體對NaCl耐受性較野生型顯著降低，突變體ΔCfap1-8在含0.7 mol·L-1NaCl 的PDA平板上菌絲生長受到顯著抑制(圖6A)；敲除突變體菌絲生長抑制率較野生型及回補菌株增加8.8%(圖6B)，這表明CfAP1基因參與應答果生刺盤孢菌的滲透壓脅迫。

2.7 CfAP1基因參與調控果生刺盤孢菌的致病力

圖5 CfAP1基因缺失突變對氧壓脅迫的敏感性測定Fig.5 Oxygen stress sensitivity test of CfAP1 gene-deletion mutantsA： 野生型、ΔCfap1-8突變體和回補菌株分別接種于含有0、2.5和5 mmol·L-1的H2O2的PDA培養(yǎng)基上的菌落生長情況。 B： 菌株在不同的氧壓脅迫培養(yǎng)基中生長抑制率統(tǒng)計分析. 誤差線采用的是標準偏差；小寫字母不同者表示在0.01水平上差異極顯著.A: The wild-type strain (CFLH16),ΔCfap1-8, and complemented strains were inoculated on PDA plates containing 0、2.5 and 5 mmol·L-1 H2O2,respectively. B： Statistical analysis of the inhibition rate of the indicated strains on different stressors. Error bars are standard deviation and different lowercases represent significantly difference at P≤0.01.

無傷葉片在5天后可在接種野生型和回補菌株處觀察到典型病斑，而接種ΔCfap1-8突變體菌餅只能觀察到較小病斑，統(tǒng)計分析表明病斑直徑差異顯著(P≤0.01，圖7A、7C)。有傷葉片3天后可在接種野生型及回補菌株傷口處觀察到病斑，而突變體菌株只能引起較小的病斑，且病斑大小差異顯著(P≤0.01，圖7B、7D)。以上結果表明，CfAP1基因參與調控果生刺盤孢菌的致病力，并且傷口有助于病菌對油茶葉片的侵染。

2.8 CfAP1基因參與調控果生刺盤孢菌附著胞的形成及膨壓

野生型CFLH16附著胞形成數(shù)量為突變體ΔCfap1-8附著胞形成量的2.6倍(圖8A、8B)，統(tǒng)計分析差異顯著(P≤0.01)。附著胞主要依靠膨壓產(chǎn)生的機械穿透力侵入植物角質層，因此推測ΔCfap1-8致病力減弱與附著胞膨壓有關。采用2 mol·L-1濃度的甘油檢測附著胞的膨壓(圖8C)。CfAP1基因敲除突變體ΔCfap1-8附著胞塌陷率較野生型和回補菌株高出37.3%，統(tǒng)計分析差異極顯著(P≤0.01)。以上結果表明，CfAP1基因參與調控果生刺盤孢菌附著胞的形成及其內部膨壓。

3 討論

圖6 CfAP1基因缺失突變體對滲透壓脅迫的敏感性測定Fig.6 Osmotic sensitivity test of CfAP1 gene-deletion mutantsA： 野生型、ΔCfap1-8突變體和回補菌株接種在含有0.7 mol·L-1 NaCl的PDA培養(yǎng)基上的菌落生長情況。 B： 菌株在不同的滲透壓脅迫培養(yǎng)基中生長抑制率統(tǒng)計分析. 誤差線采用的是標準偏差； 小寫字母不同者表示在0.01水平上差異極顯著. A: The wild-type strain (CFLH16),ΔCfap1-8, and complemented strains were inoculated on PDA plates containing 0.7 mol·L-1 NaCl. B: Statistical analysis of the inhibition rate of the indicated strains on different stressors. Error bars are standard deviation and different lowercases represent significantly difference at P<0.01.

圖7 CfAP1基因缺失突變體對油茶葉片的致病力Fig.7 Pathogenicity of CfAP1 gene deleted mutants to oil-tea leavesA、B： 野生型菌株、回補菌株和突變體的菌餅分別接種在無傷和有傷的油茶葉片上； C:無傷葉片病斑大小； D: 有傷葉片病斑大小。小寫字母不同者表示在0.01水平上差異極顯著。 A and B: the wild type strain CFLH16, CfAP1 deletion mutant and the complemented strains were inoculated unwounded leaves and on wounded leaves; C: Statistical analysis of the disease lesion size of wounded leaves; D: Statistical analysis of the disease lesion size of unwounded leaves. Error bars are standard deviation and different lowercases represent significantly difference at P≤0.01.

圖8 CfAP1基因缺失突變體附著胞Fig.8 Appressorium in CfAP1 gene deleted mutantsA： 突變體ΔCfap1-8能形成少量附著胞； B： 附著胞形成率； C： 附著胞塌陷率。誤差線采用的是標準差；大寫字母不同者表示在0.05水平上差異顯著，小寫字母不同者表示在0.01水平上差異極顯著。A:The CfAP1 gene deletion mutant can form a small amount appressorium; B: Statistical analysis of the rate of appressorium formation on glass surface; C:Appressorium collapse rate. Error bars are standard deviation and different capitals represent significantly difference at P≤0.05, different lowercases represent significantly difference at P≤0.01.

果生刺盤孢是油茶炭疽病的優(yōu)勢流行致病菌。本研究在果生刺盤孢菌中鑒定到了1個具bZIP結構域的轉錄因子CfAp1，并對該轉錄因子的生物學功能進行了研究。轉錄因子CfAp1參與調控油茶果生刺盤孢的生長發(fā)育、產(chǎn)孢、響應環(huán)境脅迫和致病力，本研究結果為開發(fā)果生刺盤孢的新型殺菌劑提供了潛在靶標。筆者實驗室前期對油茶果生刺盤孢部分基因的功能進行研究，結果表明CfPMK1、CfHAC1和CfSNF1等基因參與調控油茶果生刺盤孢生長發(fā)育、脅迫應答和致病力(李河等2018；姚權等2019；Zhangetal., 2019)，這與轉錄因子CfAp1的功能相似，說明參與調控果生刺盤孢致病的基因網(wǎng)絡十分復雜，可能存在多種基因的協(xié)同作用，需要深入研究致病基因及相關網(wǎng)絡調控致病的分子機制，為制定油茶炭疽病防治策略提供理論依據(jù)。

病原菌在侵染植物的過程中會受到各種環(huán)境因子的脅迫。本研究發(fā)現(xiàn)，果生刺盤孢菌CfAP1基因缺失突變體ΔCfap1-8對H2O2十分敏感，說明轉錄因子CfAp1參與應答H2O2脅迫，這與Guo(2011)對稻瘟病菌MoAp1基因的研究結果一致。另外，在滲透壓脅迫試驗中發(fā)現(xiàn)，ΔCfap1-8對0.7 mol·L-1的NaCl耐受性較野生型和回補菌株顯著性降低，表明果生刺盤孢菌的CfAP1基因參與外源NaCl脅迫的應答。李河(2018)等的研究發(fā)現(xiàn)果生刺盤孢的CfPMK1基因也參與NaCl脅迫應答，這表明在該菌中不止一種基因參與滲透壓脅迫應答。

致病力是病原菌所具有損害寄主植物和引起病變的能力。本研究發(fā)現(xiàn)，果生刺盤孢菌CfAP1基因缺失突變體ΔCfap1-8致病力顯著降低，說明CfAp1轉錄因子參與調控果生刺盤孢菌的致病力。但在稻瘟病菌中，基因MoAP1缺失會導致稻瘟菌喪失致病性(Guoetal., 2011)，表明CfAp1轉錄因子和MoAp1轉錄因子都參與調控致病力，但對病菌的致病力的調控程度不同，AP1基因對稻瘟病菌的致病力影響更大。

分生孢子在病原菌繁殖和致病過程中起著重要作用。果生刺盤孢主要通過分生孢子進行傳播侵染，利用附著胞內部的黑色素層產(chǎn)生的巨大膨壓推動侵染釘刺穿寄主表皮細胞致使寄主植物感病(Weiretal., 2012)。本研究發(fā)現(xiàn)，果生刺盤孢菌CfAP1基因敲除突變體ΔCfap1-8菌株分生孢子形成能力顯著降低，說明CfAp1轉錄因子參與調控分生孢子的形成。李河(2018)研究發(fā)現(xiàn)，CfPMK1基因也參與油茶果生刺盤孢菌分生孢子的形成，這表明在該菌中多種基因參與調控其分生孢子的形成。Guo等(2011)的研究發(fā)現(xiàn)，稻瘟病菌中MoAP1基因缺失會導致稻瘟病菌的分生孢子明顯變長、變細，而本研究中轉錄因子CfAp1參與調控產(chǎn)孢率但并不影響分生孢子的形態(tài)，這表明AP1基因在不同的物種中功能并不完全相同。

分生孢子產(chǎn)生的附著胞是病原菌侵染植物的重要結構。在適宜的環(huán)境條件下，分生孢子會萌發(fā)，芽管頂端膨大形成附著胞，附著胞分泌黏狀物，黏附于寄主植物表面，形成纖細針狀感染菌絲侵入寄主角質層吸取營養(yǎng)。張俊祥(2019)研究發(fā)現(xiàn)，CgCMK1基因缺失導致蘋果炭疽葉枯病菌(C.gloeosporioides)不能形成附著胞，從而導致了蘋果炭疽葉枯病菌完全喪失了致病性。李河(2018)研究發(fā)現(xiàn)，CfPMK1基因缺失導致油茶果生炭疽病菌完全不能形成附著胞，同樣完全喪失了致病力。在本研究中，CfAP1基因突變體的附著胞形成率減少了51%，進一步對附著胞膨壓測定發(fā)現(xiàn)，CfAP1基因敲除突變體附著胞膨壓顯著減小，這可能是其致病力下降的重要原因。然而，Sun等(2016)對膠孢刺盤孢菌CgAP1基因研究發(fā)現(xiàn)，該基因既不影響膠孢刺盤孢附著胞的產(chǎn)生，也不影響附著胞的膨壓。這是否由于CfAP1基因在不同病原種類中的生物學功能也存在差異，還需要進一步研究。研究果生刺盤孢轉錄因子CfAp1調控的靶基因以及它們的生物學功能，揭示CfAp1轉錄調控的分子機制，為油茶炭疽病的防治提供依據(jù)。

4 結論

果生刺盤孢是油茶炭疽病的優(yōu)勢流行致病菌，本研究發(fā)現(xiàn)bZIP轉錄因子CfAp1參與調控油茶果生刺盤孢的生長發(fā)育、產(chǎn)孢、響應環(huán)境脅迫和致病力，該結果為開發(fā)果生刺盤孢的新型殺菌劑提供了潛在靶標。