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    咪達(dá)唑侖調(diào)控PI3K/AKT信號(hào)通路對(duì)高糖誘導(dǎo)心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡的影響

    2020-10-17 03:01:36丹,劉佳,陳
    關(guān)鍵詞:咪達(dá)唑侖高糖心肌細(xì)胞

    吳 丹,劉 佳,陳 丹

    (四川省廣安市人民醫(yī)院,四川 廣安 638500)

    糖尿病性心肌病是糖尿病患者的主要并發(fā)癥,是患者長(zhǎng)期高血糖所導(dǎo)致的特異性心肌病變[1]。其發(fā)病機(jī)制是復(fù)雜和多因素的,包括氧化應(yīng)激增加、鈣處理受損、腎素-血管緊張素系統(tǒng)上調(diào)、底物代謝改變、線粒體功能障礙[2-3]。研究表明,咪達(dá)唑侖對(duì)缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的新生大鼠心肌細(xì)胞凋亡具有抑制作用[4],可以改善大鼠心肌氧化應(yīng)激,保護(hù)心肌免受缺血再灌注損傷[5]。在大鼠心肌缺血再灌注損傷的模型中,咪達(dá)唑侖聯(lián)合右美托咪定可以提高蛋白激酶B(Protein kinase B,AKT)的磷酸化水平,起到心肌保護(hù)作用[6]。然而,咪達(dá)唑侖是否可以減輕糖尿病性心肌病中心肌細(xì)胞的凋亡和氧化應(yīng)激損傷尚不清楚。磷酸肌醇3激酶(Phospoinositide 3-kinase,PI3K)/AKT信號(hào)通路在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和凋亡中起關(guān)鍵作用[7]。PI3K/AKT信號(hào)通路的激活已被證實(shí)參與了針對(duì)高血糖誘導(dǎo)的心臟損傷的保護(hù)[8-9]。本實(shí)驗(yàn)探討咪達(dá)唑侖對(duì)高糖誘導(dǎo)心肌細(xì)胞H9C2損傷的影響及PI3K/AKT信號(hào)通路在其中的作用。

    1 材料與方法

    1.1 材料 心肌細(xì)胞H9C2(中科院上海細(xì)胞庫(kù));胎牛血清(FBS)、DMEM培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司);咪達(dá)唑侖(江蘇恩華藥業(yè)有限公司);PI3K/AKT特異性抑制劑LY294002(美國(guó)Sigma-Aldrich公司);細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(CCK-8)(日本Dojindo公司);辣根過氧化物酶(HRP)偶聯(lián)的二抗(上??党缮锕?;Annexin V-FITC/碘化丙啶(PI)細(xì)胞凋亡試劑盒、增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光液(ECL)(南京凱基公司);SOD、MAD檢測(cè)試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)研究所);PVDF膜(美國(guó)Bio-Rad公司);兔抗PI3K單克隆抗體、兔抗磷酸化PI3K(p-PI3K)單克隆抗體、兔抗AKT單克隆抗體、兔抗磷酸化AKT(phospho-AKT,p-AKT)單克隆抗體、兔抗Caspase-3單克隆抗體、兔抗GAPDH單克隆抗體(美國(guó)Cell Signaling Technology公司)。

    1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 將心肌細(xì)胞H9C2在添加10% FBS的DMEM培養(yǎng)基中,在5% CO2、95%空氣和37℃培養(yǎng),每2天換液1次。

    1.3 實(shí)驗(yàn)分組與處理 將細(xì)胞分為對(duì)照組(給予5.5 mmol/L葡萄糖)、高糖組(給予35 mmol/L葡萄糖[10])、高糖+低劑量藥物組(給予5 ng/mL咪達(dá)唑侖和35 mmol/L葡萄糖)、高糖+中劑量藥物組(給予10 ng/mL咪達(dá)唑侖和35 mmol/L葡萄糖)、高糖+高劑量藥物組(給予20 ng/mL咪達(dá)唑侖和35 mmol/L葡萄糖)、高糖+LY294002組(給予35 mmol/L葡萄糖和10 μmol/L LY294002[11])、高糖+高劑量藥物+LY294002組(給予20 ng/mL咪達(dá)唑侖、LY294002和35 mmol/L葡萄糖)。各處理組孵育24 h后,收獲細(xì)胞以檢查細(xì)胞活性、細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激和蛋白表達(dá)。

    1.4 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞活性 將心肌細(xì)胞H9C2以1×104個(gè)/mL的密度接種在96孔板中,在37℃下孵育,并使用CCK-8評(píng)估細(xì)胞活性。根據(jù)1.3中進(jìn)行指定的處理后,將10 μL CCK-8溶液添加到每孔中,然后將96孔板在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h。使用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的吸光度(OD)值,其平均值用以表示細(xì)胞活性。每組3個(gè)復(fù)孔,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

    1.5 流式細(xì)胞術(shù)評(píng)估細(xì)胞凋亡 心肌細(xì)胞H9C2經(jīng)過指定的處理后,收集1×105個(gè),遵循凋亡檢測(cè)試劑盒的步驟,加入500 μL Binding Buffer重懸,之后加入5 μL Annexin V-FITC混勻和5 μL碘化丙啶混勻,室溫黑暗中反應(yīng),15 min后FACS Calibur流式細(xì)胞儀評(píng)估細(xì)胞凋亡。

    1.6 Western blot檢測(cè)Caspase3、p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT蛋白表達(dá) 經(jīng)過指定的處理后,收獲心肌細(xì)胞H9C2,并在4℃下用細(xì)胞裂解液裂解30 min,定量后通過10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳對(duì)蛋白(30 μg)進(jìn)行分離,并轉(zhuǎn)移至PVDF膜。在室溫下,用5%的脫脂牛奶將膜封閉60 min,然后與抗Caspase3(1∶1 000稀釋)、抗p-PI3K(1∶1 000稀釋)、抗PI3K(1∶1 000稀釋)、抗p-AKT(1∶1 000稀釋)、抗AKT(1∶1 000稀釋)、抗GAPDH(1∶2 000稀釋)一抗孵育過夜。與HRP偶聯(lián)的山羊抗兔二抗(1∶3 000稀釋)一起孵育,在室溫下放置1.5 h。使用ELC可視化反應(yīng)信號(hào),之后掃描、ImageJ軟件進(jìn)行分析。以GAPDH為對(duì)照,測(cè)定Caspase3、p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT蛋白表達(dá)。

    1.7 比色法測(cè)定SOD活性和MDA含量 依照SOD、MDA試劑盒的檢測(cè)步驟,心肌細(xì)胞H9C2經(jīng)過指定的處理后,收獲上清液,進(jìn)行SOD活性和MDA含量測(cè)定。

    2 結(jié)果

    2.1 咪達(dá)唑侖對(duì)高糖誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷中凋亡及細(xì)胞活性的影響 CCK-8、流式細(xì)胞術(shù)和Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示(見圖1和表1),與對(duì)照組相比,高糖組心肌細(xì)胞H9C2的OD值降低,細(xì)胞凋亡率增加,Caspase3蛋白表達(dá)量升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。高糖+低劑量藥物組的細(xì)胞活性、凋亡率和Caspase3蛋白表達(dá)相比于高糖組,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與高糖組或高糖+低劑量藥物組相比,高糖+中、高劑量藥物組心肌細(xì)胞H9C2的細(xì)胞活性逐漸增強(qiáng),凋亡率逐漸減弱,Caspase3蛋白表達(dá)水平降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。與高糖+中劑量藥物組相比,高糖+高劑量藥物組的心肌細(xì)胞H9C2活性升高,凋亡率降低,Caspase3蛋白表達(dá)量減少,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。

    A:對(duì)照組;B:高糖組;C:高糖+低劑量藥物組;D:高糖+中劑量藥物組;E:高糖+高劑量藥物組。圖1 咪達(dá)唑侖對(duì)高糖誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷中凋亡及Caspase3蛋白表達(dá)的影響

    表1 咪達(dá)唑侖對(duì)高糖誘導(dǎo)心肌細(xì)胞的活性、凋亡及Caspase3蛋白表達(dá)的影響

    2.2 咪達(dá)唑侖對(duì)高糖誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷中SOD、MDA水平變化的影響 與對(duì)照組相比,高糖組心肌細(xì)胞H9C2的SOD活性降低,MDA含量升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。高糖組與高糖+低劑量藥物組的細(xì)胞相比,SOD活性和MDA含量的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與高糖組或高糖+低劑量藥物組相比,高糖+中、高劑量藥物組心肌細(xì)胞H9C2的SOD活性逐漸增強(qiáng),MDA含量減弱,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。與高糖+中劑量藥物組相比,高糖+高劑量藥物組的心肌細(xì)胞SOD活性升高,MDA含量減少,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05,見表2)。

    表2 咪達(dá)唑侖對(duì)高糖誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷中SOD、MDA水平變化的影響

    2.3 咪達(dá)唑侖對(duì)高糖誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷中PI3K/AKT的影響 與對(duì)照組相比,高糖組心肌細(xì)胞H9C2的p-PI3K和p-AKT蛋白表達(dá)量降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。高糖+低劑量藥物組內(nèi)p-PI3K和p-AKT蛋白表達(dá)相比于高糖組,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與高糖組或高糖+低劑量藥物組相比,高糖+中、高劑量藥物組心肌細(xì)胞H9C2的p-PI3K和p-AKT蛋白表達(dá)水平升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與高糖+中劑量藥物組相比,高糖+高劑量藥物組心肌細(xì)胞中p-PI3K和p-AKT蛋白表達(dá)量增強(qiáng),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而5組細(xì)胞之間的PI3K和AKT蛋白表達(dá)水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05,見圖2和表3)。

    A:對(duì)照組;B:高糖組;C:高糖+低劑量藥物組;D:高糖+中劑量藥物組;E:高糖+高劑量藥物組。圖2 p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT蛋白的表達(dá)

    表3 咪達(dá)唑侖對(duì)高糖誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷中PI3K/AKT的影響

    2.4 LY294002減弱咪達(dá)唑侖對(duì)高糖誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡及細(xì)胞活性的影響 CCK-8、流式細(xì)胞術(shù)和Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示(見圖3~5),與高糖組相比,高糖+LY294002組心肌細(xì)胞H9C2的OD值降低、細(xì)胞凋亡率增加、Caspase3蛋白表達(dá)水平升高,p-PI3K、p-AKT蛋白表達(dá)水平降低;但高糖+高劑量藥物組提高心肌細(xì)胞的OD值,降低細(xì)胞凋亡率,并減少Caspase3蛋白表達(dá)量,增加p-PI3K、p-AKT蛋白表達(dá)量,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。心肌細(xì)胞H9C2使用20 ng/mL劑量的咪達(dá)唑侖和PI3K/AKT特異性抑制劑LY294002處理后,與高糖+高劑量藥物組相比,高糖+高劑量藥物+LY294002組細(xì)胞的OD值減少、細(xì)胞凋亡率增強(qiáng)、Caspase3蛋白表達(dá)量升高,p-PI3K、p-AKT蛋白表達(dá)水平降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。4組細(xì)胞PI3K、AKT蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    A:高糖組;B:高糖+LY294002;C:高糖+高劑量藥物組;D:高糖+高劑量藥物組+LY294002。圖3 LY294002對(duì)咪達(dá)唑侖作用的高糖誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷凋亡及相應(yīng)蛋白表達(dá)的影響

    表4 LY294002減弱咪達(dá)唑侖對(duì)高糖誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷凋亡及細(xì)胞活性的影響

    表5 PI3K/AKT信號(hào)通路蛋白的表達(dá)

    2.5 LY294002減弱咪達(dá)唑侖對(duì)高糖誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷中SOD、MDA的影響 與高糖組相比,高糖+LY294002組心肌細(xì)胞H9C2的SOD活性降低,MDA含量升高;而高糖+高劑量藥物組心肌細(xì)胞的SOD活性增強(qiáng),MDA含量減弱,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。心肌細(xì)胞H9C2使用20 ng/mL劑量的咪達(dá)唑侖和PI3K/AKT特異性抑制劑LY294002處理后,相比于高糖+高劑量藥物組,高糖+高劑量藥物組+LY294002組降低細(xì)胞的SOD活性,提高M(jìn)DA含量,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05,見表6)。

    表6 高糖誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷中SOD、MDA含量的測(cè)定

    3 討論

    本項(xiàng)研究中,使用體外模型評(píng)估了咪達(dá)唑侖對(duì)心肌細(xì)胞高糖損傷的保護(hù)作用,即將心肌細(xì)胞H9C2暴露于高糖,誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷模型,結(jié)果證明了咪達(dá)唑侖對(duì)高糖損傷的心肌細(xì)胞保護(hù)能力,主要表現(xiàn)為細(xì)胞活性的顯著提高,細(xì)胞凋亡的降低,SOD活性的增強(qiáng)和MDA含量的抑制。在對(duì)機(jī)制的初步探索中,發(fā)現(xiàn)咪達(dá)唑侖可能通過激活PI3K/AKT信號(hào)通路對(duì)暴露于高糖的H9C2細(xì)胞產(chǎn)生保護(hù)作用。

    長(zhǎng)期高血糖和高血糖引起的氧化應(yīng)激是糖尿病性心肌病發(fā)展的主要原因[12]。此外,心臟氧化應(yīng)激與細(xì)胞死亡和心肌纖維化有關(guān),將導(dǎo)致潛在的致命性心臟事件。MDA是細(xì)胞脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物,SOD是抗氧化防御系統(tǒng)中重要的抗氧化酶,二者可以反映細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷程度。既往研究發(fā)現(xiàn),細(xì)胞凋亡在糖尿病性心肌病的進(jìn)展中起重要作用[13]。Caspase-3是一種重要的凋亡執(zhí)行蛋白酶,已成為細(xì)胞凋亡研究的重點(diǎn)[14]。本研究中,高糖會(huì)導(dǎo)致心肌細(xì)胞H9C2活性抑制、凋亡增加和氧化損傷,表明高糖誘導(dǎo)心肌細(xì)胞H9C2損傷,且這種損傷可能與氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡緊密相關(guān)。

    苯二氮卓衍生物咪達(dá)唑侖是用于鎮(zhèn)靜的最廣泛使用的麻醉劑,Lee等[15]已證明咪達(dá)唑侖對(duì)糖尿病小鼠視網(wǎng)膜中高血糖引起的血管滲漏具有預(yù)防作用,可以防止活性氧(ROS)生成。然而其在糖尿病心肌病中的作用尚未明了。本項(xiàng)研究中發(fā)現(xiàn),10、20 ng/mL劑量的咪達(dá)唑侖干預(yù)后,高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞H9C2的活性升高,細(xì)胞凋亡和Caspase3蛋白表達(dá)降低,抗氧化酶SOD活性增強(qiáng)且脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA的含量減少,這些結(jié)果表明咪達(dá)唑侖具有改善心肌細(xì)胞損傷的功能,它可能通過促進(jìn)細(xì)胞活性,減輕氧化應(yīng)激,抑制細(xì)胞凋亡來保護(hù)高糖培養(yǎng)的心肌細(xì)胞H9C2損傷。并且,20 ng/mL與10 ng/mL劑量的咪達(dá)唑侖的作用結(jié)果差異顯著,因此后續(xù)選擇20 ng/mL劑量進(jìn)一步研究。

    PI3K/AKT信號(hào)傳導(dǎo)途徑是調(diào)節(jié)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄、代謝、存活和炎癥的關(guān)鍵。PI3K是血糖調(diào)節(jié)的關(guān)鍵協(xié)調(diào)器,提示其可能參與糖尿病的發(fā)生發(fā)展[16]。PI3K產(chǎn)生脂質(zhì)第二信使磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸酯(Phosphatidylinositol-3,4,5-trisphophate,PIP3),從而導(dǎo)致AKT磷酸化。AKT在調(diào)節(jié)細(xì)胞存活與凋亡之間的平衡方面具有重要意義。疏水基序和激活環(huán)上的AKT磷酸化可激活激酶并促進(jìn)細(xì)胞存活[17]。高糖可以抑制PI3K/AKT途徑,而激活PI3K/AKT信號(hào)通路有利于防止高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡[18]。有研究表明,咪達(dá)唑侖可以濃度依賴性的誘導(dǎo)B35細(xì)胞中AKT的磷酸化,并降低葡萄糖氧化酶(GOX)誘導(dǎo)的B35神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞凋亡,保護(hù)細(xì)胞免受誘導(dǎo)的ROS損傷[19]。為了確定咪達(dá)唑侖如何調(diào)節(jié)PI3K/AKT通路并進(jìn)一步調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞損傷,采用Western blot檢測(cè)PI3K/AKT通路蛋白水平,發(fā)現(xiàn)高糖刺激后PI3K/AKT途徑的磷酸化水平降低,這與以前的研究一致[20]。值得注意的是,當(dāng)用高糖刺激心肌細(xì)胞H9C2時(shí),10、20 ng/mL劑量的咪達(dá)唑侖干預(yù)后,心肌細(xì)胞H9C2中p-PI3K和p-AKT蛋白表達(dá)水平顯著升高,而PI3K和AKT蛋白表達(dá)水平無明顯變化,表明咪達(dá)唑侖可以提高PI3K/AKT信號(hào)通路活性。證明咪達(dá)唑侖在糖尿病性心肌病中發(fā)揮作用的潛在機(jī)理與PI3K/AKT信號(hào)傳導(dǎo)途徑有關(guān)。當(dāng)在心肌細(xì)胞H9C2使用PI3K/AKT信號(hào)通路特異性抑制劑LY294002時(shí),與高糖組相比,LY294002處理顯著減少高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞H9C2的細(xì)胞活性、SOD活性,明顯增加細(xì)胞凋亡率、Caspase3蛋白表達(dá)量、MDA含量。并且,咪達(dá)唑侖對(duì)高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞活性的促進(jìn)作用,以及對(duì)細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激的抑制作用被LY294002所減弱。綜合這些結(jié)果,說明咪達(dá)唑侖通過激活PI3K/AKT信號(hào)通路來保護(hù)心肌細(xì)胞免受高糖損傷。

    綜上所述,10、20 ng/mL劑量的咪達(dá)唑侖可以提高高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞H9C2的細(xì)胞活性,減輕氧化應(yīng)激和抑制細(xì)胞凋亡,其保護(hù)心肌細(xì)胞免受高糖損傷的機(jī)制與激活PI3K/AKT信號(hào)通路有關(guān)。

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