白藜蘆醇激活結(jié)腸上皮細(xì)胞存活途徑及結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡信號(hào)通路

鄧 莉，田 靜

(恩施土家族苗族自治州中心醫(yī)院 脾胃科，湖北 恩施 445000)

結(jié)腸癌(Colon cancer)發(fā)病率位居第3位，也是導(dǎo)致癌癥死亡的主要原因之一。流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，蔬菜、水果和豆類的攝入量與腫瘤發(fā)病率和死亡率呈負(fù)相關(guān)；如多吃葡萄、花生和漿果會(huì)大大降低癌癥發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)，包括結(jié)腸癌和前列腺癌[1]。白藜蘆醇(Resveratrol，RES)是一種植物抗毒素，存在于多種植物中，對(duì)腫瘤細(xì)胞具有較好的化療作用[2]。目前雖已有一些關(guān)于RES對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞影響的研究，包括RES對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞有明顯的抑制作用[3]，RES通過調(diào)節(jié)線粒體/內(nèi)源性和受體/外源性凋亡途徑以及非依賴性caspase途徑的多個(gè)靶點(diǎn)介導(dǎo)凋亡[4]等，但對(duì)正常細(xì)胞影響的研究很少，故有必要了解RES在抗癌細(xì)胞的同時(shí)對(duì)病灶周圍正常細(xì)胞的毒性作用。

絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinases，MAPKs)屬于絲氨酸/蘇氨酸激酶的超家族，可將各種胞外信號(hào)傳遞至細(xì)胞核而發(fā)揮重要作用[5]。眾所周知，MAPKs構(gòu)成一個(gè)大的分子信號(hào)網(wǎng)絡(luò)，調(diào)節(jié)各種生理過程，如細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡[6-7]。最近的數(shù)據(jù)表明，骨髓細(xì)胞瘤病毒癌基因(c-Myc)也是調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期機(jī)制的核心和關(guān)鍵[8-9]。鑒于MAPKs和c-Myc表達(dá)在細(xì)胞應(yīng)對(duì)外界刺激中的關(guān)鍵作用，本文考察了RES對(duì)結(jié)腸上皮NCM460細(xì)胞和結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞生長(zhǎng)、凋亡、MAPK信號(hào)通路及c-Myc蛋白表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 白藜蘆醇購(gòu)自Sigma公司，批號(hào)：501-36-0；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)購(gòu)自英國(guó)Gibco公司；Erk1/2(批號(hào)ab2098361)、p-Erk1/2(批號(hào)ab1109632)、P38 MAPK(批號(hào)ab1090263)、p-P38 MAPK(批號(hào)ab1238790)、JNK1/2(批號(hào)ab1097864)、p-JNK1/2(批號(hào)ab1437890)和c-Myc(批號(hào)ab1243784)抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；羊抗兔二抗購(gòu)自上海谷歌生物有限公司；ECL顯影液購(gòu)自北京百奧萊博科技有限公司(批號(hào)GL1055)；Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自杭州碧云天生物公司(批號(hào)C1062S)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及藥物處理 人結(jié)腸上皮NCM460細(xì)胞系和結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞系來源于武漢杰諾公司，采用DMEM完全培養(yǎng)液(含10%FBS、1%的100 U/mL青霉素和100 g/mL鏈霉素)孵育細(xì)胞，培養(yǎng)溫度37 ℃、CO2濃度為5%。將對(duì)數(shù)期細(xì)胞(1×106個(gè)/孔)接種于6孔板孵育24 h，然后采用RES(0、10、20、40 μM)處理細(xì)胞72 h，培養(yǎng)條件為溫度37 ℃、CO2濃度為5%的培養(yǎng)箱。

1.3 細(xì)胞形態(tài)和克隆分析 細(xì)胞經(jīng)“1.2”項(xiàng)藥物處理后，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，并拍照。并隨機(jī)選擇10個(gè)視野，計(jì)數(shù)細(xì)胞，計(jì)算平均作為細(xì)胞的克隆數(shù)。

1.4 細(xì)胞周期分布和凋亡率檢測(cè) 細(xì)胞經(jīng)“1.2”項(xiàng)藥物處理后，收集各組細(xì)胞，PBS清洗2次，收集細(xì)胞，采用2.0 mg/mL的PI染液和RNase I染色30 min，流式細(xì)胞儀立即檢測(cè)細(xì)胞周期分布情況。另外，收集細(xì)胞，PBS重懸后，分別加入Annexin-V FITC和PI處理細(xì)胞(按照試劑盒操作說明書進(jìn)行)，最后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.5 蛋白相對(duì)表達(dá)水平分析 細(xì)胞經(jīng)“1.2”項(xiàng)處理后，PBS清洗細(xì)胞3次，收集各組細(xì)胞裂解、超聲破碎、12 000 r/min離心12 min后收集上清，BCA試劑盒測(cè)定上清蛋白濃度。每個(gè)樣本上樣50 μg進(jìn)行凝膠電泳，待蛋白完全分離后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜實(shí)驗(yàn)。結(jié)束后加入5%脫脂奶粉封閉液于搖床上室溫封閉1h后，分別加入Erk1/2、p-Erk1/2、P38 MAPK、p-P38 MAPK、JNK1/2、p-JNK1/2和c-Myc抗體(體積稀釋比例均為1∶1 000)4 ℃反應(yīng)過夜。次日TBST洗膜3次后加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG(體積稀釋比例為1:3 000)，室溫反應(yīng)1 h。再用TBST洗膜3次，每次10 min，以ECL試劑顯影后進(jìn)行蛋白條帶灰度值分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 20.0軟件統(tǒng)計(jì)，兩兩組間比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RES對(duì)NCM460和HCT116細(xì)胞形態(tài)和生長(zhǎng)的影響 NCM460和HCT116細(xì)胞經(jīng)RES處理后，兩種細(xì)胞均逐漸從培養(yǎng)皿底部收縮和分離，并且NCM460細(xì)胞形態(tài)明顯優(yōu)于HCT116細(xì)胞(見圖1A)。從細(xì)胞克隆數(shù)比較可見，RES處理可明顯減少NCM460和HCT116細(xì)胞克隆數(shù)，而HCT116細(xì)胞克隆數(shù)降低得更為顯著(P<0.05，見圖1B)。

與0 μM的RES組比較，*：P<0.05；A：細(xì)胞克隆圖；B：細(xì)胞克隆計(jì)數(shù)。圖1 RES對(duì)NCM460和HCT116細(xì)胞形態(tài)和生長(zhǎng)的影響

2.2 RES對(duì)NCM460和HCT116細(xì)胞周期分布的影響 經(jīng)20、40 μM的RES處理72 h后，G1期分布的NCM460細(xì)胞相對(duì)于0 μM的RES組明顯降低，而G2期細(xì)胞分布則明顯增多(P<0.05)。經(jīng)10、20、40 μM的RES處理72 h后，G1期分布的HCT116細(xì)胞相對(duì)于0 μM的RES組明顯降低，而G2期細(xì)胞分布則明顯增多(P<0.05)。進(jìn)一步比較發(fā)現(xiàn)，40 μM的RES處理后相比于0 μM的RES組NCM460細(xì)胞G1期細(xì)胞數(shù)降低11%、而G2期細(xì)胞數(shù)增多了0.91倍；20、40 μM的RES處理后相比于0 μM的RES組，HCT116細(xì)胞G1期細(xì)胞數(shù)分別降低20%和33%，而G2期細(xì)胞數(shù)分別增高了0.43倍和0.91倍。

與0 μM的RES組比較，*：P<0.05。圖2 RES對(duì)NCM460和HCT116細(xì)胞周期分布的影響

2.3 RES對(duì)NCM460和HCT116細(xì)胞凋亡的影響 經(jīng)10、20、40 μM的RES處理72 h后，HCT116細(xì)胞凋亡率相對(duì)于0 μM的RES組分別增高了3.1倍、7.9倍和13.1倍(P<0.05)。10、20 μM的RES處理72 h后，NCM460細(xì)胞凋亡率相對(duì)于0 μM的RES組沒有發(fā)生明顯變化(P>0.05)，而40 μM的RES處理72 h后，NCM460細(xì)胞凋亡率增高了2.9倍(P<0.05)，見圖3。

與0 μM的RES組比較，*：P<0.05。圖3 RES對(duì)NCM460和HCT116細(xì)胞凋亡的影響

2.4 RES對(duì)NCM460和HCT116細(xì)胞中MAPK信號(hào)通路和c-Myc蛋白表達(dá)的影響 為了考察NCM460和HCT116細(xì)胞中增殖相關(guān)信號(hào)通路的作用，實(shí)驗(yàn)分析了10、20、40 μM的RES處理細(xì)胞72 h后MAPK的磷酸化狀態(tài)和c-Myc表達(dá)。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，RES處理后NCM460和HCT116細(xì)胞中Erk1/2、p-P38 MAPK、P38 MAPK和JNK1/2并沒有發(fā)生明顯變化(P>0.05)。另外，NCM460細(xì)胞中p-Erk1/2蛋白表達(dá)水平隨著RES濃度升高而增多(P<0.05)，而在HCT116細(xì)胞中沒有發(fā)生明顯變化(P>0.05)。在HCT116細(xì)胞中，p-JNK1/2表達(dá)水平隨RES濃度升高而增高，c-Myc表達(dá)水平則降低(P<0.05)；而p-JNK1/2和c-Myc蛋白表達(dá)水平在HCT116細(xì)胞中沒有發(fā)生明顯變化(P>0.05，見表1、圖4)。

圖4 RES對(duì)NCM460和HCT116細(xì)胞中MAPK信號(hào)通路和c-Myc蛋白表達(dá)的影響

表1 各組間MAPK信號(hào)通路和c-Myc 表達(dá)水平的比較

3 討論

最近研究綜述RES可以抑制腫瘤細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期阻滯，降低癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的化療/放療敏感性，除此對(duì)糖尿病也有改善作用?；谶@些數(shù)據(jù)，RES被認(rèn)為是治療腫瘤的一種潛在的抗癌劑[10]。已有較多報(bào)道指出，RES抑制腫瘤生長(zhǎng)，也揭示其化療保護(hù)的分子機(jī)制[11]。然而，本研究首次比較RES對(duì)肺致癌性結(jié)腸上皮細(xì)胞和致癌性結(jié)腸癌細(xì)胞的影響。成年哺乳動(dòng)物中，腸道和結(jié)腸上皮細(xì)胞是最容易自我更新的組織(3～5 d)。本研究發(fā)現(xiàn)，10～40 μM的RES處理細(xì)胞72 h可減少致瘤性HCT116結(jié)腸癌細(xì)胞G1期分布，并且對(duì)HCT116細(xì)胞增殖的抑制作用明顯優(yōu)于非致瘤性NCM460結(jié)腸上皮細(xì)胞。同樣，10～40 μM的RES對(duì)HCT116細(xì)胞有明顯的凋亡誘導(dǎo)作用，但對(duì)NCM460細(xì)胞無明顯作用。有趣的是發(fā)現(xiàn)RES抑制結(jié)腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)，而對(duì)非致瘤性結(jié)腸細(xì)胞影響較小。這一觀察結(jié)果與抗癌藥物通常能有效抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)而不是正常細(xì)胞生長(zhǎng)的事實(shí)是一致的。

因?yàn)镸APK信號(hào)通路在細(xì)胞增殖、分化和存活中起著關(guān)鍵作用[12]，本實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，RES對(duì)NCM460和HCT116細(xì)胞中MAPK信號(hào)活性的影響也有差異。JNK1/2、P38 MAPK和Erk1/2是最重要的MAPK信號(hào)通路[13]。通常認(rèn)為生長(zhǎng)因子激活的Erk1/2是細(xì)胞存活的前期，而P38 MAPK和JNK1/2信號(hào)是細(xì)胞應(yīng)激反映的結(jié)果，被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡的介質(zhì)[14]。本研究結(jié)果證實(shí)，RES處理可上調(diào)NCM460細(xì)胞中Erk1/2的磷酸化，而對(duì)HCT116細(xì)胞中沒有影響。另外，雖然P38 MAPK信號(hào)的磷酸化沒有發(fā)生變化，但是RES會(huì)增加HCT116細(xì)胞中JNK1/2磷酸化。

為了進(jìn)一步理解上述分子機(jī)制，實(shí)驗(yàn)檢測(cè)c-Myc蛋白表達(dá)，結(jié)果提示RES抑制HCT116細(xì)胞中c-Myc蛋白表達(dá)，對(duì)NCM460細(xì)胞沒有影響。由于c-Myc參與細(xì)胞增殖和凋亡過程，在腫瘤的形成和發(fā)展中起著關(guān)鍵作用[15-16]，而且已有研究表明，Erk1/2通路對(duì)細(xì)胞分裂通過G1期是必不可少的，而Erk1/2和c-Myc激活對(duì)于驅(qū)動(dòng)細(xì)胞從G0期到G2期也是必須的[17]。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，RES處理也明顯誘導(dǎo)HCT116細(xì)胞凋亡和G1期細(xì)胞分布減少，但對(duì)NCM460細(xì)胞相關(guān)的作用效應(yīng)明顯較弱。因此，非致瘤性結(jié)腸上皮細(xì)胞和致瘤性結(jié)腸癌細(xì)胞對(duì)RES的敏感性存在差異，至少部分解釋了RES抗癌作用的分子基礎(chǔ)。