rhCC10對大鼠煙霧吸入性肺損傷的作用研究

狄海波，李軍毅，侯世科

(1.武警特色醫(yī)學中心燒傷凍傷及組織功能重建研究所，天津 300162； 2.棗礦集團中心醫(yī)院，山東 棗莊 277100)

煙霧吸入損傷(SII)死亡率約 30%，其特征是煙霧中的有害因素(包括熱量、微顆粒、毒性物質(zhì)及氣道刺激物)介導的氣道或全身炎癥反應(yīng)，通常會導致急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)，這也是燒傷患者高死亡率的主要危險因素[1-3]。在SII發(fā)病過程中，氣道炎癥導致中性粒細胞和單核細胞向肺內(nèi)遷移，然后釋放細胞毒性酶、活性氧和其他氧化物[4-5]。這些有毒物質(zhì)的積累是氣道上皮和肺內(nèi)皮細胞損傷的重要因素。因此，受損肺泡的氣體交換受損，導致低氧血癥和高碳酸血癥[4-6]。Club細胞蛋白10-kDa(CC10)是Club細胞分泌的主要蛋白質(zhì)。這些CC10表達細胞已被證明在保持氣道上皮的完整性和促進上皮修復方面起著關(guān)鍵作用[7]。CC10是一種具有多種作用機制的強效抗炎蛋白，包括抑制磷脂酶A2(PLA2)[8-9]、抑制中性粒細胞[10-11]、抑制NF-kB信號[12]。在幾種急性肺損傷動物模型中， rhCC10的治療均觀察到了肺炎性介質(zhì)的減少，肺結(jié)構(gòu)和功能的保護，肺機械功能、氣體交換和肺血管屏障的改善[12-15]。本研究旨在探討rhCC10對煙霧吸入損傷大鼠的治療作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及主要實驗裝置 SPF級健康雄性SD 大鼠156只，8～12 周齡，體重200±20 g，購自北京維通利華。大鼠飼養(yǎng)在溫度20～25 ℃、相對濕度50%～70% 的環(huán)境中。自行研制的產(chǎn)煙-實驗一體的密閉裝置，由亞克力板材組成，包括由管道聯(lián)通的煙霧生成單元和動物實驗單元。煙霧生成單元內(nèi)含1 個溫控電熱爐、1個鼓風機。動物實驗單元包含2個排風扇、1 個水循環(huán)冷卻系統(tǒng)，可控制箱內(nèi)溫度于20～25 ℃ ，以及1 個溫度檢測器和1 個煙霧成分檢測器。

1.2 動物模型制備 基于朱峰等[16]的描述建立煙霧吸入性肺損傷模型。將100 g混合材料粉末(包括發(fā)泡橡塑絕熱制品、阻燃白膠、阻尼材料、無鹵電纜、硅丙乳膠漆每種材料的20 g)放入電熱爐的金屬板上，然后加熱這些材料產(chǎn)生煙霧。使用鼓風機將煙霧送入動物實驗單元。動物實驗單元控制溫度24～27 ℃以排除煙氣的熱損傷。使用煙霧成分檢測器和鼓風機保持室內(nèi)穩(wěn)定的煙霧環(huán)境，氧氣保持18%～20%，一氧化碳體積分數(shù)450～500 ppm，硫化氫體積分數(shù)5～10 ppm。當氣體濃度低于上述范圍時，鼓風機將煙送入動物實驗單元。將清醒的大鼠置于動物實驗單元中吸入煙霧30 min完成造模。

1.3 藥物處理及分組 156只成年雄性SD 大鼠按隨機數(shù)字表法分為對照組(sham組，n=6)、煙霧模型組(SII組，煙霧吸入30 min，n=50)以及煙霧+ rhCC10 干預(yù)組[SII+rhC2組(煙霧+2 mg/kg的rhCC10)]2 mg/kg、SII+ rhC10組[(煙霧+ 10 mg/kg的rhCC10)10 mg/kg，n=50]，SII+ rhC2、SII+ rhC10組在煙霧吸入前1 h分別給予2 mg/kg、10 mg/kg rhCC10腹腔注射[17]，此后每隔12 h重復注射1次，連續(xù)3 d，對照組腹腔注射等量晶體液。統(tǒng)計并計算大鼠1、3、6、12、18、24 h存活率，實驗24 h隨機選取6只大鼠腹主動脈血氣分析后安樂死，收集支氣管肺泡灌洗液(BALF)和肺組織，用于進一步檢測，實驗28 d剩余大鼠安樂死，取肺組織用于病理學檢測。

1.4 支氣管肺泡灌洗 支氣管肺泡灌洗術(shù)(BAL)采用20號氣管造瘺術(shù)，使用血管導管向左肺灌注含0.5 mM EDTA的冷PBS (1 mL aliquots)，輕輕取出液體，收集約2.75 mL的總?cè)萘?共注射3次)。液體立即被放在冰上。在第一次注射中大約有70%的液體和在隨后的注射中有90%的液體被回收。一部分用于蛋白定量檢測，一部分用于細胞學檢測。

1.5 血漿及BALF檢測 實驗24 h從各組大鼠腹主動脈抽取動脈血2.5 mL，采用Premier3000動物血氣分析儀分析氧分壓，通過XFA6030型動物血液細胞分析儀分析BALF中白細胞數(shù)、中性粒細胞比例及巨噬細胞比例，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測血清及BALF 中白細胞介素-6(IL-6)(abcam公司，ab9324，美國)、核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear transcription factor-κB,NF-κB)(abcam公司，ab106129，美國)水平。BALF離心后取上清，BCA蛋白定量法檢測其蛋白濃度。

1.6 肺組織濕干重比 取右肺下葉，生理鹽水洗凈，擦干，置于一片鋁箔上，立即稱重(濕重)。將肺在60 ℃的烘箱中干燥，48 h后稱重(干重)。濕干比(W/D)是一種常用的水腫形成的檢測方法。

1.7 Western blot檢測 取各組大鼠肺組織，采用RIPA裂解液裂解(碧云天，GMA001981，中國)，充分勻漿，于4 ℃離心15 min，取上清，BCA法定量總蛋白，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，半干轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜。進一步檢測髓過氧化物酶(Myeloperoxidase,MPO)(abcam公司，ab134132，美國)、高遷移率族蛋白B1(Highmobilitygroupboxl,HMGB1)(abcam公司，ab77302，美國)蛋白質(zhì)濃度。用含有0.1%牛血清白蛋白的PBS在室溫下將膜封閉1 h， PBST洗滌后抗體溫育過夜：兔抗鼠MPO一抗(1∶1 000)，兔抗鼠HMGB1一抗(1∶1 000)和β-actin一抗(1∶1 000)。將膜用PBST清洗4次后與山羊抗兔二抗(1∶1 000)在室溫下孵育2 h。PBST清洗后采用ECL試劑盒檢測條帶的化學發(fā)光，使用ImageJ軟件分析圖像。

1.8 病理學檢查 4%多聚甲醛固定肺組織48 h，石蠟包埋、切片(片厚4 μm)，脫蠟后進行蘇木素- 伊紅(HE)染色。采用單盲法由2名病理科醫(yī)生分別于光鏡下進行組織學觀察，每張切片至少選取20 個隨機高倍視野，根據(jù)肺泡內(nèi)中性粒細胞計數(shù)、肺泡間隔內(nèi)中性粒細胞計數(shù)、透明膜形成與否、肺泡腔內(nèi)是否殘存蛋白質(zhì)、肺泡間隔厚度、肺纖維條索等進行評估。

2 結(jié)果

2.1 rhCC10對大鼠24 h存活的影響 SII組大鼠24 h 存活率顯著低于sham組(36% 比100%，P<0.05)。SII+rhC2、SII+rhC10組大鼠24 h 存活率分別提升至62%、74%，均顯著高于SII 組(P均<0.05)；其中SII+rhC10組存活率顯著高于SII+rhC2組(P均<0.05，見圖1)。

圖1 各組大鼠24 h Kaplan-Meier生存曲線

2.2 rhCC10改善氧合指數(shù) 與sham組相比，SII組氧合指數(shù)明顯下降 [(283.33±32.26)vs(457.94±14.57)]，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；SII+rhC2組高于SII組[(357.14±19.05)vs(283.33±32.26)]，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；SII+rhC10組明顯高于SII組[(377.78±25.32)vs(283.33±32.26)]，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；而SII+rhC2組與SII+rhC10組間氧合指數(shù)未見明顯差異(P>0.05，見圖2)。

*：與sham組比較，P<0.05；#：與SII組相比P<0.05。圖2 各組大鼠24 h氧合指數(shù)

2.3 rhCC10 減輕SII炎癥水平 SII后血漿及BALF中IL- 6、NF-κB水平均顯著高于sham組，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；而rhCC10治療組IL- 6、NF-κB水平較SII組均顯著降低，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；在BALF的細胞學檢查發(fā)現(xiàn)SII組白細胞計數(shù)、中性粒細胞比例高于sham組，而巨噬細胞比例低于sham組，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，rhCC10治療組白細胞計數(shù)、中性粒細胞比例均顯著降低，而巨噬細胞比例明顯增高，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；而SII+rhC10組白細胞計數(shù)低于SII+rhC2組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 rhCC10對煙霧吸入性急性肺損傷大鼠BALF及血漿中炎性因子的影響

SII后肺組織MPO、HMGB1 表達較sham 組顯著升高，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；rhCC10治療組MPO、HMGB1 表達水平較SII組均顯著降低，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而SII+rhC10組HMGB1低于SII+rhC2組，其差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見圖3)。

*：與sham組比較，P<0.05；#：與SII組相比，P<0.05；@：與SII+rhC2組相比，P<0.05。圖3 各組大鼠肺組織蛋白免疫印跡

2.4 rhCC10 減輕肺組織水腫及蛋白外滲 與sham組相比， SII組 W/D明顯增高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與SII組比較，SII+rhC2組和SII+rhC10組W/D均顯著降低，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見表2)。BALF 中蛋白水平檢測結(jié)果表明，SII組蛋白水平均顯著高于sham組，其差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與SII組比較，SII+rhC2組和SII+rhC10組蛋白水平均顯著降低，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，且SII+rhC10組低于SII+rhC2組，其差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見表2)。

表2 rhCC10對肺組織水腫及蛋白外滲的影響

2.5 rhCC10減輕肺組織水腫，減輕肺組織纖維化 實驗24 h：sham組大鼠各級支氣管、肺泡管、肺泡囊、肺泡及肺泡隔組織結(jié)構(gòu)完整清晰，無充血、水腫，肺泡腔內(nèi)無明顯滲出(見圖4A)；SII組肺間質(zhì)大量炎性細胞的浸潤，肺泡腔及肺間質(zhì)內(nèi)有中性粒細胞和單核巨噬細胞浸潤，肺組織毛細血管充血，肺泡隔水腫、增厚，肺泡間隔增寬變形，肺組織結(jié)構(gòu)破壞(見圖4B)；rhCC10干預(yù)組肺組織炎性反應(yīng)介于sham組與SII組之間，較SII組有所減輕(見圖 4C和D)。與sham組相比，SII組肺泡腔面積比縮小，而 rhCC10干預(yù)組肺泡腔所占面積介于兩者之間，但大于SII組，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見表3)。實驗28 d：SII組在支氣管周圍有大片實變區(qū)，肺泡壁異常增厚，肺泡結(jié)構(gòu)紊亂，腔內(nèi)無明顯滲出物，肺實質(zhì)炎癥吸收，成纖維細胞增生，肺組織纖維化，斑片狀分布，肺泡融合，肺泡腔縮小，肺實質(zhì)結(jié)構(gòu)紊亂，此階段呈中度至重度肺纖維化改變(見圖4F)。rhCC10干預(yù)組肺纖維化程度介于sham組與SII組之間，表現(xiàn)輕、中度肺纖維化改變，在支氣管周圍有局部纖維化，病變范圍局限，肺泡間隔增厚，肺泡隔纖維增生灶較少，較SII組有減輕，肺泡結(jié)構(gòu)完整性基本恢復(圖 4G、H)。與sham組相比，SII組肺泡腔面積比明顯縮小， rhCC10干預(yù)組肺泡腔所明顯大于SII組，但仍小于sham組，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，其中SII+rhC10組肺空泡腔面積比大于SII+ rhC2組，其差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見表3)。

A～D：實驗24 h肺組織HE染色；E～H:實驗28 d肺組織HE染色；其中A和E：sham組，B和F：SII組，C和G：SII+ rhC2組，D和H：SII+ rhC10組；圖片放大倍數(shù)為200倍。圖4 各組大鼠肺組織HE染色

表3 各組大鼠肺組織空泡腔面積比

3 討論

煙霧吸入損傷導致嚴重的肺損傷，通常致命，其特征是嚴重的肺炎癥、上皮去角質(zhì)、氣道阻塞、肺出血和肺水腫，以及長期預(yù)后的肺纖維化[1,18]。本研究的主要發(fā)現(xiàn)是，腹腔注射10 mg/kg rhCC10的治療可減少肺部炎癥，保護肺結(jié)構(gòu)，改善氣體交換和肺纖維化。與先前SII兔子模型中靜脈注射rhCC10保護的肺結(jié)構(gòu)，減少肺部炎癥，改善肺功能的研究發(fā)現(xiàn)一致[13]。作為磷脂酶a2抑制劑，rhCC10也可以防止肺表面活性劑的降解，從而保持肺功能[14,19]。作為氣道上皮細胞中NF-kB信號的抑制劑，rhCC10可以抑制急性肺損傷中的下游炎癥反應(yīng)[13]，在評估 rhCC10 的其他幾個急性肺損傷模型中觀察到的[13-15]。據(jù)報告，在患有呼吸窘迫的早產(chǎn)兒中，腹腔內(nèi)施用rhCC10可顯著減少肺部炎癥[20]。CC10，也稱為促分泌素1A1、CCSP、CC16、子宮珠蛋白和尿蛋白-1，是內(nèi)襯非纖毛呼吸道上皮細胞的主要分泌物，也包括Club細胞。Club細胞亞群包括氣道中的祖細胞，這些祖細胞在上皮損傷后重新填充。除了抗炎和抗纖維化特性[21-22]，CC10蛋白被認為在修復損傷后呼吸道上皮方面起著一定的作用[23]。研究表明，在萘損傷小鼠模型中，使用rhCC10可以促進肺上皮的修復，特別是增加Club細胞的數(shù)量[24]。

本研究中對SII大鼠肺組織病理學評估表明，rhCC10不僅抑制了肺部的破壞性炎癥，而且可能有助于修復損傷后氣道上皮，改善肺纖維化。雖然CC10的機制方面尚未完全了解，但rhCC10介導的肺生物力學整體改善可能是通過抑制炎癥反應(yīng)、加速上皮修復減少上皮脫落、減少粘液阻塞、抑制支氣管痙攣的結(jié)果。無論rhCC10是通過減少炎癥、加速上皮修復，還是兩者的結(jié)合，肺組織結(jié)構(gòu)和氣道完整性得以保存，這些都與改善肺氣體交換直接相關(guān)。氧合指數(shù)(PaO2/FiO2)是氣體交換的主要指標，通過rhCC10治療，本研究發(fā)現(xiàn)氧合指數(shù)以劑量依賴的方式得到改善。氧合指數(shù)的改善至關(guān)重要，因為它與SII患者的死亡率有關(guān)[25]。與先前的研究一致，rhCC10治療降低了SII肺組織中的嗜中性粒細胞MPO，以及肺組織中性粒細胞的數(shù)量[18]。而HMGB1作為一種促炎因子，可以通過與模式識別受體家族中的受體相結(jié)合促進炎癥的形成[26]。在沒有CC10干預(yù)的情況下，CC10基因敲除小鼠對各種呼吸道病原體和吸入性損傷表現(xiàn)出中性粒細胞大量增多[27-28]。因此，機體自然生成的CC10和rhCC10治療均可以抑制肺損傷中性粒細胞的聚集。本研究顯示，SII組肺組織中的HMGB1 和MPO 表達顯著升高，而rhCC10干預(yù)后可顯著降低HMGB1 和MPO 的蛋白表達，從而減輕肺部炎癥反應(yīng)。

多項研究還表明，與健康者相比CC10在呼吸衰竭患者的氣管吸氣或支氣管-肺泡液中含量較低，包括早產(chǎn)兒[29]、肺炎[30]和ARDS[10]。其它研究發(fā)現(xiàn)，在SII[31]期間，血漿或血清中的CC10增加。而循環(huán)CC10的減少與慢性肺病(如COPD和支氣管炎)的漸進氣道重塑、肺功能喪失和Club細胞損失有關(guān)[32-33]。在之前的研究中高劑量rhCC10的治療也減輕了SII引起的綿羊肺CC10mRNA的減少，這表明rhCC10保護的Club細胞在氣道上皮[34]。關(guān)于rhCC10的整體治療效果，本研究結(jié)果表明10mg/kg劑量效果最佳，2mg/kg的劑量也表現(xiàn)出一定程度的保護作用。此外還確定了rhCC10對磷脂蛋白a2的抑制，抑制呼吸道上皮NF-kB信號，減少肺中性粒細胞聚集的作用。

綜上所述，基于本研究發(fā)現(xiàn)和先前的研究結(jié)果，rhCC10治療可減少肺部炎癥，保護肺結(jié)構(gòu)和功能的完整性，改善氣體交換和減少肺纖維化，為臨床SII治療提供了可靠的依據(jù)。