宮頸癌患者外周血細(xì)胞中miRNA-216b 的表達(dá)水平及臨床意義

周艷齊，趙松蘭，沈亞杰，于紅風(fēng)

鎮(zhèn)江市第一人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，江蘇 鎮(zhèn)江2120000

宮頸癌是一種常見(jiàn)的婦科惡性腫瘤，容易蔓延或發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致患者預(yù)后不佳[1-2]。大量研究提示宮頸癌發(fā)病與病毒感染尤其是人乳頭瘤病毒（human papilloma virus，HPV）感染密切相關(guān)，但是其發(fā)病機(jī)制尚未完全明確。近年來(lái)隨著分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，研究發(fā)現(xiàn)宮頸癌的發(fā)生發(fā)展還涉及多基因的異常調(diào)控[3-6]。因此，尋找能夠早期診斷和判斷宮頸癌預(yù)后的分子標(biāo)志物，有助于深入挖掘?qū)m頸癌的發(fā)病機(jī)制，為宮頸癌的治療提供新靶點(diǎn)和新思路。微小RNA（microRNA，miRNA）是一類(lèi)長(zhǎng)度為18～22 個(gè)核苷酸的短鏈非編碼RNA，可以通過(guò)靶向識(shí)別信使RNA（messenger RNA，mRNA）的3'-非翻譯區(qū)（untranslated region，UTR），在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因的表達(dá)[7]。越來(lái)越多的研究表明，miRNA參與了多種復(fù)雜的生物學(xué)過(guò)程，包括腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展，并且不同腫瘤具有不同的miRNA表達(dá)譜[8-10]。然而，關(guān)于miRNA-216b在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中作用機(jī)制的臨床研究仍然較少。本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）檢測(cè)宮頸癌患者外周血細(xì)胞中miRNA-216b 的表達(dá)水平，旨在探討miRNA-216b 對(duì)宮頸癌診斷及預(yù)后判斷的作用，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選擇2011 年7 月至2018 年7 月于鎮(zhèn)江市第一人民醫(yī)院就診的55 例宮頸癌患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)病理檢查確診為宮頸癌；初次診斷且未經(jīng)過(guò)治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他惡性腫瘤；1 個(gè)月內(nèi)有輸血史。55 例宮頸癌患者的年齡為37～76 歲，平均年齡為（57.43±7.34）歲；體重指數(shù)（body mass index，BMI）為19.53～27.05 kg/m2，平 均BMI 為（21.48±4.22）kg/m2。另選取同期進(jìn)行體檢的健康者30 例作為對(duì)照，年齡為35～75 歲，平均年齡為（56.66±9.73）歲；BMI 為19.03～25.39 kg/m2，平 均BMI 為（20.95±4.08）kg/m2。宮頸癌患者和健康者的年齡、BMI 比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹥0.05），具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審批通過(guò)，所有患者及家屬均對(duì)本研究知情并簽署知情同意書(shū)。

1.2 外周血細(xì)胞RNA 提取及逆轉(zhuǎn)錄

收集宮頸癌患者和健康體檢者的外周血標(biāo)本，其中宮頸癌患者的血標(biāo)本采集于病理確診和治療前，1000 r/min 離心5 min 后去上清。將留取的外周血細(xì)胞通過(guò)Trizol 法提取總RNA，將RNA 置于冰上充分溶解45 min，采用Nanodrop 分光光度計(jì)檢測(cè)其濃度及純度，并將濃度全部標(biāo)準(zhǔn)化。采用miScript Reverse Transcription Kit（購(gòu)自德國(guó)Qiagen公司）將上述標(biāo)準(zhǔn)化的RNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。反應(yīng)體系配制完成后，按照說(shuō)明書(shū)要求將其置于普通聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀中反應(yīng)1 h。逆轉(zhuǎn)錄完成后，收集產(chǎn)物于4 ℃保存。將剩余的RNA 進(jìn)行分裝后置于-80 ℃保存。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)樣本中miRNA-216b的表達(dá)情況，檢測(cè)采用的試劑為miScript SYBR Green PCR Kit（購(gòu)自德國(guó)Qiagen 公司）。每次實(shí)驗(yàn)均設(shè)置陽(yáng)性和陰性對(duì)照。miRNA-216b 上游引物為5'-AAATCTCTGCAGGCAAATGTGA-3'，下游引物為miScript SYBR Green PCR Kit 中的通用引物；U6 上游引物為5'-GTGCTCCCTGCTTCGGCAGCACATATAC-3'，下游引物為5'-AAAAATATGGAACGCTTCACGAATTTG-3'。以U6 為 內(nèi) 參，采用2-△△Ct法計(jì)算miRNA-216b 的相對(duì)表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 18.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t 檢驗(yàn)；不符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以中位數(shù)（四分位數(shù)間距）[M（P25，P75）]表示，組間比較采用Mann-Whitney U 檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。采用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線和曲線下面積（area under the curve，AUC）分析miRNA-216b 對(duì)宮頸癌的診斷效能。采用Kaplan-Meier 法繪制生存曲線，組間比較采用Log-rank 檢驗(yàn)。以P﹤0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 宮頸癌患者和健康者外周血細(xì)胞中miRNA-216b的表達(dá)情況

宮頸癌患者外周血細(xì)胞中miRNA-216b 的相對(duì)表達(dá)量為0.011（0.005，0.026），明顯低于健康者的0.109（0.047，0.255），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（U=225.000，P﹤0.01）。ROC 曲線分析結(jié)果顯示，miRNA-216b 能夠鑒別診斷宮頸癌患者和健康者，其AUC 為0.865（95%CI：0.771～0.956，P﹤0.01），且其截?cái)嘀禐?.017 時(shí)，診斷靈敏度和特異度分別為63.6%和93.3%（圖1）。

2.2 不同miRNA-216b 表達(dá)情況宮頸癌患者臨床特征的比較

基于miRNA-216b 相對(duì)表達(dá)量的截?cái)嘀?.017，將宮頸癌患者分為miRNA-216b 低表達(dá)組（n=35）和miRNA-216b 高表達(dá)組（n=20）。miRNA-216b 低表達(dá)組和高表達(dá)組患者的年齡、HPV 感染情況、病理分期、腫瘤直徑比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹥0.05）；miRNA-216b 低表達(dá)組患者臨床分期為Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、術(shù)后復(fù)發(fā)的比例均高于miRNA-216b 高表達(dá)組患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹤0.05）。（表1）

表1 不同miRNA-216b 表達(dá)情況宮頸癌患者臨床特征的比較（n=55）

2.3 生存情況的比較

隨訪過(guò)程中，所有患者的總生存時(shí)間資料均收集完整，但7 例患者的無(wú)病生存時(shí)間信息無(wú)法獲取。miRNA-216b 高表達(dá)組患者的總生存情況優(yōu)于miRNA-216b 低表達(dá)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=5.704，P﹤0.05）；miRNA-216b 高表達(dá)組和低表達(dá)組患者的無(wú)病生存情況比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=2.759，P﹥0.05）。（圖2、圖3）

圖2 miRNA-216b低表達(dá)組（n=35）和高表達(dá)組（n=20）宮頸癌患者的總生存曲線

3 討論

圖3 miRNA-216b低表達(dá)組（n=29）和高表達(dá)組（n=19）宮頸癌患者的無(wú)病生存曲線

近年來(lái)，越來(lái)越多的研究證實(shí)miRNA-216b 參與了多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展，包括結(jié)腸癌、肝癌、胰腺癌等[11-14]。Yang 等[15]通過(guò)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，miRNA-338 和miRNA-216b 可能是宮頸上皮內(nèi)瘤變發(fā)生發(fā)展中的關(guān)鍵miRNA。He 等[16]研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-216b 可以通過(guò)抑制增殖相關(guān)蛋白（如cyclin D1、c-myc、p21、p-Rb以及LEF1）的表達(dá)，從而抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖。此研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-216b可以通過(guò)結(jié)合FOXM1 基因的3'-UTR 抑制其表達(dá)，從而發(fā)揮抗腫瘤作用。此外，宮頸癌組織標(biāo)本和細(xì)胞株中miRNA-216b 的表達(dá)水平均下調(diào)，且miRNA-216b 低表達(dá)往往提示宮頸癌患者預(yù)后不良。本研究結(jié)果顯示，宮頸癌患者外周血細(xì)胞中miRNA-216b 的相對(duì)表達(dá)量低于健康者，且miRNA-216b 對(duì)宮頸癌具有一定的診斷價(jià)值。由于外周血樣本容易獲得，因此外周血miRNA-216b 檢測(cè)可輔助診斷宮頸癌，具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。

除了可以作為宮頸癌的診斷標(biāo)志物，miRNA-216b表達(dá)水平還與宮頸癌患者的預(yù)后密切相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，miRNA-216b 低表達(dá)組和高表達(dá)組患者的年齡、HPV 感染情況、病理分期、腫瘤直徑比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹥0.05）；miRNA-216b低表達(dá)組患者臨床分期為Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、術(shù)后復(fù)發(fā)的比例均高于miRNA-216b 高表達(dá)組患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹤0.05）。此外，生存分析結(jié)果顯示，miRNA-216b 高表達(dá)組患者的總生存情況優(yōu)于miRNA-216b 低表達(dá)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹤0.05）；然而，miRNA-216b 高表達(dá)組和低表達(dá)組患者的無(wú)病生存情況比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹥0.05），可能與病例數(shù)較少等因素有關(guān)。He 等[16]研究發(fā)現(xiàn)，宮頸癌組織中miRNA-216b 的表達(dá)情況與臨床分期、總生存期及無(wú)病生存期密切相關(guān)。因此，可以初步判斷無(wú)論從腫瘤組織還是外周血層面，miRNA-216 表達(dá)水平都可以作為判斷宮頸癌患者預(yù)后的重要標(biāo)志物。

綜上所述，宮頸癌患者外周血細(xì)胞中miRNA-216b 表達(dá)下調(diào)，其可以作為輔助診斷宮頸癌和判斷預(yù)后的重要標(biāo)志物。