19 號(hào)染色體開(kāi)放閱讀框5 蛋白調(diào)節(jié)自噬活性與結(jié)直腸癌惡性程度的關(guān)系△

李勝龍，閆炳文，王春敬，王明宇，喬鵬飛，王夫景#

1哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院普通外科，哈爾濱150086

2哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院普通外科，哈爾濱1500000

結(jié)直腸癌是中國(guó)常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤之一，近年來(lái)中國(guó)結(jié)直腸癌的發(fā)病率和病死率均呈逐年升高的趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅著人們的健康。19 號(hào)染色體開(kāi)放閱讀框5（chromosome 19 open reading frame 5，C19ORF5）也稱微管相關(guān)蛋白1S（microtubule associated protein 1S，MAP1S），是微管相關(guān)蛋白1 家族的一員，在細(xì)胞分裂中的功能已被證實(shí)，其在細(xì)胞分裂的起始階段具有關(guān)鍵作用[1]。自噬現(xiàn)象是細(xì)胞通過(guò)溶酶體清除有缺陷的線粒體和蛋白質(zhì)聚合體，從而維持線粒體自身穩(wěn)定性，緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的應(yīng)激狀態(tài)[2]。自噬發(fā)生在真核細(xì)胞中，是細(xì)胞初級(jí)溶酶體處理內(nèi)源性底物的重要過(guò)程，自噬功能障礙可誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，削弱有絲分裂檢查點(diǎn)，引起DNA 雙螺旋鏈裂解。這一系列的變化最終會(huì)導(dǎo)致遺傳不穩(wěn)定性的產(chǎn)生，是大多數(shù)實(shí)體瘤的起源。C19ORF5 是一種適配器蛋白，能夠正向調(diào)控自噬活性，參與自噬溶酶體的產(chǎn)生和降解，從而影響基因的不穩(wěn)定性和腫瘤的發(fā)生[3-7]。C19ORF5 升高時(shí)可激活自噬活性，抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)和基因的不穩(wěn)定性，而C19ORF5 缺乏時(shí)，自噬活性降低，基因不穩(wěn)定性增加，易誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生，因此認(rèn)為C19ORF5 調(diào)節(jié)自噬活性與腫瘤病灶的惡性程度呈負(fù)相關(guān)[4]。因此，本研究探討了C19ORF5 調(diào)節(jié)自噬活性與結(jié)直腸癌惡性程度的關(guān)系，旨在為結(jié)直腸癌化療藥物的開(kāi)發(fā)、應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2013 年5 月至2017 年5 月于哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院接受治療的結(jié)直腸癌患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)術(shù)后病理明確診斷為原發(fā)性結(jié)直腸癌；②術(shù)中完整切除腫瘤，病理證實(shí)切緣陰性；③術(shù)前無(wú)新輔助治療，如化療、放療等；④臨床資料、病理資料及隨訪資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①既往有腫瘤病史；②合并嚴(yán)重的心、腦、肺等基礎(chǔ)疾??；③手術(shù)未達(dá)到R0切除。依據(jù)納入和排除標(biāo)準(zhǔn)，本研究共納入141 例結(jié)直腸癌患者。其中，男92 例，女49 例；年齡45～75 歲，中位年齡為63 歲；腫瘤類型：直腸癌94 例，升結(jié)腸癌14 例，橫結(jié)腸癌7 例，降結(jié)腸癌5 例，乙狀結(jié)腸癌21 例；TNM 分期：Ⅰ期6 例，Ⅱ期24例，Ⅲ期74例，Ⅳ期37例；病理類型：管狀腺癌116 例，黏液腺癌20 例，未分化癌3 例，神經(jīng)內(nèi)分泌癌2例。收集結(jié)直腸癌患者的結(jié)直腸癌組織和癌旁正常組織（距結(jié)直腸癌組織≥5 cm）各141例。

1.2 檢測(cè)方法

將結(jié)直腸癌組織和癌旁正常組織切分為3 個(gè)部分。第一部分觀察組織中線粒體和溶酶體/自噬體超微結(jié)構(gòu)的變化，首先應(yīng)用枸櫞酸鈉洗滌3 次，2.5%的戊二醛固定，4 ℃冷藏3 h，然后制作成超薄切片并染色，在高壓（80 kV）透射電鏡下觀察超微結(jié)構(gòu)的變化。將第二部分組織置于4%多聚甲醛溶液中，將其固定、兩次脫水處理、包埋，趁其未凝固，將組織蠟塊切成5 μm 厚的薄片，切片貼于經(jīng)多聚賴氨酸處理的載玻片上，68 ℃烤片后，在顯微鏡下進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。第三部分組織進(jìn)行實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR），采用實(shí)時(shí)定量PCR 試劑盒檢測(cè)組織中C19ORF5 mRNA 的表達(dá)水平。

1.3 結(jié)果判定

細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞。隨機(jī)觀察5 個(gè)高倍視野，采用半定量法進(jìn)行評(píng)分。依據(jù)染色強(qiáng)度評(píng)分：無(wú)色為0 分，淡黃色為1分，棕黃色為2 分，棕褐色為3 分。依據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞百分比評(píng)分：無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞為0 分，陽(yáng)性細(xì)胞百分比﹤25%為1 分，25%～75%為2 分，﹥75%為3 分。染色強(qiáng)度評(píng)分與陽(yáng)性細(xì)胞百分比評(píng)分相加，0～3 分為低表達(dá)，4～6 分為高表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 23.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以P﹤0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)直腸癌組織和癌旁正常組織中C19ORF5蛋白表達(dá)情況的比較

電鏡下觀察組織的超微結(jié)構(gòu)，尤其是亞細(xì)胞器官（線粒體和溶酶體/自噬體）的結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示，Ⅰ/Ⅱ期結(jié)直腸癌細(xì)胞的自噬活性較高，Ⅲ/Ⅳ期結(jié)直腸癌細(xì)胞的自噬活性較低。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，C19ORF5 蛋白為淡黃色至棕褐色顆粒，表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)。結(jié)直腸癌組織中C19ORF5 蛋白的染色強(qiáng)度明顯高于癌旁正常組織，Ⅰ/Ⅱ期結(jié)直腸癌組織中C19ORF5 蛋白的染色強(qiáng)度明顯高于Ⅲ/Ⅳ期結(jié)直腸癌組織（圖1）。

2.2 結(jié)直腸癌組織和癌旁正常組織中C19ORF5 mRNA 表達(dá)水平的比較

結(jié)直腸癌組織中C19ORF5 mRNA 的表達(dá)水平為（1.17±0.45），明顯高于癌旁正常組織的（0.82±0.29），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.217，P=0.004）。

2.3 不同臨床特征結(jié)直腸癌患者結(jié)直腸癌組織中C19ORF5 蛋白表達(dá)情況的比較

結(jié)直腸癌組織中C19ORF5 蛋白低表達(dá)97 例，C19ORF5 蛋白高表達(dá)44 例。TNM 分期為Ⅰ～Ⅱ期、癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）升高、無(wú)肝轉(zhuǎn)移結(jié)直腸癌患者結(jié)直腸癌組織中C19ORF5 蛋白高表達(dá)率分別高于TNM 分期為Ⅲ～Ⅳ期、CEA 正常、有肝轉(zhuǎn)移的患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹤0.05）。不同淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況結(jié)直腸癌患者結(jié)直腸癌組織中C19ORF5 蛋白表達(dá)情況比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹥0.05）。（表1）

圖1 C19ORF5蛋白在結(jié)直腸癌組織和癌旁正常組織中的表達(dá)情況（免疫組織化學(xué)染色，×400）

3 討論

結(jié)直腸癌是嚴(yán)重威脅人類生命健康的惡性腫瘤之一，據(jù)報(bào)道，全球每年新增結(jié)直腸癌患者102萬(wàn)例，死亡53 萬(wàn)例[8]。手術(shù)或聯(lián)合放化療可改善結(jié)直腸癌患者的預(yù)后，但遠(yuǎn)期生存情況的改善不明顯。隨著基礎(chǔ)研究的不斷發(fā)展，靶向治療及免疫治療已逐漸成為惡性腫瘤輔助治療的重要方法，研究與發(fā)現(xiàn)新的結(jié)直腸癌標(biāo)志物對(duì)改善臨床治療效果、延長(zhǎng)患者的生存時(shí)間具有重要意義。C19ORF5 是作用于自噬過(guò)程的一種適配器蛋白，能夠正向調(diào)控自噬活性，并參與自噬溶酶體的產(chǎn)生和降解[9-10]。自噬功能障礙可誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，氧化應(yīng)激可削弱有絲分裂檢查點(diǎn)，引起DNA 雙螺旋鏈裂解。這一系列的變化最終會(huì)導(dǎo)致遺傳不穩(wěn)定性的增加，是大多數(shù)實(shí)體瘤的起源，并對(duì)腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有調(diào)節(jié)作用，已成為研究熱點(diǎn)[11]。

本研究結(jié)果顯示，Ⅰ/Ⅱ期結(jié)直腸癌組織中C19ORF5 蛋白的染色強(qiáng)度明顯高于Ⅲ/Ⅳ期結(jié)直腸癌組織，說(shuō)明C19ORF5 蛋白在早期結(jié)直腸癌組織中高表達(dá)，自噬過(guò)程較為活躍，在晚期結(jié)直腸癌組織中表達(dá)降低，自噬活性降低。研究發(fā)現(xiàn)，C19ORF5 蛋白可增強(qiáng)自噬作用，其與氧化應(yīng)激和基因不穩(wěn)定性之間具有重要關(guān)聯(lián)[4]。高水平的氧化應(yīng)激和基因的不穩(wěn)定性均能夠增強(qiáng)C19ORF5 蛋白的表達(dá)，而C19ORF5 蛋白可激活自噬作用，去除p62（一種反映細(xì)胞氧化應(yīng)激強(qiáng)度的自噬底物蛋白）相關(guān)的聚合體與失去功能的細(xì)胞器，從而抑制氧化應(yīng)激過(guò)程，減少DNA 雙螺旋的裂解，并抑制基因的不穩(wěn)定性。由于存在著這樣的反饋環(huán)路，機(jī)體才能夠保持平衡和穩(wěn)定的發(fā)展。一旦C19ORF5蛋白表達(dá)缺失，自噬活性將受到影響，反饋環(huán)路被打破，基因的不穩(wěn)定性將會(huì)增加[4,12-13]。因此，C19ORF5 蛋白增強(qiáng)自噬作用與抑制基因的不穩(wěn)定性和腫瘤發(fā)生的關(guān)系得以建立。

表1 不同臨床特征結(jié)直腸癌患者結(jié)直腸癌組織中C19ORF5 蛋白表達(dá)情況的比較（n=141）

本研究的實(shí)時(shí)定量PCR 結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌組織中C19ORF5 mRNA 的表達(dá)水平明顯高于癌旁正常組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹤0.01）；TNM 分期為Ⅰ～Ⅱ期、CEA 升高、無(wú)肝轉(zhuǎn)移結(jié)直腸癌患者結(jié)直腸癌組織中C19ORF5 蛋白高表達(dá)率分別高于TNM 分期為Ⅲ～Ⅳ期、CEA 正常、有肝轉(zhuǎn)移的患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹤0.05）。說(shuō)明結(jié)直腸癌組織中C19ORF5 mRNA 表達(dá)水平升高，且其蛋白表達(dá)情況與TNM 分期、CEA 水平、肝轉(zhuǎn)移有關(guān)。有研究顯示，C19ORF5 蛋白主要表達(dá)于復(fù)層上皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，隨著腫瘤細(xì)胞的增殖，表達(dá)C19ORF5 蛋白的細(xì)胞數(shù)量增多[11,14]。腫瘤發(fā)生后，為滿足機(jī)體對(duì)自噬活性的需求，C19ORF5 蛋白會(huì)在腫瘤生發(fā)中心表達(dá)上調(diào)，但如果C19ORF5 蛋白在腫瘤細(xì)胞中缺失，自噬活性將降低，低表達(dá)C19ORF5 蛋白的患者生存率降低，且患者易出現(xiàn)淋巴結(jié)和肝轉(zhuǎn)移等[15]。

綜上所述，在結(jié)直腸癌組織中，高表達(dá)的C19ORF5 蛋白可增加腫瘤細(xì)胞的自噬活性，增加基因的穩(wěn)定性，降低腫瘤的惡性程度。因此推測(cè)，由于C19ORF5 蛋白調(diào)節(jié)自噬活性與結(jié)直腸癌的惡性程度呈負(fù)相關(guān)，C19ORF5 可能是一種重要的抑癌基因，C19ORF5 蛋白缺失或基因變異可能是導(dǎo)致腫瘤進(jìn)一步惡化的關(guān)鍵因素。針對(duì)C19ORF5 蛋白的深入研究可以為結(jié)直腸癌的診斷和治療提供新的思路。