O6-甲基鳥嘌呤-DNA-甲基轉(zhuǎn)移酶、細(xì)胞周期相關(guān)蛋白1、F 框/WD-40 域蛋白7 在腦膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)情況及臨床意義

吳鵬程，李太平，晉濤，吳中華

1鄭州頤和醫(yī)院神經(jīng)外科，鄭州450000

2河南省人民醫(yī)院神經(jīng)外科，鄭州4500000

腦膠質(zhì)瘤屬于神經(jīng)系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，占全部顱腦腫瘤的50%以上，一般呈浸潤性生長，手術(shù)治療常無法全切，容易復(fù)發(fā)，因此病死率較高，對(duì)患者的生活質(zhì)量和身心健康造成了嚴(yán)重的影響[1]。因此，明確腦膠質(zhì)瘤的發(fā)病機(jī)制并尋求有效的治療方法對(duì)改善患者預(yù)后具有重要意義。研究發(fā)現(xiàn)，腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展與細(xì)胞無限增殖、凋亡抑制以及增殖和凋亡調(diào)控紊亂關(guān)系密切，因此有關(guān)腦膠質(zhì)瘤內(nèi)細(xì)胞因子變化的研究越來越多，O6-甲基鳥嘌呤-DNA-甲基轉(zhuǎn)移酶（O-6-methylguanine- DNA methyltransferase，MGMT）屬 于 高 效DNA 直接修復(fù)酶，在腦膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)水平與腫瘤化療耐藥以及放療抵抗有關(guān)，且與患者預(yù)后具有直接聯(lián)系。F 框/WD-40 域蛋白7（F-box and WD repeat domain containing 7，F(xiàn)BXW7）屬于抑癌因子，在真核生物中廣泛存在，可識(shí)別的多種細(xì)胞底物均為細(xì)胞周期促進(jìn)因子，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中具有關(guān)鍵作用。細(xì)胞周期相關(guān)蛋白1（cell cycle associated protein 1，CAPRIN1）屬于高度保守的細(xì)胞質(zhì)磷酸化蛋白，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及耐藥關(guān)系密切，在腦部和淋巴組織中表達(dá)水平最高，其表達(dá)上調(diào)有利于腫瘤細(xì)胞在缺氧、低營養(yǎng)微環(huán)境中生存和增殖[2]。然而，有關(guān)上述3種指標(biāo)在腦膠質(zhì)瘤中表達(dá)情況的報(bào)道相對(duì)少見。本研究分析了MGMT、CAPRIN1、FBXW7 蛋白在腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)情況，以期為臨床治療提供指導(dǎo)和依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017 年1 月至2020 年2 月鄭州頤和醫(yī)院收治的腦膠質(zhì)瘤患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)病理學(xué)檢查確診為腦膠質(zhì)瘤；臨床資料完整；年齡﹥18 歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：具有放化療等治療史；合并其他系統(tǒng)惡性腫瘤、免疫系統(tǒng)疾病、血液系統(tǒng)疾病。依據(jù)納入和排除標(biāo)準(zhǔn)，本研究共納入78 例腦膠質(zhì)瘤患者，作為觀察組。同時(shí)選取20 例因外傷或腦出血行顱內(nèi)減壓治療的患者，作為對(duì)照組。觀察組患者中，男47例，女31 例；平均年齡為（50.43±8.87）歲。對(duì)照組患者中，男11 例，女9 例；平均年齡為（49.52±9.10）歲。兩組患者的性別和年齡比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹥0.05），具有可比性。分別收集兩組患者的腦膠質(zhì)瘤組織和正常腦組織。

1.2 免疫組織化學(xué)染色方法及判定標(biāo)準(zhǔn)

采用石蠟組織微陣列方法將腦膠質(zhì)瘤組織和正常腦組織制作成標(biāo)本，切成厚度為4 μm 的切片，經(jīng)過烤片、脫蠟、脫水及3%雙氧水37 ℃孵育10 min后，采用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）沖洗，然后置于檸檬酸鈉溶液中進(jìn)行抗原熱修復(fù)，在羊血清工作液中37 ℃封閉10 min，分別加入適當(dāng)濃度的一抗（MGMT、CAPRIN1、FBXW7），4 ℃過夜孵育，以PBS 代替一抗作為陰性對(duì)照，次日室溫下采用PBS 充分沖洗3 次，加入相應(yīng)二抗孵育30 min，PBS 沖洗3 次，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈酶卵白素，作用15 min，PBS 沖洗3 次，二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色，蘇木精復(fù)染，顯微鏡下進(jìn)行觀察。陽性反應(yīng)為細(xì)胞核呈現(xiàn)棕黃色顆粒。陰性為無著色；與未加一抗的陰性對(duì)照比較，弱陽性（+）為著色略深，中等陽性（++）為著色較深，強(qiáng)陽性（+++）為著色明顯加深。由兩位具有5 年以上檢驗(yàn)科工作經(jīng)驗(yàn)的檢驗(yàn)師對(duì)病理結(jié)果進(jìn)行判斷，意見不同時(shí)兩人共同商討給予最終結(jié)論。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以P﹤0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者M(jìn)GMT、CAPRIN1、FBXW7 蛋白陽性表達(dá)情況的比較

觀察組患者的MGMT 和CAPRIN1 蛋白陽性表達(dá)率均明顯高于對(duì)照組，而FBXW7 蛋白陽性表達(dá)率明顯低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹤0.01）。（表1、圖1、圖2）

表1 兩組患者M(jìn)GMT、CAPRIN1、FBXW7 蛋白陽性表達(dá)情況的比較[n（%）]

圖1 腦膠質(zhì)瘤組織中MGMT、CAPRIN1、FBXW7蛋白的表達(dá)情況（免疫組織化學(xué)染色，×400）

圖2 正常腦組織中MGMT、CAPRIN1、FBXW7蛋白的表達(dá)情況（免疫組織化學(xué)染色，×200）

2.2 不同臨床特征腦膠質(zhì)瘤患者腦膠質(zhì)瘤組織中MGMT 蛋白表達(dá)情況的比較

不同性別、年齡、病理分級(jí)、病灶直徑、病理類型腦膠質(zhì)瘤患者腦膠質(zhì)瘤組織中MGMT 蛋白的陽性表達(dá)率比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹥0.05）；隨訪3 年，死亡腦膠質(zhì)瘤患者腦膠質(zhì)瘤組織中MGMT蛋白的陽性表達(dá)率明顯高于生存患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹤0.01）。（表2）

表2 不同臨床特征腦膠質(zhì)瘤患者腦膠質(zhì)瘤組織中MGMT蛋白表達(dá)情況的比較（n=78）

2.3 不同臨床特征腦膠質(zhì)瘤患者腦膠質(zhì)瘤組織中CAPRIN1 蛋白表達(dá)情況的比較

不同性別、年齡、病灶直徑、病理類型、預(yù)后情況腦膠質(zhì)瘤患者腦膠質(zhì)瘤組織中CAPRIN1 蛋白的陽性表達(dá)率比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹥0.05）；病理分級(jí)為Ⅲ～Ⅳ級(jí)腦膠質(zhì)瘤患者腦膠質(zhì)瘤組織中CAPRIN1 蛋白的陽性表達(dá)率明顯高于病理分級(jí)為Ⅰ～Ⅱ級(jí)的患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹤0.01）。（表3）

表3 不同臨床特征腦膠質(zhì)瘤患者腦膠質(zhì)瘤組織中CAPRIN1 蛋白表達(dá)情況的比較（n=78）

2.4 不同臨床特征腦膠質(zhì)瘤患者腦膠質(zhì)瘤組織中FBXW7 蛋白表達(dá)情況的比較

不同性別、年齡、病灶直徑、病理類型、預(yù)后情況腦膠質(zhì)瘤患者腦膠質(zhì)瘤組織中FBXW7 蛋白的陽性表達(dá)率比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹥0.05）；病理分級(jí)為Ⅲ～Ⅳ級(jí)腦膠質(zhì)瘤患者腦膠質(zhì)瘤組織中FBXW7 蛋白的陽性表達(dá)率明顯低于病理分級(jí)為Ⅰ～Ⅱ級(jí)的患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹤0.01）。（表4）

表4 不同臨床特征腦膠質(zhì)瘤患者腦膠質(zhì)瘤組織中FBXW7 蛋白表達(dá)情況的比較（n=78）

3 討論

腦膠質(zhì)瘤的生物學(xué)特征較為特殊，其起源于原始神經(jīng)細(xì)胞，呈惡性浸潤性增殖，手術(shù)治療是主要的治療方法，但術(shù)后容易復(fù)發(fā)，雖然近年來常規(guī)治療方法不斷發(fā)展，但患者預(yù)后并未得到顯著改善。隨著分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，基因治療已成為腦膠質(zhì)瘤的重要治療方法，在基因水平尋求更為有效的治療靶點(diǎn)一直是臨床研究的熱點(diǎn)話題[3-4]。研究發(fā)現(xiàn)，腦膠質(zhì)瘤的分化程度較低，侵襲性較強(qiáng)，且容易對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥性，最終造成腫瘤復(fù)發(fā)，無法控制，危及患者的生命安全[5]。目前臨床對(duì)于腦膠質(zhì)瘤主要采取手術(shù)切除治療，但由于腦膠質(zhì)瘤呈浸潤性生長且多數(shù)生長在腦部的重要結(jié)構(gòu)，部分患者通過手術(shù)無法完全切除病灶。有研究報(bào)道，惡性腦膠質(zhì)瘤患者手術(shù)后的5 年生存率僅為30%[6]。目前認(rèn)為惡性腫瘤的發(fā)展是多種因素共同作用的結(jié)果，正常情況下細(xì)胞增殖和凋亡處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，依賴多種因素調(diào)控，一旦原癌基因激活，抑癌基因突變失活，會(huì)造成腫瘤細(xì)胞增殖失去控制，腫瘤細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)移。因此探討原癌基因和抑癌基因及表達(dá)產(chǎn)物的致癌和抑癌作用，成為了腦膠質(zhì)瘤診斷和治療的新方向[7-8]。

MGMT 在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)存在較大差異，該因子為高效的DNA 直接修復(fù)酶，可以修復(fù)DNA序列中的O6-甲基鳥嘌呤損傷，也是目前發(fā)現(xiàn)的唯一可以修復(fù)這一損傷的甲基轉(zhuǎn)移酶[9]。研究發(fā)現(xiàn)，MGMT 蛋白活性升高可對(duì)人體p53 基因起到保護(hù)作用，防止p53 基因發(fā)生突變，抑制MGMT 的表達(dá)后會(huì)造成其對(duì)p53 基因的保護(hù)作用減弱，導(dǎo)致p53基因突變?cè)黾?，?duì)細(xì)胞增殖產(chǎn)生明顯的影響[10]。FBXW7 則屬于抑癌基因，對(duì)細(xì)胞周期具有促進(jìn)作用，該因子缺失后會(huì)造成患者靶蛋白表達(dá)水平升高，導(dǎo)致惡性腫瘤發(fā)生和發(fā)展。動(dòng)物研究顯示，F(xiàn)BXW7 突變后會(huì)抑制細(xì)胞增殖，但是該蛋白對(duì)于底物的識(shí)別機(jī)制可能較亞基特異性的簡單區(qū)別更加復(fù)雜[11-12]。CAPRIN1 是存在于RNA 中的轉(zhuǎn)運(yùn)顆粒，能夠?qū)⑿攀筊NA 轉(zhuǎn)運(yùn)到特定亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)周圍，與惡性腫瘤的浸潤生長和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，同時(shí)還能夠誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生反應(yīng)形成應(yīng)激性顆粒，有助于腫瘤細(xì)胞在缺氧、低營養(yǎng)等環(huán)境下生存與增殖，同時(shí)與腫瘤治療出現(xiàn)耐受性關(guān)系密切[13]。通過對(duì)CAPRIN1 的晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩個(gè)分子的CAPRIN1 能夠在細(xì)胞間結(jié)合形成同源二聚體，從而發(fā)揮復(fù)雜的細(xì)胞生物學(xué)功能；同時(shí)CAPRIN1 能夠參與細(xì)胞周期調(diào)控，與多種信使RNA 和蛋白結(jié)合，在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中具有關(guān)鍵作用，極有可能是腫瘤基因或者腫瘤相關(guān)基因[14-15]。

本研究結(jié)果顯示，觀察組患者的MGMT 和CAPRIN1 蛋白陽性表達(dá)率均明顯高于對(duì)照組，而FBXW7 蛋白陽性表達(dá)率明顯低于對(duì)照組（P﹤0.01），提示腦膠質(zhì)瘤組織中MGMT 和CAPRIN1 蛋白表達(dá)水平較高，F(xiàn)BXW7 蛋白表達(dá)水平較低。死亡腦膠質(zhì)瘤患者腦膠質(zhì)瘤組織中MGMT 蛋白的陽性表達(dá)率明顯高于生存患者，提示MGMT 蛋白對(duì)患者預(yù)后具有一定的預(yù)測價(jià)值。病理分級(jí)為Ⅲ～Ⅳ級(jí)腦膠質(zhì)瘤患者腦膠質(zhì)瘤組織中CAPRIN1 蛋白的陽性表達(dá)率明顯高于病理分級(jí)為Ⅰ～Ⅱ級(jí)的患者，而病理分級(jí)為Ⅲ～Ⅳ級(jí)腦膠質(zhì)瘤患者腦膠質(zhì)瘤組織中FBXW7 蛋白的陽性表達(dá)率明顯低于病理分級(jí)為Ⅰ～Ⅱ級(jí)的患者，提示CAPRIN1 和FBXW7蛋白表達(dá)與腦膠質(zhì)瘤患者的病理分級(jí)具有一定的關(guān)系。本研究分析了MGMT、CAPRIN1 和FBXW7蛋白在腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)情況及臨床意義，同時(shí)分析了3 種蛋白與患者預(yù)后及病理分級(jí)的關(guān)系，這在以往的研究中較為少見。然而，本研究納入的患者數(shù)量有限，關(guān)于MGMT、CAPRIN1 和FBXW7蛋白具體的作用機(jī)制及與預(yù)后的關(guān)系還需要進(jìn)一步探索。

綜上所述，腦膠質(zhì)瘤組織中MGMT 和CAPRIN1 蛋白表達(dá)上調(diào)，而FBXW7 蛋白表達(dá)下調(diào)，其中MGMT 蛋白可能與患者預(yù)后有關(guān)，而CAPRIN1和FBXW7 蛋白與病理分級(jí)有關(guān)。