山竹果皮總氧雜蒽酮通過調(diào)控肝癌擴(kuò)增因子1 表達(dá)抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)凋亡

陳素華，馬天江，張智慧，張磊，史磊

漯河市中心醫(yī)院腫瘤科，河南 漯河4620000

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是世界范圍內(nèi)常見的消化道惡性腫瘤，其發(fā)病率和病死率分別居惡性腫瘤第3位和第4位，普遍呈上升趨勢[1]。據(jù)統(tǒng)計，美國平均每年約有40.7/10 萬CRC 新發(fā)病例，死亡14.8/10 萬例，其中男性發(fā)病率和病死率分別高于女性30%和40%[2]。吸煙、酗酒、暴飲暴食、腸道菌群穩(wěn)態(tài)失衡、家族遺傳等是結(jié)直腸癌的危險因素，但其發(fā)病機(jī)制尚未詳細(xì)闡明[3-4]。結(jié)直腸癌的臨床治療以腹腔鏡手術(shù)、開腹手術(shù)等外科手術(shù)治療為主，輔以放療、化療、分子靶向治療等，術(shù)后總5 年生存率約為50%[5]；但多數(shù)患者術(shù)后易復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，且多數(shù)患者就診時已為晚期，放、化療對患者造成的負(fù)擔(dān)較大，因此尋找高效低毒的天然化合物輔助治療是目前腫瘤領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)之一[6]。山竹（Garcinia mangostana L）為金絲桃科藤黃屬常綠喬木，俗稱山竹子、山竺，主要分布于泰國、馬來西亞等國家及中國海南、廣西、福建等地；在一些東南亞國家，山竹果皮常用于治療痢疾、潰瘍和外傷等[7]。氧雜蒽酮類化合物（xanthones）是山竹果皮的主要化學(xué)成分之一，具有抗氧化、抗腫瘤、降血糖等廣泛的藥理活性[8]。肝癌擴(kuò)增因子1（amplified in liver cancer 1，ALC1）又稱為染色質(zhì)解旋酶DNA 結(jié) 合 蛋 白1（chromodomain helicase DNA binding protein 1 like，CHD1L），是從人肝癌細(xì)胞克隆并分離的新的癌基因，位于染色體1q21 區(qū)[9-10]。ALC1 可編碼89 kD 分子的蛋白，包含一個SNF2-N結(jié)構(gòu)域，屬于SNF2 類家族；能夠與DNA 結(jié)合調(diào)節(jié)核小體組裝、DNA 修復(fù)和染色質(zhì)重塑[11-12]。ALC1在食管癌、乳腺癌等腫瘤組織中高表達(dá)，其表達(dá)水平與腫瘤浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分期及患者預(yù)后具有顯著相關(guān)性，敲除ALC1 后，細(xì)胞遷移和侵襲能力均明顯降低[13-14]。ALC1 在結(jié)直腸癌組織中明顯高表達(dá)，參與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展[15]。但氧雜蒽酮對結(jié)直腸癌進(jìn)展的影響及其是否通過ALC1 影響結(jié)直腸癌的增殖和凋亡還尚未清楚。本研究通過以不同濃度氧雜蒽酮干預(yù)SW480 細(xì)胞，檢測細(xì)胞增殖、凋亡及ALC1 表達(dá)，探討氧雜蒽酮對SW480 細(xì)胞增殖、凋亡的影響及其可能的作用機(jī)制，以期為結(jié)直腸癌的臨床治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

SW480 細(xì)胞購自美國模式菌種收集中心（American Type Culture Collection，ATCC）；胎牛血清、RPMI1640 培養(yǎng)液均購自美國Gibco-BRL 公司；胰蛋白酶購自美國Thermo Fisher 公司；5-二苯基四氮 唑 溴 鹽（5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT）、碘化丙啶（propidium iodide，PI）均購自美國Sigma 公司；膜聯(lián)蛋白V（Annexin V）-異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）凋亡檢測試劑盒購自美國Coulter 公司；Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen 公司；control siRNA、ALC1 siRNA 由山東維真生物科技有限公司設(shè)計合成；pcDNA-ALC1 過表達(dá)載體由金瑞斯生物科技公司構(gòu)建；聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF）、電 化 學(xué) 發(fā) 光（electrochemiluminescence，ECL）液、Trizol 試劑、RIPA 裂解液均購自北京Solarbio 公司；兔抗B 細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2（B cell lymphoma/leukemia-2，Bcl-2）、Bcl-2 相關(guān)X 蛋白（Bcell lymphoma/leukemia- 2 associated X protein，BAX）、ALC1、β-actin 抗 體 和 辣 根 過 氧 化 物 酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記的山羊抗兔免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）均購自美國Abcam 公司；TaKaRa 反轉(zhuǎn)錄試劑盒、TaKaRa 實(shí)時熒光定量試劑盒均購自寶生物工程（大連）有限公司。CFX96 Touch TM 熒光定量PCR 檢測系統(tǒng)、Chemi-Doc TM MP 凝膠成像系統(tǒng)均購自美國Bio-Rad 公司；MCO-18AC 型CO2培養(yǎng)箱購自日本SANYO 公司；Nanodrop ND-2000 超微量核酸蛋白測定儀購自上海創(chuàng)萌生物科技有限公司；HBS-1096B 型酶標(biāo)儀購自南京德鐵實(shí)驗(yàn)設(shè)備公司。

1.2 山竹果皮中總氧雜蒽酮提取物的制備

將山竹果皮洗凈烘干后粉碎，取50 g 山竹果皮粉末溶于500 ml 85%乙醇中，放置過夜（16 h）；過濾收集上清液，旋蒸至約10 ml，用乙酸乙酯萃取，取上清；過硅膠柱后正己烷和乙酸乙酯（5∶1）洗脫，洗脫液烘干后所得干粉用DMSO 溶解，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

使用含10%胎牛血清的RPMI1640 培養(yǎng)液于37 ℃、5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)SW480 細(xì)胞。取對數(shù)生長期的細(xì)胞，經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化后收集并重懸，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為1×105/ml，接種至24 孔板，繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞融合度約45%，將control siRNA（si-NC 組）、ALC1 siRNA（si-ALC1 組）、pcDNA3.1 空載體和pcDNA-ALC1 過表達(dá)載體轉(zhuǎn)染至SW480 細(xì)胞，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1 空載體和pcDNAALC1 過表達(dá)載體的細(xì)胞置于含400 μmol/L 山竹果皮總氧雜蒽酮的培養(yǎng)液中培養(yǎng)并記為總氧雜蒽酮+pcDNA 組和總氧雜蒽酮+pcDNA-ALC1 組。單獨(dú)使用含400 μmol/L 山竹果皮總氧雜蒽酮的培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)的細(xì)胞記為總氧雜蒽酮組，未作處理的細(xì)胞記為對照組。每組6個復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 MTT 法檢測細(xì)胞增殖

取SW480細(xì)胞隨機(jī)分為0 μmol/L組、200 μmol/L組、400 μmol/L 組、600 μmol/L 組和800 μmol/L 組；處理方法：在SW480 細(xì)胞培養(yǎng)液中加入總氧雜蒽酮，并分別調(diào)整終濃度為0、200、400、600、800 μmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。在上述細(xì)胞及si-NC組、si-ALC1組、對照組、總氧雜蒽酮組、總氧雜蒽酮+pcDNA組和總氧雜蒽酮+pcDNA-ALC1組細(xì)胞培養(yǎng)液中加入20 μl濃度為5 mg/ml的MTT，繼續(xù)孵育4 h；棄去多余培養(yǎng)基并加入150 μl 二甲基亞砜振蕩反應(yīng)10 min，酶標(biāo)儀檢測490 nm 處吸光度（A）值。藥物對細(xì)胞的抑制率=（1-實(shí)驗(yàn)組A 值/對照組A 值）×100%。

1.5 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡

取si-NC 組、si-ALC1 組、對照組、總氧雜蒽酮組、總氧雜蒽酮+pcDNA 組和總氧雜蒽酮+pcDNAALC1組細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化，4 ℃、1600 r/min離心收集。按照Annexin V-FITC/PI 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒說明書，分別加入5 μl Annexin V-FITC 和10 μl PI，輕輕混勻后室溫避光孵育15 min，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。

1.6 實(shí)時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR）檢測mRNA 相對表達(dá)量

收集對照組、總氧雜蒽酮組細(xì)胞，研磨充分后Trizol 法提取總RNA。檢測總RNA 濃度和純度，按照TaKaRa 反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA，使用TaKaRa 熒光定量試劑盒配制反應(yīng)體系，以β-actin 為內(nèi)參進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，每個RNA 樣品重復(fù)3 次。采用2-△△Ct法計算目的基因相對表達(dá)量，所用引物及序列見表1。

表1 qRT-PCR 引物及序列

1.7 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測蛋白表達(dá)情況

收集si-NC 組、si-ALC1 組、對照組、總氧雜蒽酮組、總氧雜蒽酮+pcDNA 組和總氧雜蒽酮+pcDNA-ALC1 組細(xì)胞，加入RIPA 裂解液置于冰上裂解細(xì)胞，4 ℃、23 000 r/min 離心15 min，收集上清液。將蛋白樣品進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulphate-polyacryl amide gel electrophoresis，SDS-PAGE）電泳后轉(zhuǎn)至PVDF 膜上，5%脫脂奶粉封閉液室溫封閉1 h。分別加入兔抗Bcl-2（1∶1000）、BAX（1∶1000）、ALC1（1∶1000）和β-actin（1∶10 000）抗體4 ℃孵育過夜，TBST 洗膜3次，每次10 min；加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG（1∶5000）室溫孵育2 h，TBST 洗滌；ECL 發(fā)光顯影，每個蛋白樣品重復(fù)3 次。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，多組間兩兩比較采用SNK-q 檢驗(yàn)，兩組間比較采用t 檢驗(yàn)，以P﹤0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度總氧雜蒽酮對SW480細(xì)胞增殖的影響

MTT 檢測結(jié)果表明，不同濃度山竹果皮總氧雜蒽酮均可有效抑制SW480 細(xì)胞增殖（P﹤0.05），其增殖抑制率隨總氧雜蒽酮濃度的增加而提高（P﹤0.05）；400 μmol/L 總氧雜蒽酮處理后細(xì)胞增殖抑制率接近50%，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。（表2）

表2 不同濃度總氧雜蒽酮對SW480 細(xì)胞增殖抑制率的比較（±s）

表2 不同濃度總氧雜蒽酮對SW480 細(xì)胞增殖抑制率的比較（±s）

注：a與0 μmol/L組比較，P<0.05；b與200 μmol/L組比較，P<0.05；c與400 μmol/L組比較，P<0.05；d與600 μmol/L組比較，P<0.05

組別0 μmol/L組200 μmol/L組400 μmol/L組600 μmol/L組800 μmol/L組F值P值增殖抑制率（%）5.6±0.76 23.12±2.13a 48.46±4.11a b 63.74±5.11a b c 78.49±5.04a b c d 179.011 0.000

2.2 總氧雜蒽酮對SW480 細(xì)胞凋亡的影響

以400 μmol/L 總氧雜蒽酮干預(yù)SW480 細(xì)胞，凋亡細(xì)胞增多，細(xì)胞凋亡率為（25.79±2.11）%，高于對照組的（7.61±0.69）%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=14.184，P﹤0.05）。（圖1）

圖1 流式細(xì)胞儀檢測對照組與總氧雜蒽酮組細(xì)胞凋亡情況

2.3 總氧雜蒽酮對SW480 細(xì)胞中Bcl-2、BAX、ALC1 相對表達(dá)量的影響

以400 μmol/L 總氧雜蒽酮干預(yù)SW480 細(xì)胞后檢測細(xì)胞中Bcl-2、BAX、ALC1 相對表達(dá)量?？傃蹼s蒽酮組SW480 細(xì)胞中Bcl-2、ALC1 相對表達(dá)量均明顯低于對照組，BAX 相對表達(dá)量明顯高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P﹤0.01）。（表3）

表3 對照組與總氧雜蒽酮組SW480 細(xì)胞中Bcl-2、BAX、ALC1 相對表達(dá)量的比較（±s）

表3 對照組與總氧雜蒽酮組SW480 細(xì)胞中Bcl-2、BAX、ALC1 相對表達(dá)量的比較（±s）

組別對照組總氧雜蒽酮組t值P值Bcl-2 mRNA 0.97±0.08 0.58±0.05 7.160 0.002 BAX mRNA 0.66±0.07 1.03±0.06 6.951 0.002 ALC1 mRNA 5.61±0.12 2.97±0.15 23.804 0.000

2.4 總氧雜蒽酮對SW480 細(xì)胞中Bcl-2、BAX、ALC1 蛋白表達(dá)情況的影響

Western blot 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，總氧雜蒽酮組SW480 細(xì)胞中Bcl-2、ALC1 蛋白表達(dá)量均明顯低于對照組，BAX 蛋白表達(dá)量明顯高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P﹤0.01）。（圖2、表4）

2.5 敲減ALC1 對SW480 細(xì)胞增殖和凋亡的影響

si-ALC1 組SW480 細(xì)胞中ALC1 蛋白表達(dá)水平明顯低于si-NC 組，細(xì)胞增殖抑制率和凋亡率均明顯高于si-NC 組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P﹤0.01）。（圖3、表5）

圖2 Western blot法檢測對照組及總氧雜蒽酮組SW480細(xì)胞中Bcl-2、BAX、ALC1蛋白表達(dá)情況

表4 對照組與總氧雜蒽酮組SW480 細(xì)胞中Bcl-2、BAX、

ALC1 蛋白表達(dá)量的比較（±s）

組別對照組總氧雜蒽酮組t值P值Bcl-2蛋白0.53±0.03 0.19±0.02 16.333 0.000 BAX蛋白0.16±0.02 0.47±0.04 12.006 0.000 ALC1蛋白0.86±0.07 0.37±0.04 10.527 0.001

圖3 Western blot檢測si-NC組和si-ALC1組SW480細(xì)胞中ALC1蛋白表達(dá)情況

表5 si-NC 組和si-ALC1 組SW480 細(xì)胞ALC1 蛋白表達(dá)量、增殖抑制率及凋亡率的比較（±s）

表5 si-NC 組和si-ALC1 組SW480 細(xì)胞ALC1 蛋白表達(dá)量、增殖抑制率及凋亡率的比較（±s）

組別si-NC組si-ALC1組t值P值A(chǔ)LC1蛋白0.79±0.08 0.25±0.03 10.947 0.000增殖抑制率（%）6.46±0.67 39.49±3.17 17.657 0.000凋亡率（%）7.13±0.72 21.46±2.24 10.549 0.001

2.6 過表達(dá)ALC1 對SW480 細(xì)胞增殖和凋亡的影響

總氧雜蒽酮組SW480 細(xì)胞中ALC1 蛋白表達(dá)水平低于對照組，細(xì)胞增殖抑制率和凋亡率均高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P﹤0.05）；而將pcDNA-ALC1 轉(zhuǎn)染至SW480 細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理后，總氧雜蒽酮+pcDNA-ALC1 組SW480 細(xì)胞中ALC1蛋白表達(dá)水平高于總氧雜蒽酮+pcDNA 組，細(xì)胞增殖抑制率和凋亡率均低于總氧雜蒽酮+pcDNA 組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P﹤0.05）。（圖4、表6）

圖4 Western blot檢測各組SW480細(xì)胞中ALC1蛋白表達(dá)情況

表6 各組SW480 細(xì)胞ALC1 蛋白表達(dá)量、增殖抑制率及凋亡率的比較（±s）

表6 各組SW480 細(xì)胞ALC1 蛋白表達(dá)量、增殖抑制率及凋亡率的比較（±s）

注：a與對照組比較，P<0.05；b與總氧雜蒽酮+pcDNA組比較，P<0.05

增殖抑制率（%）7.11±0.68 49.36±4.07a 46.11±4.34 12.76±2.13b 143.573 0.000凋亡率（%）7.98±0.81 28.46±2.11a 24.13±2.09 14.26±1.87b 79.972 0.000組別對照組總氧雜蒽酮組總氧雜蒽酮+pcDNA組總氧雜蒽酮+pcDNA-ALC1組F值P值A(chǔ)LC1蛋白0.82±0.07 0.31±0.03a 0.28±0.02 0.73±0.07b 84.649 0.000

3 討論

隨著生活方式和飲食結(jié)構(gòu)的改變及人口老齡化的加劇，中國結(jié)直腸癌發(fā)病率和病死率逐年增高，在2003—2011 年，中國結(jié)直腸癌發(fā)病率由12.8/10 萬增加到16.8/10 萬，病死率則由5.9/10 萬上升至7.8/10 萬，嚴(yán)重影響居民生活質(zhì)量[16]。因此，尋找結(jié)直腸癌早期預(yù)防及改善其臨床療效的有效方法具有重要意義。

山竹是一種藥食同源的水果，其果實(shí)富含維生素、蛋白質(zhì)和礦物質(zhì)，食用價值較高，素有“水果王后”之稱；其果皮、樹皮及樹根是泰國、印度等國家的傳統(tǒng)藥材，對腹瀉、腹痛、跌打扭傷、傷口感染的治療效果顯著[17]。氧雜蒽酮類化合物、黃酮類化合物是山竹果皮的主要活性成分，其中，氧雜蒽酮能夠抑制乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌及黑色素瘤的細(xì)胞活力，并對細(xì)胞凋亡具有促進(jìn)作用[18]。多項(xiàng)研究表明，氧雜蒽酮能夠通過調(diào)節(jié)絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、半胱氨酸蛋白酶3（caspase 3）信號通路及p38、基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）等基因表達(dá)，抑制腫瘤細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)凋亡，減少炎性介質(zhì)的釋放，從而發(fā)揮腫瘤抑制作用[19-20]。caspase 3是caspase 級聯(lián)反應(yīng)過程中的關(guān)鍵執(zhí)行分子，而Bcl-2 和BAX 位于線粒體上游，當(dāng)出現(xiàn)凋亡信號刺激時，BAX 由細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至線粒體膜上與Bcl-2 結(jié)合形成同源二聚體，同時改變線粒體膜通透性，促進(jìn)細(xì)胞色素C 的釋放，進(jìn)而激活caspase 3，啟動caspase 級聯(lián)反應(yīng)[21]。而氧雜蒽酮能夠使多種腫瘤細(xì)胞周期停滯，同時促進(jìn)細(xì)胞凋亡[22]。為研究氧雜蒽酮對結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響及潛在作用機(jī)制，本研究以SW480 細(xì)胞為研究對象，使用不同濃度氧雜蒽酮干預(yù)細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞增殖抑制率濃度依賴性增大；400 μmol/L 氧雜蒽酮可有效促進(jìn)SW480 細(xì)胞凋亡，抑制Bcl-2 表達(dá)并上調(diào)BAX表達(dá)。

李楊等[23]研究發(fā)現(xiàn)，ALC1 在肝癌細(xì)胞系中表達(dá)上調(diào)，采用RNAi 技術(shù)沉默ALC1 表達(dá)后，細(xì)胞增殖能力明顯受到抑制。ALC1 高表達(dá)與食管鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)，ALC1 高表達(dá)的食管鱗狀細(xì)胞癌患者總生存率低；ALC1 高表達(dá)可增強(qiáng)KYSE30 食管癌細(xì)胞的增殖、侵襲及遷移能力[13]。而在結(jié)直腸癌中，已有報道稱，ALC1 蛋白在結(jié)直腸癌組織中呈高表達(dá)，且ALC1 表達(dá)水平與腫瘤浸潤深度、腫瘤大小及分化程度密切相關(guān)，上調(diào)ALC1 表達(dá)能促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、遷移及裸鼠成瘤能力[15]。為研究氧雜蒽酮調(diào)控SW480 細(xì)胞增殖和凋亡的作用是否與ALC1 有關(guān)，本研究以400 μmol/L 氧雜蒽酮處理SW480 細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞中的ALC1 mRNA 和蛋白表達(dá)水平均顯著下調(diào)。提示氧雜蒽酮對SW480 細(xì)胞增殖、凋亡的影響可能與ALC1 的低表達(dá)有關(guān)。為驗(yàn)證這一猜想，進(jìn)一步檢測發(fā)現(xiàn)，采用RNAi 技術(shù)敲減ALC1 表達(dá)后，SW480 細(xì)胞增殖抑制率和凋亡率均明顯升高，而過表達(dá)ALC1 后氧雜蒽酮對SW480 細(xì)胞的增殖抑制和凋亡促進(jìn)作用均有所減弱。氧雜蒽酮通過抑制Bcl-2 表達(dá)并上調(diào)BAX 表達(dá)而調(diào)控SW480 細(xì)胞凋亡，且氧雜蒽酮處理會使ALC1 表達(dá)下降，敲減ALC1 也能促進(jìn)細(xì)胞凋亡，提示氧雜蒽酮可能通過抑制ALC1、Bcl-2 表達(dá)，上調(diào)BAX 表達(dá)進(jìn)而影響SW480 細(xì)胞的增殖和凋亡。

綜上所述，氧雜蒽酮可有效抑制SW480 人結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)凋亡，這一結(jié)果可能是通過抑制ALC1 表達(dá)完成，有望為結(jié)直腸癌的預(yù)防及治療提供新思路。