直立型扁蓿豆幼苗對(duì)不同鹽脅迫的生理生化響應(yīng)

谷 蕊，蘇德畢力格，石鳳翎，*，王桂花，楊 蕾，劉 揚(yáng)

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)草原與資源環(huán)境學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018；2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010019)

近年來(lái)內(nèi)蒙古地區(qū)土地呈鹽堿化趨勢(shì)嚴(yán)重，適宜種植的耐鹽性品種缺乏[1]。直立型扁蓿豆[Medicagoruthenicus(L.) Sojak cv.Zhilixing]為從野生扁蓿豆種質(zhì)材料中選育出的新品種[2～3]，具有一定的耐鹽性，是改良同屬牧草抗逆性的優(yōu)質(zhì)基因資源[4]。國(guó)內(nèi)外研究學(xué)者對(duì)扁蓿豆的遺傳多樣性和抗逆方面都進(jìn)行了大量研究[5～8]，但對(duì)扁蓿豆耐鹽性研究主要集中在不同品種、不同來(lái)源的扁蓿豆之間的耐鹽性比較和單鹽對(duì)扁蓿豆種子萌發(fā)、苗期的影響[9～11]方面，而對(duì)扁蓿豆在不同鹽類型尤其是復(fù)鹽的脅迫響應(yīng)研究較少。鹽堿化土壤中的鹽堿離子并非單一離子，而是多種離子共存或互作影響著植物的生長(zhǎng)，地區(qū)間存在差異[1]。內(nèi)蒙西部鹽堿土土壤鹽分以硫酸鹽和氯化物為主[12]，而東部地區(qū)鹽堿土鹽分主要為碳酸鈉和碳酸氫鈉[13]，利用單鹽脅迫植物響應(yīng)的結(jié)果并不能全面反映其耐鹽性及對(duì)各類鹽堿土的適應(yīng)能力。因此，通過(guò)不同鹽離子脅迫探討直立型扁蓿豆對(duì)復(fù)鹽脅迫的耐受程度，研究不同鹽脅迫環(huán)境中直立型扁蓿豆幼苗的生長(zhǎng)及生理變化規(guī)律，明確其半致死的復(fù)鹽濃度，可為直立型扁蓿豆在內(nèi)蒙古鹽堿地上的種植和推廣應(yīng)用提供理論依據(jù)，具有重要的意義。

1 材料與方法

試驗(yàn)在內(nèi)蒙古呼和浩特市內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)溫室進(jìn)行。直立型扁蓿豆種子為2017年收獲的種子，采用花卉營(yíng)養(yǎng)土盆栽法，待其幼苗生長(zhǎng)至4～6葉期時(shí)進(jìn)行鹽脅迫。

1.1 鹽脅迫處理

試驗(yàn)脅迫用鹽為NaCl、Na2SO4、Na2CO3、NaHCO3，設(shè)NaCl單鹽(N1)、NaCl+Na2SO4(1∶1)復(fù)鹽(N2)、Na2CO3+NaHCO3(1∶1)復(fù)鹽處理(N3)和對(duì)照(CK)共4個(gè)處理。先通過(guò)50～250mmol/L的NaCl溶液做預(yù)處理，根據(jù)半致死濃度，在其前后設(shè)置各類鹽處理的濃度梯度(±50mmol/l)，以中性水為對(duì)照。處理后14d取相同部位葉片進(jìn)行幼苗生長(zhǎng)高度及生理指標(biāo)的測(cè)定，每處理三次重復(fù)。

1.2 生理指標(biāo)的測(cè)定

取不同處理幼苗同一生長(zhǎng)部位完全展開(kāi)的葉片(各指標(biāo)稱取0.2g)放入冰盒保存，進(jìn)行生理指標(biāo)的測(cè)定：丙二醛(MDA)采用硫代巴比妥酸法測(cè)定；脯氨酸選用酸性茚三酮法測(cè)定；超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化物酶(POD)的測(cè)定按照趙世杰等(2016)的方法進(jìn)行[14]。

2 數(shù)據(jù)處理

利用Excel 2010和SPSS 20.0軟件進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)與分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 不同濃度NaCl脅迫下的幼苗成活率

由表1可知，直立型扁蓿豆受NaCl單鹽脅迫后，在100mmol/L下幼苗成活率均達(dá)到100%，但隨著鹽濃度繼續(xù)升高幼苗成活率逐漸下降，200mmol/L時(shí)幼苗的成活率降至56%(接近半致死)，當(dāng)鹽濃度達(dá)到250mmol/L時(shí)幼苗全部死亡。

表1 不同濃度NaCl溶液(mmol/L)脅迫下直立型扁蓿豆幼苗的成活率(%)

3.2 不同鹽脅迫對(duì)幼苗生長(zhǎng)的影響

3.2.1不同鹽處理對(duì)幼苗生長(zhǎng)速率的影響

試驗(yàn)表明，直立型扁蓿豆幼苗的生長(zhǎng)在三種鹽脅迫下均受到抑制(圖1)，其中N3的生長(zhǎng)最為緩慢，顯著(P<0.05)低于其余兩種處理。當(dāng)鹽濃度升高到150mmol/L時(shí)，N1脅迫的幼苗生長(zhǎng)速率顯著高于其余兩種處理；在鹽濃度為200mmol/L時(shí)，三種鹽脅迫均對(duì)直立型扁蓿豆幼苗生長(zhǎng)產(chǎn)生嚴(yán)重的抑制作用，植株生長(zhǎng)速率均在0.29cm/d以下，且三種鹽脅迫間無(wú)顯著差異。

3.2.2葉綠素含量對(duì)不同鹽處理的響應(yīng)

如圖2所示，直立型扁蓿豆幼苗在三種鹽脅迫下葉綠素含量的變化規(guī)律不一致，但葉綠素含量均低于CK。在N1脅迫后葉綠素含量隨著鹽濃度的增加呈現(xiàn)先升高后降低，且各濃度間葉綠素含量存在顯著差異；而在N2和N3脅迫時(shí)是隨著鹽濃度的升高呈降低趨勢(shì)，N2脅迫只在200mmol/L時(shí)與其他兩種濃度有顯著差異，N3脅迫中各濃度間未見(jiàn)顯著差異。比較三種類型的鹽對(duì)直立型扁蓿豆幼苗脅迫后葉綠素含量的影響發(fā)現(xiàn)，三種鹽在同一濃度下葉綠素含量均無(wú)顯著差異。由此說(shuō)明，三種鹽脅迫對(duì)葉綠素含量的影響不存在差異。

3.3 不同鹽處理對(duì)幼苗生理生化指標(biāo)的影響

3.3.1不同鹽處理下丙二醛含量的變化

如圖3所示，直立型扁蓿豆幼苗葉片丙二醛(MDA)含量在三種鹽脅迫下變化規(guī)律一致，均隨鹽濃度的增加而升高，且高于CK。在三種鹽脅迫下，當(dāng)鹽濃度為100mmol/L和150mmol/L時(shí)，各脅迫葉片內(nèi)MDA含量增加未見(jiàn)顯著差異，說(shuō)明在這兩種濃度下細(xì)胞膜系統(tǒng)受到的損傷不明顯；鹽濃度達(dá)到200mmol/L時(shí)，葉片內(nèi)MDA含量明顯升高，N2顯著高于其他兩種脅迫(P<0.05)，說(shuō)明在N2脅迫下直立型扁蓿豆幼苗細(xì)胞膜系統(tǒng)的損傷最嚴(yán)重，植株對(duì)自身的保護(hù)性也最為明顯。

3.3.2游離脯氨酸含量對(duì)不同鹽處理的響應(yīng)

在三種鹽脅迫下，植物葉片游離脯氨酸含量均隨鹽濃度的增加而升高，均高于CK(如圖4)。在N1脅迫下，隨著鹽濃度的增加游離脯氨酸含量顯著增加。當(dāng)鹽濃度為100mmol/L時(shí)，各脅迫葉片內(nèi)游離脯氨酸含量增加較小，說(shuō)明此濃度下植物細(xì)胞液泡中的平衡還未被該濃度中的鹽分打破，未有顯著差異(P>0.05)；鹽濃度達(dá)到200mmol/L時(shí)，葉片內(nèi)游離脯氨酸含量升高明顯，N1顯著高于其他兩種脅迫(P<0.05)，說(shuō)明單鹽脅迫下直立型扁蓿豆幼苗中細(xì)胞平衡被高濃度的鹽分破壞，植株自身為避免細(xì)胞質(zhì)脫水積累了大量游離脯氨酸來(lái)進(jìn)行細(xì)胞滲透調(diào)節(jié)。

3.3.3超氧化物歧化酶活性對(duì)不同鹽處理的響應(yīng)

在三種鹽脅迫下，直立型扁蓿豆葉片中的超氧化物歧化酶(SOD)酶活性隨著鹽濃度增加變化不明顯(圖5)。同種濃度下SOD酶活性進(jìn)行比較，N1和N2高于CK，N3低于CK。當(dāng)鹽濃度為100mmol/L時(shí)，各脅迫葉片內(nèi)SOD酶活性較小，各處理間未有顯著(P>0.05)差異；當(dāng)鹽濃度在150mmol/L時(shí)，N2的SOD酶活性要顯著高于N1和N3(P<0.05)，N1和N3間有顯著(P<0.05)差異；當(dāng)鹽濃度達(dá)到200mmol/L時(shí)，N1高于其他兩種脅迫，各脅迫間未見(jiàn)顯著差異(P>0.05)。

3.3.4過(guò)氧化物酶活性對(duì)不同鹽處理的響應(yīng)

在三種鹽脅迫下，植物葉片的過(guò)氧化物酶(POD)活性均高于CK，并隨鹽濃度的增加而降低(圖6)。在N1脅迫時(shí)，各濃度未見(jiàn)顯著差異；在N2脅迫下，當(dāng)鹽濃度升高到150mmol/L時(shí)POD酶活性開(kāi)始顯著下降；在N3脅迫下，當(dāng)鹽濃度升高到200mmol/L時(shí)POD酶活性才顯著降低。當(dāng)鹽濃度為100mmol/L和150mmol/L時(shí)，N3葉片內(nèi)POD酶活性顯著(P<0.05)高于其他兩種鹽處理，這表明直立型扁蓿豆幼苗在N3脅迫下產(chǎn)生POD酶來(lái)清除細(xì)胞內(nèi)的H2O2，以抵抗鹽脅迫帶來(lái)的傷害，但可能是已經(jīng)超過(guò)植物耐鹽的濃度，所以POD酶活性呈下降趨勢(shì)；當(dāng)鹽濃度達(dá)到200mmol/L時(shí)，葉片內(nèi)POD酶活性下降顯著，N2顯著(P<0.05)低于其他兩種處理。

3.4 鹽濃度和鹽種類對(duì)幼苗影響作用的比較

通過(guò)對(duì)不同鹽及其濃度進(jìn)行雙因素方差分析(表2)發(fā)現(xiàn)，鹽濃度、鹽種類及兩者的互作均對(duì)生長(zhǎng)速率、游離脯氨酸、POD這些生長(zhǎng)和生理指標(biāo)具有極顯著的影響，而葉綠素含量對(duì)不同鹽及濃度的互作、MDA和SOD受鹽濃度和鹽種類的影響均不明顯。MDA受鹽濃度和鹽種類的響應(yīng)不明顯，可能與鹽脅迫逆境對(duì)直立型扁蓿豆幼苗細(xì)胞膜透性影響不大有關(guān)；SOD酶活性未見(jiàn)顯著差異，這可能是直立型扁蓿豆本身將O2-轉(zhuǎn)化為水的機(jī)制與其他植物的不同，也可能是鹽濃度未達(dá)到相應(yīng)的極限，導(dǎo)致其受鹽濃度和鹽種類的影響不顯著。

表2 直立型扁蓿豆幼苗鹽脅迫中不同鹽及濃度的雙因素方差分析

4 討論

4.1 直立型扁蓿豆對(duì)鹽溶液的耐受性

近年來(lái)，有許多學(xué)者對(duì)扁蓿豆的耐鹽性進(jìn)行了測(cè)定。鐘華等[15]對(duì)扁蓿豆鹽脅迫的研究表明，扁蓿豆所能承受的NaCl和Na2CO3的濃度不宜超過(guò)400mmol/L；姚佳[11]在對(duì)扁蓿豆耐鹽性的測(cè)定中發(fā)現(xiàn)，在NaCl濃度300mmol/L時(shí)扁蓿豆的生長(zhǎng)已經(jīng)受到了嚴(yán)重的影響；潘濤濤[16]對(duì)12份扁蓿豆幼苗材料的耐鹽性進(jìn)行的比較表明，在NaCl濃度300mmol/L時(shí)所測(cè)指標(biāo)中受到的抑制程度最大；Guan等[10]對(duì)直立型扁蓿豆的種子在鹽脅迫下的發(fā)芽情況進(jìn)行了研究，表明在NaCl濃度為250mmol/L時(shí)種子的發(fā)芽率低于20%，在鹽濃度為200mmol/L時(shí)種子發(fā)芽率低于40%。以上研究結(jié)果表明，扁蓿豆均在鹽脅迫濃度為200～400mmol/L時(shí)受到影響，但未明確表明扁蓿豆的鹽耐受能力。本試驗(yàn)在對(duì)直立型扁蓿豆的耐鹽濃度的選擇中，以其經(jīng)過(guò)NaCl單鹽脅迫后幼苗成活率為依據(jù)，結(jié)果表明鹽濃度在200mmol/L時(shí)直立型扁蓿豆生長(zhǎng)受到抑制，為其半致死濃度；在鹽脅迫濃度為250mmol/L時(shí)，幼苗完全死亡。根據(jù)前人單鹽脅迫結(jié)果也可粗略判斷，直立型扁蓿豆較野生扁蓿豆材料的耐鹽性弱。

4.2 鹽離子對(duì)直立型扁蓿豆幼苗生長(zhǎng)形態(tài)的影響

生長(zhǎng)抑制是植物本身受鹽脅迫影響最敏感的表現(xiàn)。植物生長(zhǎng)在鹽堿性環(huán)境中，鹽離子對(duì)植株形態(tài)發(fā)育產(chǎn)生顯著的影響，抑制植物的生長(zhǎng)[17]。植物在經(jīng)過(guò)鹽脅迫后，鹽分會(huì)對(duì)植株造成不同程度的傷害，在陽(yáng)離子中，鈉鹽的毒害作用大于鈣鹽；陰離子中，CO32-的毒性大于Cl-和SO42-[18]。同時(shí)，植物進(jìn)行離子吸收時(shí)，植物細(xì)胞內(nèi)會(huì)有維持細(xì)胞內(nèi)離子動(dòng)態(tài)平衡，額外的鹽分會(huì)干擾植物體內(nèi)的離子動(dòng)態(tài)平衡，對(duì)植株造成毒害，嚴(yán)重影響植物的正常生長(zhǎng)[19～20]。本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)三種不同單鹽和復(fù)鹽對(duì)直立型扁蓿豆幼苗的脅迫影響進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)Na2CO3和NaHCO3復(fù)鹽對(duì)直立型扁蓿豆的生長(zhǎng)抑制程度最大，可能是直立型扁蓿豆幼苗受CO32-和HCO3-離子的影響要大于其他兩種鹽中Cl-和SO42-,這與鐘華[15]在扁蓿豆耐鹽性研究中有關(guān)扁蓿豆受Na2CO3影響顯著的結(jié)果一致。

葉綠素作為光合作用的主要成分，其含量的多少會(huì)直接影響植物的生長(zhǎng)情況，可以作為衡量植物抗逆性的一個(gè)重要指標(biāo)[21]。有研究表明，鹽脅迫會(huì)使葉片內(nèi)光合色素發(fā)生降解，導(dǎo)致葉綠素?cái)?shù)量減少，造成光合反應(yīng)過(guò)程受阻，進(jìn)而通過(guò)影響植物光合作用來(lái)限制植株的生長(zhǎng)[22～23]。目前，關(guān)于鹽脅迫對(duì)植物葉綠素含量的影響還存在異議，有研究結(jié)果表明葉綠素含量會(huì)隨著鹽脅迫濃度的增加而降低[24,26]，而另一些研究發(fā)現(xiàn)葉綠素含量隨著鹽脅迫濃度的增加先增大后減小[23，25]，有的研究還認(rèn)為葉綠素含量會(huì)隨著鹽脅迫濃度的增加逐漸升高[26，28]。本研究結(jié)果顯示，在NaCl脅迫時(shí)葉綠素含量隨著鹽脅迫濃度的增加呈先升高后降低的趨勢(shì)，這可能是葉綠素的合成需要脯氨酸，而在鹽脅迫下細(xì)胞中大量積累脯氨酸就有利于葉綠素的合成[20]，本研究中NaCl脅迫時(shí)積累的脯氨酸均高于其他兩種鹽脅迫，因此葉綠素含量隨著鹽脅迫濃度的增加先升高后降低。在NaCl、Na2SO4復(fù)鹽和Na2CO3、NaHCO3復(fù)鹽脅迫下，葉綠素含量隨著鹽脅迫濃度的增加呈降低的趨勢(shì)，可能與鹽脅迫影響光合反應(yīng)過(guò)程中相關(guān)酶類的含量或活性有關(guān)[29～30]，這與杜軍華等鹽脅迫對(duì)蠶豆中葉綠素的研究有相似的結(jié)論[29]。

4.3 鹽離子對(duì)直立型扁蓿豆幼苗細(xì)胞膜滲透物及酶活性的影響

為避免或減少植物體遭受傷害，植物體內(nèi)存在抗氧化的過(guò)氧化酶系統(tǒng)，主要包括SOD、POD、CAT(過(guò)氧化氫酶)等[33]。POD為植物體內(nèi)重要的抗氧化酶，在逆境中可有效地清除活性氧，防御活性氧或其他過(guò)氧化自由基對(duì)細(xì)胞膜系統(tǒng)的傷害，以減輕逆境脅迫對(duì)植物的傷害[34]。在一定的范圍內(nèi)，隨著鹽濃度的增加POD酶活性呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。本試驗(yàn)中，直立型扁蓿豆在Na2CO3和NaHCO3脅迫下的變化要較其他兩種鹽影響較大，可能是在植物受到Na2CO3和NaHCO3鹽脅迫時(shí)通過(guò)積累脯氨酸來(lái)防止蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)受到破壞以及穩(wěn)定酶結(jié)構(gòu)與活性的功能[35]，可以保證葉片具有較高的POD，這與直立型扁蓿豆在100mmol/L和150mmol/LNa2CO3和NaHCO3鹽濃度下的POD含量顯著高于其他兩種鹽的結(jié)果一致。但POD的活性是呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，說(shuō)明其抗氧化能力逐漸衰退，這與武德在堿式鹽脅迫絨毛白蠟保護(hù)酶系統(tǒng)的影響中含有Na2CO3和NaHCO3的堿式復(fù)鹽影響POD的結(jié)果基本一致[36]。隨著脅迫濃度增加到200mmol/L，POD含量繼續(xù)減少，且與其他兩種濃度有顯著的差異，說(shuō)明在Na2CO3和NaHCO3鹽脅迫后CO32-和HCO3-積累所帶來(lái)的毒害作用要大于其他兩種鹽脅迫，導(dǎo)致直立型扁蓿豆幼苗的抗氧化系統(tǒng)受損嚴(yán)重。

5 結(jié)論

5.1直立型扁蓿豆在NaCl脅迫時(shí)，其半致死濃度為200mmol/L；在三種鹽脅迫時(shí)生長(zhǎng)均受到抑制，其中Na2CO3+NaHCO3復(fù)鹽脅迫時(shí)受到的抑制程度大于NaCl、NaCl+Na2SO4處理。