基于高通量測序技術(shù)分析3種羊肉混合基因組序列的短片段重復序列

耿 多 羅瑞明* 王麗娟 高 爽 宋亞倩

（1 寧夏大學農(nóng)學院 銀川750021 2 寧夏醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院 銀川750021）

我國是世界第一大羊肉生產(chǎn)和消費國，近年來，羊肉市場需求一直處于增長狀態(tài)[1]，羊肉產(chǎn)業(yè)早已發(fā)展成為高效農(nóng)業(yè)重要組成部分[2-4]。研究易混淆綿羊種質(zhì)的遺傳多樣性與親緣關(guān)系，對于促進綿羊種質(zhì)的利用、綿羊產(chǎn)業(yè)的發(fā)展和維護消費者權(quán)益具有重要意義。灘羊是我國寧夏優(yōu)勢特色畜種，是一種極其珍貴的動物資源，屬國家重點保護羊種。本研究通過對寧夏鹽池縣、同心縣、中寧縣、西吉縣、賀蘭縣、銀川市等6 處灘羊市場調(diào)查，發(fā)現(xiàn)部分經(jīng)銷商自寧夏采購小尾寒羊和灘寒雜交羊肉冒充灘羊肉在我國其它地區(qū)售賣。灘羊、小尾寒羊和灘寒雜交羊在活體時，可通過形態(tài)學分類方法進行區(qū)分鑒別，然而屠宰后的分割肉形態(tài)特征相似，常規(guī)形態(tài)學方法難以區(qū)分，嚴重影響了消費者權(quán)益和灘羊產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)健康發(fā)展，是目前寧夏灘羊產(chǎn)業(yè)品牌建立與發(fā)展急需解決的關(guān)鍵問題。

灘羊、小尾寒羊和灘寒雜交羊的親緣關(guān)系非常接近，屬同屬亞種范疇[5]，通過對差異基因序列的研究，可實現(xiàn)對3種綿羊綜合種質(zhì)資源挖掘與物種甄別。微衛(wèi)星DNA（Microsatellite，也稱簡單重復序列Simple sequence repeat/SSR）是通過共顯性分子標記方法標記一段具有多態(tài)性DNA 功能域（通常為1～6 bp）的短片段，能夠?qū)τ诜N質(zhì)資源進行挖掘并甄別不同品種畜肉[6]。目前，SSR 技術(shù)方法已被應用于種質(zhì)遺傳多樣性分析[7-8]、親權(quán)分析[9-10]、遺傳圖譜構(gòu)建[11-12]和群體遺傳學研究[13-14]，而采用SSR 技術(shù)方法對不同品種綿羊混合樣品進行DNA 分子鑒定，尚未見報道。

本研究采用高通量測序技術(shù)對灘羊、小尾寒羊和灘寒雜交羊的基因組進行高通量測序，確定3 個綿羊品種混合的全基因序列并開發(fā)SSR 分子標記，圍繞混合綿羊樣品種質(zhì)SSR 分布特征、遺傳多樣性和分子標記展開研究，為挖掘綿羊種質(zhì)資源與灘羊、小尾寒羊和灘寒雜交羊的基原鑒定提供新的理論，為進一步應用于生產(chǎn)實踐奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試羊肉樣品來自灘羊繁育中心（鹽池）。采用典型集群的簡單隨機抽樣方法在寧夏鹽池產(chǎn)地采樣，采樣時注意避免采集雜交群體及外源性污染。其中灘羊108 只、小尾寒羊106 只、灘寒雜交羊106 只，分別取其不同部位肌肉組織。將320 只綿羊樣本各取25 g 樣品混合均勻，形成1 份混合樣本。對混合樣本提取的DNA 測序分析；分別提取灘羊、小尾寒羊和灘寒雜交羊的DNA 為標準樣品。

1.2 儀器與設備

臺式高速低溫離心機（Thermo Scientific Sorvall Legend Micro 21R），美國Thermo 公司；熒光計核酸定量儀（QubitR2.0），美國Life Technologies公司；3730XL 測序列分析儀，美國ABI 公司。

1.3 方法

1.3.1 混合樣品DNA 提取 采用動物基因組DNA 快速抽提試劑盒（上海生工）完成DNA 提取，具體方法詳見該試劑盒說明書。

1.3.2 DNA 測序文庫構(gòu)建 使用Covaris 儀器將3種綿羊混合樣品的DNA 片段化。使最后打斷的DNA 片段大小集中在300～500 bp 范圍內(nèi)。DNA片段末端修復（末端補平和3' 端加A 尾），連接接頭后采用磁珠分選純化連接產(chǎn)物，將對純化后的接頭連接產(chǎn)物進行PCR 擴增富集，檢測文庫質(zhì)量。

1.3.3 SSR 位點檢索及可視化分析 在獲取拼接基因組序列后，使用MISA 對序列中的SSR 進行檢測，參數(shù)設置：SSR 最小間距為200 bp，SSR 選取標準為單核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸重復序列個數(shù)最小分別為10，6，5，5，5 和5。使用FastQC 對SSR 位點分析結(jié)果進行可視化；使用BLAST+對通過質(zhì)控的數(shù)據(jù)進行污染檢測；使用MISA 檢測拼接基因組中的SSR 序列。

1.3.4 SSR 位點多態(tài)性檢測 使用Primer3 對開發(fā)SSR 位點的DNA 序列設計熒光標記引物，進行多態(tài)性檢測。PCR 反應體系為：Taq Plus Master Mix 25 μL，體系中加入熒光標記引物，上下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL，DNA 模板1 μL，dNTP 10 mmol/L 0.5 μL，25 mmol/L MgCl22.0 μL，Taq酶（5 U/μL），0.2 μL，ddH2O 添加17.8 μL。PCR 反應條件為：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性30 s，60℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共30 個循環(huán)；72 ℃延伸7 min。反應結(jié)束后，觀察PCR 產(chǎn)物經(jīng)過1%瓊脂糖凝膠，150 V，100 mA，20 min 檢測的電泳圖像多態(tài)性。SSR 位點的多態(tài)信息含量PIC（Polymorphism information content）根據(jù)式（1）計算：

式中：Pi——第i 個等位位點出現(xiàn)的基因頻率[8，15]。

1.3.5 PCR 擴增產(chǎn)物聚類分析 分別提取灘羊、小尾寒羊、灘寒雜交羊和以上3種綿羊混合后的樣本各6 個，共計24 個樣本組織DNA，進行凝膠電泳檢測，依據(jù)SSR 標記擴增產(chǎn)物在電泳凝膠電泳圖像上的相對位置，構(gòu)建“0/1”二元矩陣，建立原始數(shù)據(jù)陣后利用GENE 軟件進行遺傳相似系數(shù)和遺傳距離計算，選用最遠鄰元素聚類分析法構(gòu)建unrooted 系統(tǒng)進化樹。

1.3.6 STR 矩陣散點分析 采用46 對SSR 熒光引物分別對灘羊、小尾寒羊和灘寒雜交羊肉提取的基因組DNA 進行擴增，隨后，進行毛細管電泳檢測STR 分型。分別將3種綿羊的46 對引物峰值整合，將3種綿羊的純合與雜合位點峰值分別進行矩陣分析，置信區(qū)間95%。

1.3.7 SSR 分子圖譜構(gòu)建 根據(jù)矩陣圖譜位點差異，將46 對引物在灘羊、小尾寒羊和灘寒雜交羊品種中檢測的指紋圖譜信息，即基因位點按片段大?。磾U增到的帶型信息）升序排列、依次編號，將帶型編號依次串聯(lián)，即得到由多位數(shù)字構(gòu)成的SSR 分子身份證，利用SSR 分子身份證生成分子二維碼信息。

2 結(jié)果與分析

2.1 全基因組測序結(jié)果

對3種綿羊肉品混合樣本進行宏基因組物種多樣性分析，如表1 獲得6.1 GB 有效序列，42 211 072 條序列，該結(jié)果與單一品種綿羊測序結(jié)果5.0 GB 相比較大，表明該測序結(jié)果涵蓋灘羊、小尾寒羊、灘寒雜交羊的部分基因。該測序結(jié)果中序列長度平均長度150 bp，GC 含量45.67%。使用Blast+，隨機從通過QC（Quality control，即質(zhì)量控制/質(zhì)控）的2 147 483 條有效序列中抽取1 000 條序列進行BLAST 比對，比對數(shù)據(jù)庫為NCBI NT 數(shù)據(jù)庫，取evalue≤1×10-1并且相似度>90%，coverage>80%的比對結(jié)果，計算其物種分布。劃分為45 個類別，典型類別如圖1所示。根據(jù)種屬劃分和分類地位鑒定結(jié)果，可以獲得樣本在各分類水平的具體組成。使用NCBI 選取的綿羊?qū)賱游锏男蛄信c樣本中所有序列進行對比分析發(fā)現(xiàn)，1000 條序列并非可以與NCBI 數(shù)據(jù)庫中序列一一對應，只有部分可以歸屬到對應種屬中，其中有118 條序列為綿羊?qū)傩蛄校ù蠼茄?、白大角羊、西藏盤羊、盤羊、小尾寒羊等。綿羊?qū)傩蛄姓加行蛄锌偤繑?shù)目遠大于微生物序列，可以看出綿羊?qū)賱游锲骄S度最大，屬于優(yōu)勢類群，而其它源性遺傳物質(zhì)未被發(fā)現(xiàn)大面積存在。

表1 測序結(jié)果信息Table 1 Results of sequence information

圖1 物種分布圖Fig.1 Distribution of species

2.2 SSR 信息分布及可視化結(jié)果

使用MISA 檢測序列中的SSR 位點，F(xiàn)ast QC可視化SSR 位點分析結(jié)果。共計78 122 個有效SSR 位點序列，長度為150～3 628 bp 不等，其中單核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸和復合SSR 重復序列個數(shù)分別為18 260（占23.37%），13 735（占17.58%），11 429（占14.63%），1 462（占1.87%），2 504（占3.21%），76（占9.73×10-4%）和30 656（占39.24%）。由圖2氣泡圖和箱線圖可以清晰看出SSR 的數(shù)目、分布和分布密度情況。發(fā)現(xiàn)c 和c*類型，即復合SSR，占比及分布明顯高于其它核苷酸重復類型。

分析基因組中存在的30 656種復合重復基元。復合SSR 具有更大的SSR 長度，而單位長度越大的SSR 有更大的總體長度的可能性越大。發(fā)現(xiàn)復合重復基元種類豐富，要遠遠高于非復合SSR，而且核苷酸重復基元組合差異明顯，包含（AAA）6（AA）9*（A）18*，（AGCAGC）7（AGC）14*，（T）10（TTG）5*，（TGTG）8（TG）17*（TGTGTG）5*tgt（GAGA）7（GAGAGA）5*（AG）14*等，其中核苷酸重復基元數(shù)目比值3/2/1、2/1 和1/3 模式較多，占復合重復類型的87.35%。

2.3 引物多態(tài)性檢測結(jié)果

通過多態(tài)性檢測，78 122 條有效序列均設計出SSR 引物，隨機挑選上述78 122 條序列中設計出的SSR 引物100 對（挑選標準：有效序列大小范圍100～300 bp，末端可修飾），有46 對熒光標記引物（表2）在挑選的100 對熒光引物中表現(xiàn)出多態(tài)性，有46 對熒光標記引物（表2）在挑選的100 對熒光引物中表現(xiàn)出多態(tài)性，46 對熒光標記引物共擴增出115 條等位基因條帶，每對引物平均擴增出2.5 條，得到PIC 值范圍為0.004～0.679，平均值為0.358。其中標記名稱為6854322_432 的熒光引物PIC 值最高，為0.679。表明挑選出的46 對熒光引物擴增產(chǎn)物的多態(tài)率處于中等水平且穩(wěn)定，適合多態(tài)分析，可作為區(qū)分灘羊、小尾寒羊和灘寒雜交羊品種差異的引物。

圖2 SSR 信息分布圖Fig2 Distribution of SSR information

表2 46 對熒光標記引物Table 2 46 pairs of fluorescent labeled primers

（續(xù)表2）

圖3 PIC 值分布圖Fig.3 Distribution of PIC

2.4 擴增產(chǎn)物的聚類分析結(jié)果

由軟件MEGA5.1 進行聚類分析，得到24 個樣本的系統(tǒng)進化圖（圖4）。分析表明，依據(jù)SSR 擴增產(chǎn)物性狀構(gòu)建的聚類分析圖，24 個綿羊資源（24 個樣品）被分為4類，S11，S9，S7，S12，S8，S10等6 份羊肉樣本構(gòu)成第1類，其余的18 份被聚為第2類。在遺傳距離0.53 處，分為第2 大類和第3 大類分別包括S13，S15，S17，S18，S16，S14等在內(nèi)的6份資源和包括S19，S21，S23，S22，S20，S24，S5，S1，S3，S6，S2，S4等在內(nèi)的12 份資源。在遺傳距離0.23 處，第3 大類又分為2 小類，分別包 括S19，S21，S23，S22，S20，S24等6份資源和S5，S1，S3，S6，S2，S4等6 份資源。這與24 份綿羊樣本在供試前前做好的標記相一致。其中S1～6 為灘羊肉樣本，S7～12 為小尾寒羊肉樣本，S13～18 為灘寒雜交羊肉樣本，S19～24 為3種綿羊混合的肉樣本。這表明綿羊?qū)?種羊肉以及3種綿羊?qū)倩旌涎蛉鈽颖痉謩e聚為一類，聚成4 個集群，呈單系性。因此，4 份樣本分別歸為4 個不同的集群。研究發(fā)現(xiàn)3種綿羊混合樣本與小尾寒羊的遺傳距離較近，與灘羊、灘寒雜交羊樣本的遺傳距離較遠，但不影響混合樣本與小尾寒羊的區(qū)分。灘羊、小尾寒羊、灘寒雜交羊和3種綿羊混合樣本在SSR 序列遺傳關(guān)系具有較大差異，表明46 對SSR 引物可以完全區(qū)分3種綿羊品種。

圖4 3種綿羊遺傳距離Fig.4 Genetic distance of 3 of breeds sheep

2.5 STR-SSR 片段多態(tài)性對于綿羊群體的甄別結(jié)果

利用46 對SSR 引物對灘羊、小尾寒羊和灘寒雜交羊肉提取的基因組DNA 進行擴增，并進行毛細管電泳檢測。按表2 中46 對熒光引物順序，分別將3種綿羊的46 對引物峰值整合，建立灘羊、小尾寒羊和灘寒雜交羊品種SSR 散點矩陣圖譜，如圖5所示。圖5 中橫向與縱向序號T1T2，H1H2，Z12 表示參試的灘羊、小尾寒羊和灘寒雜交羊的純合與雜合基因位點（置信區(qū)間95%），曲線圈出部分表明二者比較后，能夠辨別二者的基因位點?？v向比較發(fā)現(xiàn)，46 對引物檢測到的等位基因可作為參試樣品的特異性位點。該部分均與表3 中的指紋數(shù)據(jù)及分子身份證相對應。

2.5.1 灘羊的甄別 比對T1 行H1 列、T1 行Z1列矩陣結(jié)果，T1 與H1、Z1 比較中顯示灘羊與小尾寒羊、灘寒雜交羊的標志性基因位點差異顯著，曲線圈出標注范圍大，在43 個大小不同片段上檢測到二者的差異位點。比對T2 與H2、Z2 雜合基因位點，發(fā)現(xiàn)在178，198，201，278 和115 bp 上的等位基因位點上的差別顯著，可用于區(qū)分灘羊與其它二者。這表明在比較灘羊與小尾寒羊時，可以通過標志性基因位點與等位基因位點將灘羊與小尾寒羊品種區(qū)分開來。

2.5.2 小尾寒羊的甄別 比對H1 行、T1 列、H1行Z1 列矩陣結(jié)果，其中T1 與H1、Z1 比較中，顯示小尾寒羊與灘羊、灘寒雜交羊標志性基因位點差異顯著，在38 個大小不同片段上檢測到二者的差異位點。比對H2 與T2、Z2 雜合基因位點，發(fā)現(xiàn)在115，120，137，208 bp 上的等位基因位點上的差別顯著，可用于顯著性區(qū)分二者的分子標記，同時采取其它基因位點輔助標記，可準確將小尾寒羊與灘羊、灘寒雜交羊區(qū)分開來。

2.5.3 灘寒雜交羊的甄別 其中Z1 行T1 列中，Z1 與H1 比較中顯示，灘寒雜交羊與灘羊、灘寒雜交羊與小尾寒羊的標志性基因位點差異顯著，在26 個大小不同片段上檢測到二者的差異位點。比對T2 與H2 雜合基因位點，發(fā)現(xiàn)在162，109，206，120 和113 bp 上的等位基因位點上的差別顯著，可用于區(qū)分二者。這表明在比較灘羊與小尾寒羊時，可以通過標志性基因位點與等位基因位點將灘羊與小尾寒羊品種區(qū)分開來。

縱觀圖5 中的灘羊、小尾寒羊和灘寒雜交羊的所有兩兩比較基因位點結(jié)果，均具有可區(qū)分灘羊、小尾寒羊和灘寒雜交羊的標志性基因位點。綜上，通過該散點矩陣圖分析可知，46 對SSR 引物對灘羊、小尾寒羊和灘寒雜交羊的甄別能力較強，根據(jù)矩陣圖譜呈現(xiàn)出的SSR 片段多態(tài)性，可快速在核酸序列差異性方面實現(xiàn)綿羊品種的區(qū)分鑒定。

圖5 3種綿羊矩陣散點圖Fig.5 Matrices scatter diagram of three kinds of breeds sheep

2.5.4 3種綿羊SSR 分子身份證的構(gòu)建結(jié)果 根據(jù)矩陣圖譜位點差異，按表2 中46 對熒光引物順序，將46 對引物在灘羊、小尾寒羊和灘寒雜交羊品種中檢測的指紋圖譜信息，即基因位點按片段大小（即擴增到的帶型信息）升序排列、依次編號，將帶型編號依次串聯(lián)，即得到由46 位數(shù)字構(gòu)成的SSR 分子身份證[16-17]?；谝陨蠈?種羊肉混合基因組序列的SSR 研究比對分析，本文開發(fā)標記的46 對SSR 位點可以達到對同屬亞種的動物進行鑒別，實現(xiàn)灘羊、小尾寒羊和灘寒雜交羊的甄別。

表3 3種綿羊的SSR 分子身份證Table 3 SSR information molecular identity of 3 of breeds sheep

圖6 3種綿羊的SSR 分子身份證二維碼Fig.6 QR code of SSR information molecular identity of 3 of breeds sheep

3 討論

3.1 混合樣本基因組數(shù)據(jù)庫的建立

綿羊品種多樣，種質(zhì)資源豐富，種質(zhì)差異極大影響肉品品質(zhì)[18-20]。本研究中高通量測序結(jié)果的分析表明，獲得的序列總大小約6 GB，42 211 072 條序列，GC 含量為45.67%。節(jié)肢動物[21]、羊蠅[22]基因組GC 分布范圍為13.28%～39.64%；?？苿游颷23]平均GC 含量為44.27%；魚類[24]GC 含量54.6%；蛭類[25]GC 含量為36.94%。Hamada等[26]也發(fā)現(xiàn)了脊椎動物基因組中GC 含量與不同物種之間具有顯著關(guān)聯(lián)性。所以GC 含量不僅可以反映DNA 雙鏈的穩(wěn)定性，還可以從側(cè)面反映樣本有無污染，可見該混合樣本全基因組文庫質(zhì)量較好。通過Blast+比對NCBI 數(shù)據(jù)庫中該混合樣本序列，根據(jù)種屬劃分和分類地位鑒定結(jié)果，獲得了樣本在各分類水平的具體組成。隨機抽取的1 000 條序列被劃分為了45 個類別，發(fā)現(xiàn)1 000 條序列中只有118 條序列可以歸類到對應種屬中，綿羊?qū)傩蛄姓加行蛄锌偤繑?shù)目遠大于微生物序列，可以看出綿羊?qū)賱游锲骄S度最大，屬于優(yōu)勢類群，而其它源性遺傳物質(zhì)未被發(fā)現(xiàn)大面積存在。但是占比要低于豬（Sus scrofa）、牛（Bos taurus）、牦牛（Bos mutus）、水牛（Bubalus bubalis）、綿羊（Ovis aries）、山羊（Capra hircus）和藏羚羊（Pantholops hodgsonii）等[16-20]。單一物種的微衛(wèi)星數(shù)目，即本樣本的GC 含量區(qū)別于其它物種，又保持穩(wěn)定狀態(tài)。這表明成功建立了3種綿羊混合樣本全基因組序列數(shù)據(jù)庫。

3.2 SSR 序列特征

利用生物信息學方法搜索、統(tǒng)計、分析了混合綿羊樣本全基因組SSR 數(shù)量、分布特征?；旌蠘颖救蚪M中SSR 總數(shù)為78 122，占全基因組序列總數(shù)的0.185%?？梢姡旌蠘颖救蚪M微衛(wèi)星數(shù)目雖然豐富，但是在全基因組中的含量占比要低于單一物種，這表明，混合樣本開發(fā)SSR 位點雖然提升了效率、降低了成本，但是并不能將某個單一物種的全基因組的SSR 位點全部開發(fā)出來，只

能獲取一部分，這可能與物種遺傳距離較近有關(guān)，測序過程中堿基偏好性、組裝偏差等都會導致相似度較高的SSR 序列未被分析[27]，還可能是混合樣本DNA 序列總數(shù)基數(shù)要遠遠大于單一樣本，雖然微衛(wèi)星含量豐富，但仍然占總序列比例較低。對3種混合羊肉基因組中的SSR 信息分析表明，綿羊混合樣本的主要重復類型是復合核苷酸重復，其次為單核苷酸重復。3種綿羊混合樣本全基因組SSR 豐富度分布模式為復合核苷酸SSR（39.24%）>單核苷酸SSR（23.37%）>二核苷酸SSR（17.58%）>三核苷酸SSR（14.63%）>五核苷酸SSR（3.21%）>四核苷酸SSR（1.87%）>六核苷酸SSR（9.73e4%），該結(jié)果與戚文華[23]研究的綿羊全基因組中重復優(yōu)勢類型豐富度分布結(jié)果相同。復合SSR 重復序列占比及分布明顯高于其它核苷酸重復類型，基元數(shù)目比值3/2/1、2/1 和1/3 模式較多，占復合重復類型的87.35%。這表明多態(tài)性有很大可能出現(xiàn)于基元數(shù)目比值為3/2/1、2/1 和1/3的重復序列中。驗證隨機選擇的100 對不同重復單元的SSR 引物，46 對（46%）引物能擴增出預期PCR 產(chǎn)物，說明3種綿羊混合基因組SSR 標記引物擴增效率處于中等水平。引物擴增失敗可能是由于存在大的內(nèi)含子，在啟動位點引起SNPS/In-Del 變異，進而阻礙引物與目標DNA 的結(jié)合，也可能是由組裝錯誤引起[26]，本研究中46 對多態(tài)引物的平均PIC 值為0.34，最低值發(fā)生在SSR位點中重復序列最短序列的 9 對引物6799476401（PIC 值0.004），6799634401（PIC 值0.072），6812030407（PIC 值0.033），6875226447（PIC 值 0.035），6877088449（PIC 值 0.055），6882436454（PIC 值0.041），6883598455（PIC 值0.012），6901326473（PIC 值0.066），6968389708（PIC 值0.023），其余37 對引物表現(xiàn)出相對較高PIC 值。有研究表明，SSR 標記的多態(tài)性與SSR位點中重復序列的長短相關(guān)，重復序列愈長，多態(tài)性的可能性越高[23-28]，當SSR 重復序列≥20 bp時，出現(xiàn)多態(tài)性的比例高；重復序列長度在12～19 bp 范圍出現(xiàn)多態(tài)性的可能性明顯下降，而低于12 bp 的多態(tài)性極低[28-30]。本研究中46 對多態(tài)性引物有9 對來自于重復序列長度< 20 bp，其余37對均來自于≥20 bp 的重復序列。由此可見，在復合SSR 重復序列模式為3/2/1，2/1 和1/3 的復合重復序列上標記開發(fā)SSR，獲得多態(tài)性的可能性更高。

3.3 易混淆綿羊品種的SSR 遺傳多樣性及3種綿羊的區(qū)分

通過聚類分析可以看出灘羊樣本、小尾寒羊樣本、灘寒雜交羊樣本、3種綿羊混合樣本各自聚為一支，聚成4 個集群，呈單系性。灘羊、灘寒雜交羊和3種綿羊混合樣本進一步聚成一支，表明三者親緣關(guān)系更近，這與預設試驗條件相符。結(jié)合SSR 序列多態(tài)性與遺傳距離綜合分析可知，灘羊、小尾寒羊、灘寒雜交羊的種內(nèi)遺傳多樣性水平適中，種群具有較低的種內(nèi)遺傳變異，可能包含一些有價值的特性，深度挖掘混合基因組中潛在的功能性SSR 序列，結(jié)合坐標和功能基因組信息，將有利于種質(zhì)資源的保護。區(qū)分灘羊與灘寒雜交羊遺傳物質(zhì)差異是區(qū)分易混淆綿羊品種的關(guān)鍵技術(shù)問題，也是珍貴地方品種灘羊種質(zhì)資源得以保護的必要條件。隨著DNA 分子標記技術(shù)的快速發(fā)展，SSR 指紋圖譜身份證及二維碼將得到廣泛應用，發(fā)展成為一種重要的種質(zhì)鑒定手段，其在SSR 指紋圖譜基礎上將品種的基因型特征數(shù)字化，使每個品種具有唯一的數(shù)字代碼，更加簡單明了地進行品種區(qū)分鑒定。陳亮等[31]利用7 對SSR 引物構(gòu)建了吉林省大豆品種的SSR 分子身份證，具有唯一性，完善了大豆品種指紋圖譜身份證技術(shù)體系。趙雅楠等[17]表示SSR 指紋識別完全可以應用于品種區(qū)分。史君潔等[32]等通過SSR 技術(shù)實現(xiàn)4種鯉魚的種質(zhì)鑒定與區(qū)分。在本研究中，100 對微衛(wèi)星標記篩選出46 對特異標記，篩選成功率為46%，鑒定效率達到100%，說明可利用微衛(wèi)星分子標記對綿羊進行分子水平種質(zhì)與種源鑒定。

通過這46 個SSR 分子標記開發(fā)出特異性標記，達到精準鑒定易混淆綿羊肉品種的目的。

4 結(jié)論

本研究采用高通量測序技術(shù)對3種羊肉混合樣本的基因組進行測序，主要對測序后的序列結(jié)果和SSR 位點信息進行分析，確定了混合樣品經(jīng)過高通量測序后完全可以進行SSR 位點標記與開發(fā)，開發(fā)標記的SSR 位點可對同屬亞種的動物肉品進行鑒別，實現(xiàn)混合樣本和單一樣本的鑒定，可以運用到灘羊和綿羊種質(zhì)資源的保護和DNA 分子鑒定中，對綿羊易混淆品種肉品鑒定、溯源管理及原產(chǎn)地保護具有重要意義。該研究結(jié)果不僅為近緣混合物種肉樣品的SSR 位點開發(fā)提供了理論與實踐基礎，而且可以應用到同屬亞種的肉源物種鑒別及摻假羊肉的基源鑒定。