基于UHPLC-LTQ-Orbitrap高分辨質(zhì)譜的黃花菜中化學(xué)成分快速鑒定及裂解途徑分析

劉 偉 孫江浩 張菊華 張 群 朱向榮 蘇東林 單 楊*

（1 湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 湖南省農(nóng)產(chǎn)品加工研究所 長(zhǎng)沙410125 2 中南大學(xué)隆平分院 長(zhǎng)沙410125 3 美國(guó)農(nóng)業(yè)部貝爾茨維爾人類營(yíng)養(yǎng)研究中心 美國(guó)貝爾茨維爾20705）

黃花菜（Hemerocallis fulva）又名金針菜，為百合科多年生草本植物，其食用部分為花蕾，是我國(guó)的特色蔬菜之一[1-2]。黃花菜被列為“四大素山珍”之一，色澤金黃，香味濃郁，味道鮮美，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，富含糖類、蛋白質(zhì)、維生素、無(wú)機(jī)鹽及多種人體必需的氨基酸，其中胡蘿卜素和維生素C 含量是西紅柿的5 倍，具有平肝養(yǎng)血、消腫利尿、抗菌消炎、止血、鎮(zhèn)痛、通乳、健胃和安神的功能[3-6]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究顯示，黃花菜具抑郁癥、抗炎和抗失眠等多種藥理作用[4-6]，可以促進(jìn)睡眠小鼠的神經(jīng)變化[5]并影響大鼠的運(yùn)動(dòng)活力[7]。此外，黃花菜提取物具有抗氧化[4]和抑制脂質(zhì)過(guò)氧化的能力[8]。前期植物化學(xué)成分研究表明，黃花菜中含有多酚、類胡蘿卜素、黃酮類等多種成分[3，8-10]。

超高效液相色譜-線性離子阱和靜電場(chǎng)軌道離子阱質(zhì)譜（UHPLC-LTQ-Orbitrap）技術(shù)是近年來(lái)質(zhì)譜技術(shù)發(fā)展的杰出代表，結(jié)合了超高效液相的高效、快速分離性能和高分辨率質(zhì)譜的高準(zhǔn)確、靈敏性，可同時(shí)實(shí)現(xiàn)母、子離子的高分辨采集及多級(jí)質(zhì)譜碎裂信息獲取，且可提供化合物的精確分子質(zhì)量信息，不僅可以鑒定已知化合物，還可以通過(guò)不同化合物的裂解規(guī)律及特征碎片離子來(lái)推斷未知化合物[11-12]。該技術(shù)可為小分子化學(xué)成分的鑒定及分析提供更多、更準(zhǔn)確的信息。目前，對(duì)黃花菜的研究主要集中在采用HPLC-DAD 測(cè)定干制過(guò)程中特定抗氧化成分含量、提取分離和藥理活性等方面[6，13-14]，而黃花菜化學(xué)成分的系統(tǒng)鑒定分析則研究較少。

本研究采用UHPLC-LTQ-Orbitrap 高分辨質(zhì)譜法分析黃花菜中的化學(xué)成分，根據(jù)液相保留時(shí)間、紫外吸收、精確分子質(zhì)量數(shù)據(jù)、多級(jí)質(zhì)譜碎片離子和相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道等手段進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，為探討黃花菜的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和類似化合物的結(jié)構(gòu)鑒定提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與裝置

UHPLC-HRAMn 質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司。包括LTQ Orbitrap XL 線性離子阱軌道阱組合式質(zhì)譜儀、Accela 1250 輸液泵、PAL HTC 自動(dòng)進(jìn)樣器、PDA 檢測(cè)器（ThermoFisher Scientific，San Jose，CA）、和安捷倫G1316A 柱溫箱（Agilent，Palo Alto，CA）。

AL 204 型十萬(wàn)分之一分析天平，梅特勒-托利多儀器有限公司；KQ 5200E 型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；TGL-16M 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，長(zhǎng)沙邁佳森儀器設(shè)備有限公司；微量移液器，德國(guó)Eppendorf 公司；A11 高速不銹鋼粉碎機(jī)，德國(guó)IKA 公司；FD-2 真空冷凍干燥機(jī)，中國(guó)博醫(yī)康公司。

1.2 主要材料與試劑

新鮮黃花菜（品種：白花）：于7月采自湖南省衡陽(yáng)市祁東縣。根據(jù)色澤和外形，選擇均一成熟度進(jìn)行采收，一般為抽穗后大約27～35 d。所有樣品在采摘后30 min 內(nèi)送到實(shí)驗(yàn)室，并在4 ℃儲(chǔ)存待干燥處理。

乙腈、甲醇（色譜純），美國(guó)Fisher Scientific公司；甲酸（色譜純），美國(guó)Sigma Aldrich 公司；其它試劑均為分析純級(jí)。

1.3 試驗(yàn)條件

1.3.1 色譜條件 色譜柱：Hypersil Gold AQ RP-C18 UHPLC色譜柱（100 mm×3.0 mm，1.9 μm），Thermo Fisher Scientific；UltraShield 保 護(hù)柱。流動(dòng)相為0.1%甲酸水溶液（A）和0.1%甲酸乙腈溶液，梯度洗脫：0～10 min，4% B→15% B；10～20 min，15% B→70% B；20～25 min，70% B；流量0.3 mL/min；柱溫40 ℃。初始比例洗脫平衡時(shí)間5 min，紫外采集范圍200～400 nm。

1.3.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源，負(fù)離子檢測(cè)模式；鞘氣為70 單位，輔助氣為15 單位，噴霧電壓為4.8 kV，毛細(xì)管溫度為270 ℃，毛細(xì)管電壓為15.0 V，套管透鏡補(bǔ)償電壓為70 V。數(shù)據(jù)采集范圍m/z100～1 500，分辨率30 000。自動(dòng)增益控制（AGC）為2×105，F(xiàn)T-MS/MS 二級(jí)掃描AGC 為1×105，隔離寬度為1.5 amu，最大離子注入時(shí)間為500 MS。二級(jí)質(zhì)譜采用動(dòng)態(tài)數(shù)據(jù)依賴性掃描，碰撞能量設(shè)為35%，多級(jí)質(zhì)譜選取上一級(jí)最高峰離子掃描碰撞誘導(dǎo)解離碎片。

1.4 樣品制備

黃花菜采后即在真空冷凍干燥機(jī)中凍干，在0.006 mbar、-50 ℃下處理24 h 至水分含量大約10%。干燥樣品粉碎后過(guò)80 目篩，在塑料樣品瓶中室溫貯存待分析。

取黃花菜粉末樣品0.3 g 加入10.0 mL 甲醇-水溶液（體積比70∶30）后，室溫下超聲提取1 h，提取液于2795 g 離心10 min，取上清液過(guò)0.45 μm 微孔濾膜（PTFE），置于2 mL HPLC 進(jìn)樣瓶中待UHPLC-HRAMn 分析，進(jìn)樣量2 μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 UHPLC-UV-HRMSn 分析條件優(yōu)化

為獲得良好的色譜峰形和質(zhì)譜信號(hào)響應(yīng)，試驗(yàn)優(yōu)化了流動(dòng)相組成、洗脫梯度、流速、柱溫等參數(shù)使其達(dá)到了理想的分辨率和成分的有效分離。比較了甲醇-水、乙腈-水等幾種類型的溶劑體系及洗脫模式。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用0.1%甲酸的乙腈-水流動(dòng)相系統(tǒng)獲得了理想的分離性能，甲酸的使用有效提高了分辨率，同時(shí)消除了拖尾；0.3 mL/min的流速和40 ℃柱溫可以有效提高分離效率。酚類化合物鑒定的紫外波長(zhǎng)為350 nm。色譜圖如圖1所示。

2.2 咖啡?？鼘幩岷忘S酮類化合物的鑒定

通過(guò)精確的質(zhì)量分析、多級(jí)質(zhì)譜碎片離子信息、相對(duì)豐度及相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，對(duì)黃花菜化學(xué)成分進(jìn)行分析鑒定，共鑒定了27 個(gè)組分，其中包括酚酸類12 個(gè)、黃酮醇類15 個(gè)及其它類1 個(gè)，各化學(xué)成分的保留時(shí)間、高分辨質(zhì)譜實(shí)測(cè)值、多級(jí)質(zhì)譜碎片種類、相對(duì)豐度、紫外吸收及誤差等列于表1。

化合物1 準(zhǔn)分子離子峰m/z 191[M-H]-最可能的分子式為C7H11O6，誤差均小于2。其產(chǎn)生二級(jí)碎片離子m/z 173 和127，說(shuō)明結(jié)構(gòu)中存在1 個(gè)H2O 分子和1 個(gè)CH4O3基團(tuán)，此特征碎片離子裂解規(guī)律與奎寧酸一致。

化合物2，3，8 的分子離子峰[M-H]-均為m/z 353，結(jié)合精確相對(duì)分子質(zhì)量可推測(cè)它們的分子式為C16H17O9（單咖啡酰基奎寧酸，CQA），誤差均小于2。主要的二級(jí)質(zhì)譜碎片為m/z 191 和179，分別為失去奎寧酸部分和咖啡酸部分的碎片離子，以及進(jìn)一步失去H2O 的碎片離子m/z 173 和161等。通過(guò)對(duì)比分析多級(jí)質(zhì)譜碎片離子種類和相對(duì)離子強(qiáng)度，可進(jìn)一步確定咖啡?；诳鼘幩崮负松系孽；恢??；衔?，3 的母離子均中性丟失一分子咖啡酰（162 u）而產(chǎn)生m/z 191，可知咖啡酰取代基的位置分別為3-或5-。通過(guò)分析化合物2 和3 的其它碎片離子，可以將它們鑒定為3-CQA 和5-CQA?；衔? 的母離子在裂解過(guò)程中丟失一分子咖啡酰（162 u）產(chǎn)生m/z 191，且進(jìn)一步丟失一分子水（18 u）產(chǎn)生m/z 173，結(jié)合文獻(xiàn)[9，15-16]數(shù)據(jù)，在反相色譜中4-CQA 的保留時(shí)間更長(zhǎng)，由此推測(cè)其為4-CQA。

化合物4，5，10 的分子離子峰[M-H]-均為m/z 337，精確相對(duì)分子質(zhì)量可推測(cè)它們最可能的分子式為C16H17O8。主要的二級(jí)質(zhì)譜碎片為m/z 191，163，119，均產(chǎn)生碎片m/z 163，此為典型的香豆酸碎片峰，結(jié)合保留時(shí)間及相關(guān)文獻(xiàn)[15]，推測(cè)化合物為3 -pCoQA，5 -pCoQA，4 -pCoQA（p -Coumaroylquinic acid，對(duì)香豆?？鼘幩幔?/p>

化合物6，7，13 的分子離子峰[M-H]-均為367，精確相對(duì)分子質(zhì)量可推測(cè)它們最可能的分子式為C17H19O9。三者在負(fù)離子模式下均產(chǎn)生碎片離子峰m/z 191，其紫外吸收最大波長(zhǎng)同為323，219。其中，化合物6 和7 的母離子在MS2中均中性丟失一分子阿魏酰（176 u）產(chǎn)生m/z 191，由此推測(cè)兩者的阿魏酰取代基位置為3 或5 位，同時(shí)結(jié)合保留時(shí)間，推斷其為3-FQA 和5-FQA（Feruloylquinic acid，阿魏?？崴幔?。化合物13 的準(zhǔn)分子離子峰在裂解過(guò)程中先失去一分子阿魏酰（176 u），繼續(xù)失去一分子水（18 u）產(chǎn)生m/z 173，由此推測(cè)其分子結(jié)構(gòu)中阿魏酰取代基的位置為4位，推斷其為4-FQA。

化合物12，14 的分子離子峰[M-H]-均為335，精確相對(duì)分子質(zhì)量可推測(cè)它們最可能的分子式為C16H15O8。在二級(jí)質(zhì)譜裂解過(guò)程中m/z 335 準(zhǔn)分子離子峰丟失一分子莽草酸殘基產(chǎn)生m/z 179 ，繼續(xù)失去-COO 產(chǎn)生m/z 135，為咖啡酸的特征峰，紫外最大吸收波長(zhǎng)為220，323 nm，與相關(guān)報(bào)道[17-18，27]相似，可推測(cè)其為咖啡酰莽草酸。然而，由于缺乏相應(yīng)的對(duì)照品，咖啡酰在莽草酸母核上的具體取代基位置尚難以確定，由此僅將化合物12，14 鑒定為咖啡酰莽草酸。

圖1 黃花菜液相色譜圖（350 nm）Fig.1 HPLC-UV chromatogram at 350 nm of daylily flower

化合物19 準(zhǔn)分子離子峰[M-H]-為m/z 609，精確相對(duì)分子質(zhì)量可推測(cè)其最可能的分子式為C27H29O16。在其ESI-MS2譜中，m/z 301 為母離子[M-H]-脫掉鼠李糖和葡萄糖（308 u）形成的特征碎片[M-H-Glc-Rha]-。而m/z 301 在ESI-MS3譜中則產(chǎn)生m/z 179 和m/z 151，其中m/z 179 發(fā)生RDA 反應(yīng)形成碎片離子m/z 151，這與槲皮素典型的裂解途徑相似，推斷該化合物為槲皮素-3-O-蕓香糖苷即蘆丁，與文獻(xiàn)報(bào)道[9，19-20]黃花菜中蘆丁裂解特征一致。

化合物20 準(zhǔn)分子離子峰[M-H]-為m/z 463，精確相對(duì)分子質(zhì)量可推測(cè)其最可能的分子式為C21H19O12。在二級(jí)質(zhì)譜裂解過(guò)程中m/z 463 準(zhǔn)分子離子峰丟失一分子葡萄糖殘基產(chǎn)生m/z 301[MH-Glc]-，m/z 301 苷元C 環(huán)開(kāi)環(huán)裂解產(chǎn)生m/z 179

和m/z 151。由此可確定化合物20 為異槲皮素。

表1 UHPLC-LTQ-Orbitrap 質(zhì)譜鑒定黃花菜樣品中酚類物質(zhì)Table 1 The identification of phenolic compounds in daylily sample by UHPLC-LTQ-Orbitrap-MS

（續(xù)表1）

化合物9 準(zhǔn)分子離子峰[M-H]-為m/z 625，精確相對(duì)分子質(zhì)量可推測(cè)其最可能的分子式為C27H29O17。在二級(jí)質(zhì)譜裂解過(guò)程中m/z 625 準(zhǔn)分子離子峰丟失一分子葡萄糖殘基產(chǎn)生m/z 463[MH-Glc]-和一分子葡萄糖殘基產(chǎn)生槲皮素m/z 301[M-H-2Glc]-，在ESI-MS3 譜中產(chǎn)生m/z 300[MH-2Glc-H]-和m/z 299[M-H-2Glc-2H]-，其紫外吸收最大波長(zhǎng)為348，294 nm，結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道[21]，此波長(zhǎng)為槲皮素衍生物，位于3，7-O 取代基，由此推測(cè)此化合物為槲皮素-3，7-二-O-葡萄糖苷。

化合物11 準(zhǔn)分子離子峰[M-H]-為m/z 771，精確相對(duì)分子質(zhì)量可推測(cè)其最可能的分子式為C33H39O21。在二級(jí)質(zhì)譜裂解過(guò)程中m/z 771 準(zhǔn)分子離子峰丟失一分子葡萄糖殘基產(chǎn)生m/z 609[MH-Glc]-，在隨后的多級(jí)質(zhì)譜裂解過(guò)程中，其進(jìn)一步產(chǎn)生m/z 301[M-H-Glc-Rha]-，m/z 179，m/z 151，其與蘆丁的裂解規(guī)律一致。結(jié)合其精準(zhǔn)分子質(zhì)量和文獻(xiàn)[9]，推斷該化合物為槲皮素-3’-O-蕓香糖苷-7’-O-葡萄糖苷。

化合物21 準(zhǔn)分子離子峰[M-H]-為m/z 579，精確相對(duì)分子質(zhì)量可推測(cè)其最可能的分子式為C26H27O15。在其ESI-MS2 譜中，m/z 301 為母離子脫掉鼠李糖和吡喃阿拉伯糖（278 u）形成的特征碎片[M-H-Rha-Ara]-。而m/z 271 為槲皮素失去一分子CO 后脫去2 個(gè)H 形成的，推斷該化合物為槲皮素-3-鼠李糖-（1→2）-α-L-吡喃阿拉伯糖苷。

化合物23 準(zhǔn)分子離子峰[M-H]-為m/z 433，精確相對(duì)分子質(zhì)量可推測(cè)其最可能的分子式為C20H17O11。在二級(jí)質(zhì)譜中出現(xiàn)了m/z 301 的碎片離子，為脫去一份子中性吡喃阿拉伯糖的槲皮素苷元[M-H-Ara]-。結(jié)合在黃花菜中已報(bào)道的化學(xué)成分[9]，推斷為槲皮素-3-O-吡喃阿拉伯糖苷。

化合物15，18，25，26 均為異鼠李素糖苷衍生物，具有相似的紫外吸收，負(fù)離子掃描的分子離子峰m/z 分別為477，769，623 和477。在二級(jí)質(zhì)譜裂解過(guò)程中均產(chǎn)生碎片m/z 315 和m/z 314，在隨后的多級(jí)質(zhì)譜裂解過(guò)程中，進(jìn)一步中性丟失1 分子CH3后產(chǎn)生m/z 300，然后繼續(xù)丟失1 分子HCO和CO 分別產(chǎn)生m/z 271 和m/z 243，其為典型的異鼠李素糖苷碎片峰，化合物15，18，25 與26 具有相同的母核，只是糖取代種類不同。化合物15與26 分子離子峰[M-H]-均為477，其二級(jí)離子碎片離子m/z 315 為母離子[M-H]-丟失1 分子單糖苷（162 u），m/z 314 為[M-H-162-H]-，根據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量與文獻(xiàn)相關(guān)信息[9，22-23]，推測(cè)其為異鼠李素-3-O-葡萄糖苷和異鼠李素-3-O-已糖苷。對(duì)化合物18 進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析，產(chǎn)生碎片離子m/z 605[M-H-162-2H]-，m/z 623[M-H-146]-，m/z 315[M-H-146-308]-，m/z 314[M-H-146-308-H]-，表明其可能是鼠李糖苷（146 u）和蕓香糖苷（308 u），推斷該化合物為異鼠李素-3-O-蕓香糖苷-7-O-鼠李糖苷。對(duì)化合物25 進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析，m/z 315 為母離子[M-H]-脫掉鼠李糖和葡萄糖（308 u）形成的特征碎片[M-H-Glc-Rha]-，根據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量、紫外吸收特征及相關(guān)文獻(xiàn)[24]，因而推測(cè)其為異鼠李素-3-O-蕓香糖苷。

化合物17，22，24，28 均為山奈酚糖苷衍生物，具有相似的紫外吸收，負(fù)離子掃描的分子離子峰m/z 分別為739，593，593 和417?；衔?2，24，28 進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析均產(chǎn)生碎片m/z 285，其為典型的山奈酚糖苷碎片峰。在隨后的多級(jí)質(zhì)譜裂解過(guò)程中，進(jìn)一步中性丟失1 分子CO 產(chǎn)生m/z 257，其與山奈酚的裂解規(guī)律一致?；衔?2，24準(zhǔn)分子離子峰[M-H]-m/z 593，m/z 285 為母離子[M-H]-依次脫掉鼠李糖和葡萄糖（308 u）形成的特征碎片[M-H-Glc-Rha]-，根據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量、紫外吸收特征及相關(guān)文獻(xiàn)[9，21，25]，用而推測(cè)其為山奈酚-3-O-蕓香糖苷。對(duì)化合物28 進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析，m/z 285 為母離子[M-H]-脫掉阿拉伯糖（132 u）形成的特征碎片[M-H-Ara]-，根據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量與文獻(xiàn)相關(guān)信息[21，24]，推測(cè)其為山奈酚-3-O-阿拉伯糖苷。對(duì)化合物17 進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析，產(chǎn)生碎片離子m/z 575[M-H-162-2H]-，繼續(xù)失去鼠李糖（146 u）產(chǎn)生m/z 429，285，山奈酚-3-O-鼠李葡萄糖基-7-O-鼠李糖苷。

化合物27 準(zhǔn)分子離子峰[M-H]-為m/z 507，精確相對(duì)分子質(zhì)量可推測(cè)其最可能的分子式為C23H13O13。在二級(jí)質(zhì)譜裂解過(guò)程中m/z 507 準(zhǔn)分子離子峰丟失一分子葡萄糖殘基產(chǎn)生m/z 345[MH-162]-和m/z 344[M-H-162-H]-，同時(shí)糖苷配基離子m/z 344 相對(duì)豐度顯著高于m/z 345，說(shuō)明糖苷位于3-號(hào)位；m/z 344 進(jìn)一步中性丟失CH3產(chǎn)生m/z 329，其為典型的丁香亭糖苷碎片峰，根據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量與相關(guān)文獻(xiàn)[23-24，26]，推測(cè)其為丁香亭-3-O-葡糖苷。

化合物16 準(zhǔn)分子離子峰[M-H]-為m/z 555，推測(cè)其分子式為C20H31O16N2。根據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量推測(cè)其為一種未知氨基酸酰胺類化合物。

3 結(jié)論

采用UHPLC-LTQ-Orbitrap 高分辨質(zhì)譜技術(shù)對(duì)黃花菜的化學(xué)成分進(jìn)行分析，通過(guò)結(jié)合多級(jí)質(zhì)譜裂解規(guī)律和相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，共鑒定出27 個(gè)組分，包括酚酸類化合物12 個(gè)，黃酮醇類15 個(gè)及其它類1 個(gè)。該方法可高效、快速、靈敏、全面地分析黃花菜的化學(xué)成分，可實(shí)現(xiàn)酚酸及黃酮類不同化合物的鑒別，為探討黃花菜的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供理論基礎(chǔ)，也為類似化合物的結(jié)構(gòu)鑒定提供依據(jù)。