DNA條形碼技術(shù)在鮭科魚類真?zhèn)舞b別中的應用

王 楠 邢冉冉 馬聰聰 喬旭光 陳 穎*

（1 中國檢驗檢疫科學研究院 北京100176 2 山東農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院 山東泰安271018）

鮭科（Salmonidae），屬硬骨魚綱、脊索動物門，包括3 個亞科，7 個屬，36 個種，分布于亞洲、歐洲、大洋洲等，是世界上第三大養(yǎng)殖魚類[1]。鮭科魚類因富含不飽和脂肪酸（ω-3脂肪酸）、蛋白質(zhì)和維生素等而受到消費者喜愛。近年來，鮭科魚在全球范圍內(nèi)消費量持續(xù)增加，其中的許多物種已被引入休閑漁業(yè)和水產(chǎn)養(yǎng)殖之中[2-3]。鮭科魚類（如大西洋鮭魚和大鱗大馬哈魚等）因具有紅白相間的肌肉紋理而被通稱為“三文魚”。事實上，三文魚并不是魚類在系統(tǒng)分類學上的名稱，而是由英語“Salmon”音譯而來。目前國內(nèi)外對三文魚定義不一，市場上銷售的各種所謂的“三文魚”，并不是一類魚。例如：挪威三文魚主要指大西洋鮭魚（Salmo salar）；芬蘭三文魚主要是紅肉虹鱒（Oncorhynchus mykiss）；而美國三文魚則主要是阿拉斯加鮭魚（Oncorhynchus nerka）。它們之間因為口感、營養(yǎng)價值的差異而價格相差巨大，然而，均以“三文魚”作為商品名稱出售，導致市場上三文魚標簽混亂。在Xiong等[4]的一項調(diào)查研究中發(fā)現(xiàn)其在上海、南京和杭州收集的全部鮭科魚制品均以“三文魚”作為商品名稱標識。而2018年5月廣受關(guān)注的青海龍羊峽水庫“三文魚”事件，也是由于商品標識的規(guī)范性問題引發(fā)消費者熱議。鑒于三文魚涉及物種較多，當前關(guān)于鮭科魚商品標簽的規(guī)范性較差，缺乏商品中所包含物種的具體標識，因此建立高效準確的鮭科魚類物種鑒別方法對規(guī)范市場秩序具有重要的意義。

針對魚類物種的鑒別，除形態(tài)學鑒定外，目前開發(fā)了許多基于蛋白質(zhì)和核酸的鑒別方法。Armstrong等[5]通過HPLC 鑒定了15種常見的海洋魚類；Etienne等[6]通過SDS-PAGE 鑒定了10種商業(yè)魚；Martinez等[7]通過2-D 電泳方法鑒定了10種深海魚類。然而，蛋白質(zhì)在熱處理和食品加壓過程中易變性，使得加工產(chǎn)品及近緣物種難以識別[8]。聚合酶鏈式反應（PCR）方法的目標物為核酸，核酸作為遺傳物質(zhì)的基礎(chǔ)，不會因加工工藝和環(huán)境的影響而發(fā)生改變，故具有比蛋白質(zhì)更好的特異性、可靠性和靈敏度，被廣泛用于植物、動物和微生物的物種鑒定[9-11]。此外，對于魚類的物種鑒定還包括限制片段長度多態(tài)性（RFLP）[12]，隨機擴增的多態(tài)性DNA（RAPD）[13]，單鏈構(gòu)象多態(tài)性（SSCP）[14]及擴增片段長度多態(tài)性（AFLP）[15]等技術(shù)。上述技術(shù)大多都是針對已知物種的檢測，并且遺傳中位點的變化容易導致判斷結(jié)果不準確。DNA 條形碼技術(shù)是利用生物體DNA 中一段保守片段對物種進行鑒定的方法，對由單一物種組成的樣品（包括深加工產(chǎn)品）具有高度的特異性和準確性[12]，已被用于從原料到加工制品的海產(chǎn)品分析中[16-18]。在海產(chǎn)品的物種鑒別中，多采用編碼線粒體細胞色素C 氧化酶亞基1（COI）基因中的658 個堿基進行引物的設(shè)計[19]。此外，16S 核糖體RNA（16S rRNA）也經(jīng)常被使用[20]。在本研究中，同樣選用擴增長度分別為658 bp 的COI 區(qū)域和255 bp 的16S rRNA 片段進行鮭科魚類的物種鑒別。

本研究針對目前國內(nèi)外市場上常見的鮭科魚類種屬界限模糊、標簽錯誤、以次充好、以假亂真的現(xiàn)狀，利用DNA 條形碼技術(shù)對市售鮭科魚類及其加工制品進行分子鑒別，以期為鮭科魚的市場監(jiān)管提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

冰鮮鮭魚樣品：大西洋鮭魚、駝背大馬哈魚（Oncorhynchus gorbuscha）、大鱗大馬哈魚（Oncorhynchus tshawytscha）購自北京京滬深海鮮市場，虹鱒魚來自青海省共和縣龍羊峽水庫，大馬哈魚（Oncorhynchus keta）由上海出入境檢驗檢疫局提供。所有樣品均以整條魚購進或收集，并經(jīng)過相關(guān)形態(tài)學鑒定。

此外，從北京京滬深海鮮市場和京東商城分別購買了2 份商品標識為挪威的三文魚冰鮮樣品、2 份商品標識分別為北京懷柔和青海的三文魚冰鮮樣品及13 份鮭魚制品（包括2 份冰鮮魚片、5 份罐頭、3 份魚松、1 份魚干、1 份煙熏魚和1份魚卵）（表1）。

氯仿、異戊醇、無水乙醇，國藥集團化學試劑有限公司；Nucleospin Food 試劑盒，德國MN 公司；ExoSAP-ITTM PCR 產(chǎn)物快速回收試劑盒，美國Affymetrix 公司；BigDye Terminator 3.1 測序試劑盒、BigDye Xterminator purification kit 試劑盒，美國應用生物系統(tǒng)公司。

表1 市售三文魚產(chǎn)品信息表Table 1 Information of commercially salmonids goods

1.2 儀器與設(shè)備

高速離心機，美國賽默飛世爾公司；核酸蛋白測定儀，德國艾本德公司；PCR 熱循環(huán)儀，美國應用生物系統(tǒng)公司；電泳儀、凝膠成像系統(tǒng) 美國伯樂公司；ABI 3500 測序儀，美國應用生物系統(tǒng)公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 DNA 提取 將收集的冰鮮鮭魚樣品置于冷凍干燥機中脫水干燥后研磨成粉末，采用CTAB法[21]提取DNA。對于鮭魚加工制品，因為涉及鹽腌、煎炸等加工工藝，首先用雙蒸水（ddH2O）和無水乙醇沖洗3～4 遍以去除樣品表面的鹽分及油漬等雜質(zhì)，隨后采用NucleoSpin Food 試劑盒進行DNA 提取。每個樣品設(shè)置3 個重復。

1.3.2 DNA 質(zhì)量和質(zhì)量濃度測定 采用核酸蛋白測定儀分別測定樣品DNA 在波長230，260，280 nm 處的吸收值，以及A260nm/A280nm和A230nm/A260nm值，以測定提取DNA 的質(zhì)量濃度和純度。

1.3.3 PCR 擴增 將樣品DNA 原液統(tǒng)一稀釋到10 ng/μL 作為PCR 擴增模板。分別選擇擴增長度為658 bp 的COI 基因片段和長度為255 bp 的16S rRNA 基因片段設(shè)計的通用引物進行PCR 擴增（表2）。

總體積50 μL 的擴增體系如 下：25 μL 2×PCR reaction mix，21 μL ddH2O，2 μL DNA 模板，上下游引物（濃度為10 μmol/L）各1 μL。2 對引物的擴增條件除退火溫度不同外，其它條件均一致：94 ℃預變性4 min；接著進行35 個循環(huán)，每個循環(huán)包括94 ℃變性30 s，退火溫度30 s，72 ℃延伸1min；72 ℃延伸10 min。COI 區(qū)域和16S rRNA 區(qū)域引物的退火溫度分別為54 ℃和53 ℃。

采用PCR 熱循環(huán)儀進行基因擴增。擴增產(chǎn)物利用2%瓊脂糖凝膠進行凝膠電泳，通過凝膠成像系統(tǒng)分析PCR 擴增產(chǎn)物，觀察擴增目的條帶的長度，并初步評估引物的特異性及擴增產(chǎn)物的質(zhì)量和數(shù)量。

表2 PCR 擴增引物Table 2 PCR primers used for amplification of genomic DNA

1.3.4 一代測序及數(shù)據(jù)分析 采用PCR 產(chǎn)物快速回收試劑盒ExoSAP-ITTM進行PCR 產(chǎn)物的純化：取5 μL PCR 產(chǎn)物和2 μL Exo SAP-IT 試劑，混合均勻后放于PCR 熱循環(huán)儀中于37 ℃及80℃分別溫育15 min，純化后的PCR 產(chǎn)物作為下一步測序反應的模板。

采用BigDye Terminator 3.1 測序試劑盒對純化后的PCR 產(chǎn)物進行一代雙向測序前的準備工作，具體操作按試劑盒說明書進行。測序反應體系10 μL：1 μL 5×Sequencing Buffer，0.8 μL BigDye Terminator 3.1，1.6 μL 濃度為1 μmol/L 的引物，1 μL 模板DNA 和5.6 μL ddH2O。放入PCR 熱循環(huán)儀中，測序反應條件為96 ℃，2 min；96 ℃，20 s，50℃，10 s，60 ℃，4 min，25 個循環(huán)；4 ℃保存。然后通過BigDye Xterminator 純化試劑盒進行測序反應產(chǎn)物的純化，具體操作按試劑盒說明書進行。使用ABI 3500 測序儀對PCR 產(chǎn)物進行雙向測序。

將所得COI 和16S rRNA 的測序結(jié)果在DNASART 軟件中使用SeqMan 程序進行序列拼接，并將拼接后的序列利用MEGA6.0 軟件進行多重序列比對，以除去序列兩端的低質(zhì)量區(qū)域和上下游引物區(qū)域。將處理好的序列在NCBI 的Gen-Bank 數(shù)據(jù)庫進行BLAST 比對，并基于相似性、覆蓋度和綜合評分來確定樣品的種屬信息。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR 擴增結(jié)果

通過核酸蛋白測定儀測得各樣品的DNA 質(zhì)量濃度均大于10 ng/μL，A260nm/A280nm和A230nm/A260nm比值均在1.7～2.2 之間，滿足后續(xù)PCR 擴增的要求。以稀釋至10 ng/μL 的DNA 為模板對17種樣品DNA 進行COI 和16S rRNA 區(qū)段的PCR 擴增得到的電泳圖如圖1所示。對于擴增長度為255 bp 的16S rRNA 短片段，所有樣品均得到清晰明亮的單一目的條帶，可用于后續(xù)的基因測序分析。對于擴增長度為658 bp 的COI 片段，除煙熏食品和罐頭制品（12～14 號樣品）外，其余樣品均得到單一明亮的目的條帶。12～14 號樣品雖擴增得到目的條帶，而相比于其它樣品，亮度明顯較低。這是由于煙熏和罐頭制品經(jīng)過高溫烘烤及油炸或高溫高壓滅菌等加工工藝，使得樣品DNA 斷裂降解嚴重，因此較難擴增出相對較長的基因片段（658 bp）。

圖1 不同魚樣品COI 和16S rRNA 片段的擴增結(jié)果Fig.1 Amplification of COI and 16S rRNA in different fish samples

2.2 一代測序結(jié)果分析

將測序得到的COI 序列和16S rRNA 序列在NCBI 的GenBank 數(shù)據(jù)庫中進行檢索比對，發(fā)現(xiàn)測得的不同魚類的COI 和16S rRNA 序列同Gen-Bank 數(shù)據(jù)庫中序列匹配度和覆蓋度均在95%以上。相關(guān)文獻表明，擴增長度為658 bp 的COI 魚類通用引物在物種間的遺傳距離低于2%[24]；Sarri等[23]的研究中針對不同物種（魚類96.6%、鳥類97.1%、哺乳動物97.5%）給出了不同的進化速率。因此分別選擇匹配度≥98%的COI 序列和≥96.6%的16S rRNA 序列以保證鑒定結(jié)果的準確性。

DNA 條形碼技術(shù)對收集的5種已知鮭科魚類的鑒定結(jié)果表明，本研究所建立的DNA 條形碼方法對鮭科魚類的鑒定結(jié)果與已知物種信息一致。以COI 或16S rRNA 作為單一靶標均能成功將物種鑒定至種水平（表3）。相比于COI 序列，部分物種的16S rRNA 序列的最高匹配度相對較低，這主要是因為目標片段長度較短（約255 bp），個別堿基的缺失、插入及突變將對整體的覆蓋度產(chǎn)生很大影響。

表3 5種鮭科魚樣品的DNA 條形碼技術(shù)物種鑒定結(jié)果Table 3 Species identification of 5 Salmonidae samples based on DNA barcoding

在本研究鑒定的17 份市售鮭科魚商品（表4）中，有9 份樣品（1～8，12 號樣品）的COI 序列和16S rRNA 序列通過測序均成功獲得單一物種序列，并且COI 基因和16S rRNA 鑒定結(jié)果一致，可準確將樣品鑒定至種水平。有3 份樣品（9～11 號樣品，均為三文魚罐頭）的COI 序列經(jīng)GenBank數(shù)據(jù)庫序列比對發(fā)現(xiàn)其物種匹配度均小于90%，而3 份樣品的16S rRNA 序列測序成功，可通過其擴增序列鑒別出物種成分。推測高溫高壓等加工工藝使罐頭制品的DNA 降解斷裂嚴重，采用擴增長度為658 bp 的COI 引物難以有效擴增出完整長度的靶序列，因此通過COI 序列鑒別失敗。剩余5 份樣品（13～17 號）擴增得到的COI 和16S rRNA 序列均出現(xiàn)雙峰無法完成序列的拼接，表明這5 份樣品中不止含有一個物種，單純通過一代測序無法獲得有效可拼接序列。

在2 對靶序列的鑒別能力方面，針對由單一物種組成的鮭科魚商品，除三文魚罐頭因過度加工（高壓高溫）造成DNA 斷裂降解嚴重之外，單一物種組成的鮭科魚商品均可通過COI 基因和16S rRNA 準確鑒別樣品的物種成分。其中1～4 號冰鮮鮭科魚商品購于海鮮市場，沒有具體的商品包裝，商品標簽均采用“產(chǎn)地+三文魚”形式標識；5～6 號冰鮮樣品于線上收集，以物種俗名作為商品標簽；7 號樣品為鮭科魚的初級加工制品，并且在商品的配料表中標明魚的具體物種名稱，標簽較為規(guī)范；8～12 號樣品為鮭科魚的深加工制品，均以“三文魚”作為商品名稱，單純通過商品標簽無法獲得其明確的物種信息。然而以上12 份樣品通過本研究所建立的方法，以COI 基因為靶標，以16S rRNA 為輔助靶標，經(jīng)一代測序技術(shù)可獲得鮭科魚商品的物種信息。13～17 號樣品經(jīng)一代測序其峰圖出現(xiàn)多峰與雜峰，無法完成序列的拼接。推測這些樣品中含有不止一個物種，其PCR 產(chǎn)物在凝膠電泳中重疊積累在同一區(qū)段，難以進行有效的純化，因此無法通過一代測序技術(shù)獲得每個物種的可拼接序列。

表4 12種市售鮭科魚制品的DNA 條形碼技術(shù)物種鑒定結(jié)果Table 4 Species identification of 12 commercial Salmonidae samples based on DNA barcoding

綜上，本研究涉及的鮭科魚商品標簽的規(guī)范性有待于進一步提高，其中2 份樣品（11.8%）僅標注物種俗名，12 份樣品（70.6%）單純以“三文魚”作為商品標簽，缺乏具體物種信息。DNA 條形碼技術(shù)對鮭科魚商品的COI 基因和16S rRNA 鑒定結(jié)果表明，針對由單一物種組成的鮭科魚樣品，本研究所建立的DNA 條形碼方法可準確將其鑒定至種屬，效率高，特異性強，可用于市售鮭魚冰鮮及加工制品的物種鑒定。

3 討論與結(jié)論

基于DNA 條形碼技術(shù)鑒定物種的一個關(guān)鍵點是基因的選擇。相關(guān)文獻表明，在海產(chǎn)品的物種鑒別中，相比核DNA，線粒體DNA 由于具有更高的拷貝數(shù)而受到廣泛的認可[25]。其中，COI是目前分子系統(tǒng)發(fā)育研究中應用較為廣泛的分子標記[26]。該標記可用于魚類物種的鑒定和發(fā)現(xiàn)新物種，并且可以為各種魚類提供更高（>98%）的種間特異性[27]。除COI 以外，其它線粒體標記物也被用于系統(tǒng)發(fā)育遺傳學或用于補充DNA 條形碼中的COI 基因。其中，在對魚類的研究分析中已提出將16S 核糖體RNA（16S rRNA）作為補充COI 的DNA 條形碼標志物，可用于諸如扇貝、鯉魚等群體的物種成分分析[28-31]。本研究中分別使用COI 區(qū)段擴增長度為658 bp 魚類通用引物和16S rRNA區(qū)段擴增長度為255 bp 的動物源性通用引物進行樣品的擴增和一代測序。完整的COI 條形碼和較短的16S rRNA 微條形碼是識別不同分類群和產(chǎn)品類型海產(chǎn)品的有效工具。盡管擴增長度為658 bp 的COI 全長條形碼序列包含的物種信息更為詳細，并且在鑒定結(jié)果的準確性上高于DNA 微條形碼序列，但對于深加工制品，DNA 的嚴重降解、斷裂使得其DNA 難以擴增出完整長度的靶基因序列，因此本研究中選用擴增長度為255 bp 的16S rRNA 微條形碼作為COI 全長條形碼的補充，用于高度加工海產(chǎn)品的物種鑒定。此外，本研究選用通用引物，可擴增出絕大部分海產(chǎn)品，甚至是許多后生動物，物種覆蓋范圍廣，有利于發(fā)現(xiàn)樣品中存在的未知物種。

隨著現(xiàn)代食品工業(yè)的發(fā)展，水產(chǎn)品的食用形式日趨多樣化，以鮭科魚商品為例，除作為刺身生食之外，各種鮭魚深加工制品如鮭魚罐頭、鮭魚松等產(chǎn)品也應運而生，其形態(tài)破壞嚴重，存在以不同物種魚肉甚至畜禽肉進行混合摻假的風險[4]。本研究所涉及的17 份市售鮭科魚商品中有5 份為含有多種物種成分的混合物，當使用通用條形碼為引物進行擴增時，多種物種成分均成功獲得靶序列，產(chǎn)生的重疊信號限制了一代測序技術(shù)的應用。在這種情況下，單純依靠一代測序無法獲得樣品成分信息。近年來，基于高通量測序的宏條形碼技術(shù)（Meta-barcoding）在物種鑒別方面取得了巨大進展[32]。通過采用一段通用引物，宏條形碼技術(shù)可以一次性檢測到混合樣品中的全部物種，大大節(jié)約了檢測時間且檢測信息量大，增加了從混合物種中檢測到低量物種和未知物種的可能性[33]。目前宏條形碼技術(shù)已廣泛用于疾病防控[34]、環(huán)境監(jiān)控[35]和法醫(yī)學鑒定[36]中，在食品領(lǐng)域尚處于起步階段，但在混合物種的定性檢測方面已展現(xiàn)出廣闊的應用前景[37]，雖然目前檢測成本仍然較高，但高通量測序的價格在近幾年中逐漸下降，因此在不久的將來，該技術(shù)可應用于常規(guī)食品研究領(lǐng)域。本研究中選用的16S rRNA 動物源性通用微條形碼引物，為后續(xù)應用高通量測序技術(shù)進行鮭科魚深加工制品的真實屬性鑒別奠定了基礎(chǔ)。

綜上，針對單一物種組成的樣品，本研究建立了以COI 為靶標，以16S rRNA 為輔助靶標的DNA 條形碼技術(shù)，并將該技術(shù)用于17 份市售鮭科魚商品的物種鑒別中。研究結(jié)果表明，該技術(shù)可成功將鮭科魚類區(qū)分至種屬，具有足夠的靈敏度和準確性供監(jiān)管機構(gòu)用于監(jiān)測世界各地鮭科魚產(chǎn)品標識正確與否，同時為市售“三文魚”的市場監(jiān)管提供技術(shù)支撐，以提高商品標簽的規(guī)范化程度。