高產(chǎn)類胡蘿卜素的蛹蟲草固體發(fā)酵體系研究

左澤紅 葉志偉 簡錦輝 萬 華 林俊芳 郭麗瓊* 云 帆

（1 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院 廣州510642 2 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)數(shù)信學(xué)院 廣州510642 3 廣東省微生態(tài)制劑工程技術(shù)研究中心 廣州510642 4 廣州市澳鍵豐澤生物科技股份有限公司 廣州510530）

蛹蟲草是一種珍貴的藥用真菌，富含多種生物活性物質(zhì)，如蟲草多糖、蟲草酸、蟲草素和腺苷等[1]，具有抗癌、抗腫瘤、抗炎癥、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化和抑菌等多種藥理作用[2]。研究表明，蛹蟲草呈黃色或橙黃色是因?yàn)轶w內(nèi)類胡蘿卜素的積累[3]。類胡蘿卜素是由類異戊二烯單位組成的碳?xì)浠衔锛捌溲趸苌锏目偡Q，同樣具有抗炎、抗癌以及抗氧化等功效[4]?，F(xiàn)今發(fā)現(xiàn)的類胡蘿卜素絕大部分是脂溶性類胡蘿卜素，人體難以直接吸收利用且大部分遇光和熱不穩(wěn)定[5-6]。蛹蟲草中的類胡蘿卜素有葉黃素[7]、玉米黃素[8]和北蟲草黃素[9]，前2 者屬于脂溶性類胡蘿卜素，而后者具有很強(qiáng)的親水性，并且其含量占蛹蟲草中總類胡蘿卜素含量的86.7%。與傳統(tǒng)類胡蘿卜素相比，其理論上具有更強(qiáng)的生理活性，能更好地被人體吸收并且生物利用度更高。固體發(fā)酵技術(shù)具有成本低，易于管理，后處理設(shè)備少等優(yōu)點(diǎn)，是一種經(jīng)濟(jì)、環(huán)保、有效的生產(chǎn)方式[10]，廣泛應(yīng)用于各種生物活性成分的生產(chǎn)，然而，通過固體發(fā)酵技術(shù)生產(chǎn)類胡蘿卜素的方式還未曾報(bào)道。本研究采用固體發(fā)酵技術(shù)，通過篩選出的蛹蟲草菌株建立了一套蛹蟲草高產(chǎn)類胡蘿卜素固體發(fā)酵體系，為今后開發(fā)利用蛹蟲草中水溶性類胡蘿卜素提供科學(xué)數(shù)據(jù)。

1 試驗(yàn)材料

1.1 試驗(yàn)菌株

蛹蟲草菌種CM04，保藏于廣東省微生物制劑工程技術(shù)研究中心；CM09，購自北京吉蕈園科技有限公司；CM10，購自寧陽縣海鑫生物科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)試劑

瓊脂、葡萄糖、磷酸二氫鉀、蛋白胨、硫酸鎂、無水乙醇，購自廣州成碩生物工程有限公司。

1.3 儀器與設(shè)備

2 試驗(yàn)方法

2.1 蛹蟲草培養(yǎng)方法

1）活化 將斜面或-80 ℃保存的原始菌株接種到PDA 固體平板培養(yǎng)基上，25 ℃恒溫遮光培養(yǎng)至菌絲長滿培養(yǎng)皿，然后光照使其轉(zhuǎn)色，得到活化的菌種。

2）種子液的制備 在活化好長滿黃色菌絲的平板上，取3～4 塊黃豆粒大小的菌絲塊接種于PDA 液體培養(yǎng)基中，在25 ℃、150 r/min 條件下振蕩培養(yǎng)4～5 d，待長滿菌絲球后可用于接種。

3）固體發(fā)酵 在組培瓶中加入按培養(yǎng)基配方準(zhǔn)確稱取的各類谷物，加自來水充分?jǐn)嚢杈鶆颍?21 ℃高壓滅菌40 min，冷卻至室溫后接種25%的蛹蟲草種子液，25 ℃暗培養(yǎng)7 d，打開光照，20℃繼續(xù)培養(yǎng)7 d 促使其轉(zhuǎn)色，產(chǎn)生類胡蘿卜素。

2.2 蛹蟲草類胡蘿卜素的提取及測定

將長滿蛹蟲草黃色菌絲的培養(yǎng)基質(zhì)于55 ℃下烘48 h，粉碎后過30 目篩。稱取一定量的樣品，按料液比1∶20 加入60%的乙醇作為提取劑，25℃浸提過夜，8 000 r/min 離心10 min，上清液即類胡蘿卜素粗提取液，在波長470 nm 處測吸光值，類胡蘿卜素含量根據(jù)式（1）計(jì)算。

式中，A——吸光度；V——60%乙醇用量/mL；D——提取液稀釋陪數(shù)；E——消光系數(shù)（0.16）；W——樣品干重/g。

2.3 固體發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

以大米為對照培養(yǎng)基配方CK，以蛹蟲草生長最適C/N 比20∶1 為原則，以大米、小麥、大豆、麩皮和玉米為培養(yǎng)料，根據(jù)各谷物原料的碳氮比[11]，設(shè)計(jì)各培養(yǎng)基配方（見表1），以類胡蘿卜素的含量為響應(yīng)值確定最佳發(fā)酵培養(yǎng)基配方。

2.4 固體發(fā)酵條件的優(yōu)化

蛹蟲草的生長分為2 個(gè)階段：第1 階段是黑暗培養(yǎng)階段，此階段不需要光，因?yàn)楣鈺种凭z生長；第2 階段是光照培養(yǎng)階段，只有在光的作用下才能轉(zhuǎn)色，產(chǎn)生類胡蘿卜素或長出子實(shí)體。本試驗(yàn)根據(jù)蛹蟲草的具體生長情況，分2 個(gè)階段優(yōu)化蛹蟲草產(chǎn)類胡蘿卜素的發(fā)酵條件。

表1 各培養(yǎng)基配方的原料組成Table 1 Raw material composition of each medium

2.4.1 第1 階段不同發(fā)酵條件對蛹蟲草產(chǎn)類胡蘿卜素的影響 以小麥（73%）、麩皮（20%）、玉米（7%）為培養(yǎng)基配方，研究不同基質(zhì)顆粒度（0，10，30，50，70 目）、初始含水量（33%，50%，60%，67%，71%）、pH 值（4，5，6，7，8）、接種量（5%，15%，25%，35%，45%）、黑暗培養(yǎng)時(shí)間（5，7，9，11，13，15 d）、黑暗培養(yǎng)溫度（20，22，25，28，30 ℃）、裝料量（10，15，20，2，30 g）等條件對蛹蟲草CM10 產(chǎn)類胡蘿卜素的影響。其中，確定蛹蟲草初始發(fā)酵條件為：基質(zhì)裝料量20 g，培養(yǎng)基質(zhì)顆粒度0 目（即不粉碎過篩），初始含水量60%，培養(yǎng)基自然pH 值，接種量25%，黑暗培養(yǎng)時(shí)間7 d，黑暗培養(yǎng)溫度25℃，光照溫度20 ℃，光照時(shí)間7 d。固體發(fā)酵時(shí)，改變其中某一因素，待發(fā)酵結(jié)束后測定類胡蘿卜素含量，根據(jù)單因素結(jié)果研究各因素對蛹蟲草產(chǎn)類胡蘿卜素的影響。

還有一些矛盾的產(chǎn)生是由于工作責(zé)任的劃分，我所在的設(shè)備科室一向工作內(nèi)容是設(shè)計(jì)石油天然氣現(xiàn)場的各種梯子平臺等，然而實(shí)際上一些梯子與平臺并不完全適合于我們設(shè)備專業(yè)單獨(dú)完成，有的需要土建專業(yè)的配合，但是由于專業(yè)科室之間相互不信任的情況，這種類似的問題得不到有效合理的支持，一些設(shè)計(jì)可能需要較長時(shí)間的溝通，并召開多次會議，得到相關(guān)部門裁決的支持，才能得到有效的配合。這些工作都大大增加了一個(gè)正常設(shè)計(jì)工程的工作量，大量人力物力耗費(fèi)在無意義的內(nèi)部爭議中，降低了工作效率。

2.4.2 響應(yīng)曲面法（RSM）優(yōu)化類胡蘿卜素發(fā)酵條件 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，確定基質(zhì)顆粒度、初始含水量和黑暗培養(yǎng)時(shí)間的范圍，以類胡蘿卜素的含量為響應(yīng)值，通過響應(yīng)面曲面分析優(yōu)化發(fā)酵條件，試驗(yàn)因素水平見表2。

表2 發(fā)酵條件Box-Behnken 因素和水平Table 2 Box-Behnken factors and levels of fermentation conditions

2.4.3 第2 階段不同發(fā)酵條件對蛹蟲草產(chǎn)類胡蘿卜素的影響 第2 階段影響蛹蟲草產(chǎn)類胡蘿卜素的主要因素是光照溫度和光照時(shí)間，因此，在第1階段最優(yōu)條件的基礎(chǔ)上研究了蛹蟲草在不同光照溫度（20，22，25，28 ℃）下隨光照時(shí)間增加時(shí)類胡蘿卜素含量的變化。

2.5 數(shù)據(jù)處理

使用Origin 8.5 軟件處理數(shù)據(jù)和作圖，使用IBM SPSS Statistics 21 軟件分析數(shù)據(jù)的顯著性，使用Design Expert 8.0 軟件進(jìn)行多元回歸和方差分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 發(fā)酵培養(yǎng)基

蛹蟲草CM04，CM09，CM10 在各培養(yǎng)基配方中類胡蘿卜素的產(chǎn)量如表3所示。蛹蟲草CM04在配方D 中類胡蘿卜素產(chǎn)量最高，達(dá)到199 μg/g，相對于對照組CK（110 μg/g），類胡蘿卜素產(chǎn)量明顯提高；蛹蟲草CM09 在配方L 中類胡蘿卜素產(chǎn)量最高，達(dá)到201 μg/g，是對照組CK（51 μg/g）產(chǎn)量的4 倍；蛹蟲草CM10 在配方L 中類胡蘿卜素產(chǎn)量最高，達(dá)到285 μg/g，是對照組CK（95 μg/g）產(chǎn)量的3 倍。最終選取蛹蟲草CM10 和其最優(yōu)培養(yǎng)基配方L（小麥73%、麩皮20%、玉米7%）優(yōu)化蛹蟲草固體發(fā)酵條件。

表3 蛹蟲草CM04，CM09，CM10 在各培養(yǎng)基中產(chǎn)類胡蘿卜素含量Table 3 Carotenoid content of Cordyceps militaris CM04，CM09 and CM10 in each medium

3.2 優(yōu)化的固體發(fā)酵條件

3.2.1 第1 階段不同發(fā)酵條件下菌株類胡蘿卜素產(chǎn)量

1）使用L 培養(yǎng)基配方，在保持基質(zhì)裝料量20 g，初始含水量60%，自然pH，接種量25%，黑暗培養(yǎng)時(shí)間7 d，黑暗菌絲培養(yǎng)溫度25 ℃，光照溫度20 ℃，光照時(shí)間7 d等條件不變的情況下，基質(zhì)粒度對蛹蟲草CM10類胡蘿卜素產(chǎn)量的影響如圖1a所示。當(dāng)基質(zhì)粒度為10 目時(shí)，類胡蘿卜素產(chǎn)量達(dá)到最大值。0 目時(shí)雖然菌絲生長較快，但對基質(zhì)的利用有限，如玉米等顆粒度較大的基質(zhì)很難被利用。基質(zhì)粒度超過30 目，達(dá)到50 目和70 目時(shí)，培養(yǎng)基易結(jié)塊，菌絲不能完全吃透，只能在培養(yǎng)基表面生長，類胡蘿卜素產(chǎn)量也隨之降低。最終，選取10 目作為最佳基質(zhì)粒度。

2）使用L 培養(yǎng)基配方，在保持基質(zhì)裝料量20 g，基質(zhì)粒度0 目（即不粉碎過篩），自然pH，接種量25%，黑暗培養(yǎng)時(shí)間7 d，黑暗菌絲培養(yǎng)溫度25 ℃，光照溫度20 ℃，光照時(shí)間7 d等條件不變的情況下，基質(zhì)初始含水量對蛹蟲草CM10類胡蘿卜素產(chǎn)量的影響如圖1b所示。隨著基質(zhì)初始含水量增加，類胡蘿卜素產(chǎn)量先增后減。當(dāng)含水量為50%時(shí)，類胡蘿卜素的產(chǎn)量達(dá)到最大值。一般來說，水分不足，基質(zhì)過于干燥，導(dǎo)致菌絲生長不良；水分過高，由于重力作用，培養(yǎng)基質(zhì)顆粒密度小的易粘成團(tuán)，影響發(fā)酵，故過高或過低的基質(zhì)初始水分含量均會導(dǎo)致類胡蘿卜素產(chǎn)量量降低[12]。最終選取50%作為基質(zhì)最佳初始含水量。

圖1 第1 階段不同發(fā)酵條件對蛹蟲草類胡蘿卜素產(chǎn)量的影響Fig.1 Effects of different fermentation conditions on the carotenoid yield of Cordyceps militaris in first stage

3）使用L 培養(yǎng)基配方，在保持基質(zhì)裝料量20 g，基質(zhì)粒度0 目，初始含水量60%，接種量25%，黑暗培養(yǎng)時(shí)間7 d，黑暗菌絲培養(yǎng)溫度25℃，光照溫度20 ℃，光照時(shí)間7 d等條件不變的情況下，基質(zhì)初始pH 對蛹蟲草CM10類胡蘿卜素產(chǎn)量的影響如圖1c所示：當(dāng)pH 為4 或8 時(shí)，類胡蘿卜素產(chǎn)量相對較低。當(dāng)pH 為5 和7 時(shí)，類胡蘿卜素產(chǎn)量達(dá)到最大值。pH 為6 時(shí)雖與pH 值為5 和7 差異顯著，但也僅比二者少8%和3%。在不調(diào)節(jié)pH 值的情況下，培養(yǎng)基的自然pH 處于6～7 之間。Xie等[13]的研究表明蛹蟲草在固體培養(yǎng)時(shí)菌絲生長最適pH 為6.2。故綜合考慮，蛹蟲草固體發(fā)酵產(chǎn)類胡蘿卜素過程中無需調(diào)節(jié)基質(zhì)初始pH，保持自然pH 即可。

4）使用L 培養(yǎng)基配方，在保持基質(zhì)裝料量20 g，基質(zhì)粒度0 目，初始含水量60%，自然pH，黑暗培養(yǎng)時(shí)間7 d，黑暗培養(yǎng)溫度25 ℃，光照溫度20 ℃，光照時(shí)間7 d等條件不變的情況下，接種量對蛹蟲草CM10類胡蘿卜素產(chǎn)量的影響如圖1d所示。當(dāng)接種量從5%增加到25%時(shí)，類胡蘿卜素的產(chǎn)量隨之增加。當(dāng)接種量大于25%時(shí)，類胡蘿卜素的產(chǎn)量呈下降趨勢，可能是因?yàn)榻臃N量過大，菌絲過快生長，使得基質(zhì)難以提供充足的營養(yǎng)供發(fā)酵后期生產(chǎn)類胡蘿卜素。最終選取25%作為最佳接種量。

5）使用L 培養(yǎng)基配方，在保持基質(zhì)裝料量20 g，基質(zhì)粒度0 目，初始含水量60%，自然pH，接種量25%，黑暗培養(yǎng)溫度25 ℃，光照溫度20℃，光照時(shí)間7 d等條件不變的情況下，菌絲黑暗培養(yǎng)時(shí)間對蛹蟲草CM10類胡蘿卜素產(chǎn)量的影響如圖1e所示。隨著黑暗生長時(shí)間的增加，類胡蘿卜素的產(chǎn)量也不斷增加。當(dāng)菌絲黑暗生長到13 d時(shí)，類胡蘿卜素產(chǎn)量達(dá)到最大值。若繼續(xù)增加黑暗培養(yǎng)時(shí)間，類胡蘿卜素的產(chǎn)量開始下降，可能是因?yàn)榇藭r(shí)菌絲已到衰亡期，分泌次級代謝產(chǎn)物類胡蘿卜素的能力急劇下降。根據(jù)顯著性分析結(jié)果可知，黑暗培養(yǎng)11 d 和13 d 的類胡蘿卜素產(chǎn)量沒有顯著性差異，因此為減少培養(yǎng)時(shí)間，選取11 d 作為最適菌絲黑暗培養(yǎng)時(shí)間。

6）使用L 培養(yǎng)基配方，在保持基質(zhì)裝料量20 g，基質(zhì)粒度0 目，初始含水量60%，自然pH，接種量25%，黑暗培養(yǎng)時(shí)間7 d，光照溫度20 ℃，光照時(shí)間7 d等條件不變的情況下，菌絲黑暗生長溫度對蛹蟲草CM10類胡蘿卜素產(chǎn)量的影響如圖1f所示。當(dāng)溫度為22 ℃時(shí)，類胡蘿卜素的產(chǎn)量達(dá)到最大值。隨著溫度逐漸升高，類胡蘿卜素的產(chǎn)量也逐漸降低，并且在30 ℃時(shí)達(dá)到最低值，此時(shí)菌絲生長受到抑制。最終，選取22 ℃為菌絲最佳黑暗生長溫度。

7）使用L 培養(yǎng)基配方，在保持基質(zhì)粒度0目，初始含水量60%，自然pH，接種量25%，黑暗培養(yǎng)時(shí)間7 d，黑暗培養(yǎng)溫度25 ℃，光照溫度20℃，光照時(shí)間7 d等條件不變的情況下，裝料量對蛹蟲草CM10類胡蘿卜素產(chǎn)量的影響如表4所示。當(dāng)裝料量為15 g 時(shí)，類胡蘿卜素的單位產(chǎn)量最高。隨著裝料量增加，類胡蘿卜素單位產(chǎn)量逐漸降低。雖然裝料量為15 g 時(shí)類胡蘿卜素的單位產(chǎn)量最高，但此時(shí)收集的樣品總量不多，而根據(jù)類胡蘿卜素理論總量，得出裝料量為25 g 時(shí)類胡蘿卜素總量最高。最終，選取25 g 為最適裝料量。

表4 不同裝料量條件下蛹蟲草類胡蘿卜素的產(chǎn)量Table 4 The yield of carotenoid of Cordyceps militaris under different loadings conditions

3.2.2 響應(yīng)面Box-Behnken 設(shè)計(jì)優(yōu)化的試驗(yàn)結(jié)果根據(jù)表5 試驗(yàn)結(jié)果，采用Design-Expert 8.0 軟件進(jìn)行回歸分析，得到響應(yīng)面二次多元回歸方程：Y = 286.20 - 7.12A- 16.75B + 9.13C - 14.25AB -8.50AC+6.25BC-28.85A2-36.10B2-15.85C2。對該模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果如表6所示。模型F=4.78，P=0.0256＜0.05，說明模型顯著；失擬項(xiàng)P=0.2996＞0.05，說明模型失擬項(xiàng)不顯著；決定系數(shù)R2=0.8601，說明模型與實(shí)際情況擬合程度較好；顯著的模型項(xiàng)為B、A2、B2（P＜0.05）；因素F 關(guān)系為F（B）＞F（C）＞F（A），說明3 個(gè)因素對蛹蟲草類胡蘿卜素產(chǎn)量的影響由大到小依次為基質(zhì)初始含水量、黑暗菌絲培養(yǎng)時(shí)間和基質(zhì)顆粒度。根據(jù)軟件分析得到第1 階段蛹蟲草固體發(fā)酵產(chǎn)類胡蘿卜素的最佳培養(yǎng)條件為：基質(zhì)顆粒度為10 目，基質(zhì)初始含水量為47.88%，黑暗培養(yǎng)時(shí)間為12.49 d。結(jié)合實(shí)際情況，確定下一步最佳固體發(fā)酵條件為：基質(zhì)顆粒度10 目，基質(zhì)初始含水量48%，黑暗培養(yǎng)時(shí)間12 d。

表5 響應(yīng)面Box-Behnken 設(shè)計(jì)優(yōu)化分析方案和試驗(yàn)結(jié)果Table 5 Optimization analysis scheme and test results of response surface Box-Behnken design

表6 回歸方程的方差分析Table 6 Analysis of variance of regression equation

采用軟件Design-Expert 進(jìn)行二次多元回歸擬合，得到的響應(yīng)面圖及等高線圖（圖2）。由圖2a可知：黑暗培養(yǎng)時(shí)間一定時(shí)，響應(yīng)曲面的等高線稀疏和坡度緩和，表明類胡蘿卜素含量受基質(zhì)粒度和初始含水量交互作用的影響最弱。從圖2b可知：當(dāng)初始含水量一定時(shí)，響應(yīng)曲面的等高線較密集和坡度較陡，表明類胡蘿卜素含量受黑暗培養(yǎng)時(shí)間和基質(zhì)粒度交互作用最強(qiáng)。從圖2c可知：當(dāng)基質(zhì)粒度一定時(shí)，響應(yīng)曲面的等高線稀疏，表明類胡蘿卜素含量受黑暗培養(yǎng)初始含水量交互作用的影響較弱。

圖2 各因素對蛹蟲草類胡蘿卜素產(chǎn)量影響的響應(yīng)面圖及等高線圖Fig.2 Response surface and contour plot showing the effects of various factor on the carotenoids yields of Cordyceps militaris

3.2.3 第2 階段蛹蟲草固體發(fā)酵產(chǎn)生類胡蘿卜素的發(fā)酵條件 使用第1 階段優(yōu)化的培養(yǎng)條件，即L 培養(yǎng)基配方，基質(zhì)裝料量25 g，基質(zhì)顆粒度10目，初始含水量48%，自然pH，接種量25%，黑暗培養(yǎng)時(shí)間12 d，黑暗培養(yǎng)溫度22 ℃，蛹蟲草CM10 在第2 階段固體發(fā)酵產(chǎn)類生胡蘿卜素的結(jié)果如圖3所示。當(dāng)光照溫度為25 ℃時(shí)，培養(yǎng)14 d的菌株類胡蘿卜素產(chǎn)量達(dá)最大值；而在14 d 以后，光照溫度為25 ℃時(shí)類胡蘿卜素產(chǎn)量略有降低，可能是因?yàn)榇藭r(shí)底物主要被用于蛹蟲草子實(shí)體的生長。根據(jù)本試驗(yàn)結(jié)果，選取最適光照溫度為25 ℃，最適光照時(shí)間為14 d，此時(shí)類胡蘿卜素產(chǎn)量最高，即346 μg/g。

圖3 不同光照溫度下光照時(shí)間對蛹蟲草類胡蘿卜素產(chǎn)量的影響Fig.3 Effects of light time on carotenoid yields of Cordyceps militaris at different light temperatures

4 討論

類胡蘿卜素是一類具有多種生物學(xué)功能的色素，作為食品添加劑和營養(yǎng)增補(bǔ)劑廣泛應(yīng)用于食品及醫(yī)療保健行業(yè)中。類胡蘿卜素的來源主要有3種形式：植物提取、化學(xué)合成和微生物發(fā)酵?；瘜W(xué)法合成的類胡蘿卜素生物活性低且存在質(zhì)量安全隱患；植物中提取的類胡蘿卜素雖然生物活性高，但是提取工藝復(fù)雜、產(chǎn)率低；微生物發(fā)酵產(chǎn)生的類胡蘿卜素產(chǎn)量高、安全性好，是生產(chǎn)類胡蘿卜素的最好方法。目前，國內(nèi)外利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)類胡蘿卜素的菌株有紅酵母、三孢布拉霉、分支細(xì)菌和短桿菌等，均采用液體發(fā)酵的方式，而液體發(fā)酵成本高，對設(shè)備的要求高。與之相比，固體發(fā)酵原料低價(jià)易得，工藝簡單，成本低。Liu等[14]以茶籽（52.48%）、豆渣（29.38%）和米糠（18.54%）為固體發(fā)酵基質(zhì)，將粗糙脈孢菌和植物乳桿菌混合發(fā)酵74.9 h，通過HPLC 在發(fā)酵后的基質(zhì)中鑒定出15種類胡蘿卜素。謝愛娣[15]以紅酵母菌株D 為發(fā)酵菌種，確定了固體發(fā)酵生產(chǎn)類胡蘿卜素的最佳培養(yǎng)基組分為m啤酒糟︰m豆粕︰m麩皮=1︰3︰2，含水量為60%，添加K2HPO4和MgSO4的質(zhì)量濃度分別為2.00 g/L 和0.50 g/L；最佳培養(yǎng)條件為豆粕20目，麩皮和啤酒糟混合篩分，裝量為20 g/250 mL三角瓶，接種齡為24 h，接種量為15%，自然pH，溫度25 ℃培養(yǎng)96 h，在該最優(yōu)條件下所得類胡蘿卜素產(chǎn)量為32 mg/kg。本研究利用可食用的谷物作為培養(yǎng)基，通過篩選出的蛹蟲草菌株建立了一套蛹蟲草高產(chǎn)類胡蘿卜素固體發(fā)酵體系，最終產(chǎn)量為346 μg/g。與謝愛娣[15]的研究相比，產(chǎn)量提高了10 倍，并且本研究所選用培養(yǎng)基未添加任何化學(xué)試劑，綠色安全，成本低，具有可行性。

光照條件是蛹蟲草產(chǎn)類胡蘿卜素的一個(gè)必要條件。Shrestha等[16]曾報(bào)道光是決定蛹蟲草菌絲體密度、質(zhì)地和色素的關(guān)鍵因素，黑暗條件下菌絲體不會產(chǎn)生色素。付鳴佳[3]發(fā)現(xiàn)蛹蟲草在光照培養(yǎng)下菌落呈橙黃色是由于菌絲中類胡蘿卜素的積累所致。影響蛹蟲草類胡蘿卜素生物合成的光照條件包括光質(zhì)、光強(qiáng)、光照時(shí)間和光照溫度等。張金艷[17]研究了光照強(qiáng)度對蛹蟲草生產(chǎn)類胡蘿卜素的影響，發(fā)現(xiàn)隨著光照強(qiáng)度的不斷增加，蛹蟲草類胡蘿卜素的產(chǎn)量也隨之提高。Dong等[18]的研究發(fā)現(xiàn)相較于藍(lán)光和紅光，粉光（1/3 藍(lán)光+2/3 紅光）更顯著促進(jìn)蛹蟲草子實(shí)體中類胡蘿卜素的積累。本文只研究了光照時(shí)間和光照溫度對蛹蟲草類胡蘿卜素產(chǎn)量的影響，并未深入研究光強(qiáng)和光質(zhì)的影響。在本研究的基礎(chǔ)上，通過增加光強(qiáng)或改變光質(zhì)提高蛹蟲草類胡蘿卜素的產(chǎn)量，還有待深入研究。

目前，關(guān)于蛹蟲草類胡蘿卜素的提取研究多集中于子實(shí)體和菌絲體上，且大多使用丙酮和石油醚等不可食用的有機(jī)溶劑[19-20]，而關(guān)于蛹蟲草固體發(fā)酵菌粉中類胡蘿卜素的提取尚未見報(bào)道。本試驗(yàn)采用乙醇浸提法提取蛹蟲草固體發(fā)酵菌粉中的類胡蘿卜素，粗提液經(jīng)波長掃描后具有類胡蘿卜素特征吸收峰，說明浸提出來的物質(zhì)是類胡蘿卜素。本方法簡單、實(shí)用，提取溶劑乙醇綠色、安全，易被消費(fèi)者接受。