蛋白質氧化對核桃蛋白界面性質的影響

孫領鴿 毛曉英 吳慶智 王丹丹 張 建 李寶坤 程衛(wèi)東

（石河子大學食品學院 新疆石河子832003）

蛋白質能夠自發(fā)地遷移至空氣-水（A/W）界面或油-水界面（O/W），并在界面上形成蛋白吸附層，一般蛋白質的界面吸附過程是不可逆的。不同蛋白質具有不同的界面性質，主要受分子柔性、表面構象及親/疏水氨基酸殘基的分布方式等蛋白質分子特性以及pH、離子強度、溫度和食品中其它組成成分等環(huán)境因素的影響[1]。蛋白質溶液的界面性質與蛋白質的起泡性和乳化性等功能性質密切相關[2]。界面張力下降是泡沫或乳化體系形成的首要條件，蛋白質通過在界面上快速吸附以及發(fā)生構象變化和分子重排降低界面張力，而張力降低的程度和速率是決定體系的形成的關鍵因素。同時，蛋白質分子通過分子間相互作用在空氣-水或油-水界面上形成黏性膜阻止氣泡或油滴重新聚集，從而保證泡沫或者乳化體系的穩(wěn)定性[3-4]。近年來，隨著蛋白質的起泡性和乳化性在食品加工中廣泛應用，蛋白質的界面性質成為國內外學者的研究熱點之一。例如：Zhang等[5]報道蛋白質起泡性與表面張力有關，表面張力對蛋白質乳化性和乳化穩(wěn)定性也有重要影響。Lechevalier等[6]發(fā)現(xiàn)清蛋白、卵轉鐵蛋白和溶菌酶在空氣/水界面上有協(xié)同作用；周春霞等[7]研究發(fā)現(xiàn)大豆球蛋白在空氣-水界面上的吸附機制與油-水界面相同。

目前對于核桃蛋白的研究主要集中在蛋白質的提取純化[8]、理化性質[9-10]、功能性質[11-12]以及活性多肽提取[13]等方面。紙皮核桃作為新疆地區(qū)特色產品之一，種植面積廣，產量大，品質優(yōu)良。然而，在核桃及其蛋白制品加工過程中，無論是脫脂之前還是脫脂之后，蛋白質始終會受到氧化應激環(huán)境的影響而發(fā)生氧化，導致蛋白質的性質發(fā)生改變。脂肪氧合酶催化多不飽和脂肪酸發(fā)生脂質過氧化反應產生的脂質自由基、脂質氫過氧化物和活性醛衍生物等均能誘導蛋白質發(fā)生氧化修飾[14]。丙二醛是脂質過氧化次生產物中含量最多的活性醛[15]。此前關于丙二醛與蛋白質氧化的研究主要集中在大豆蛋白的結構和功能性質方面[16-17]，而在核桃蛋白尤其核桃蛋白的界面性質方面鮮有報道。

為了研究氧化對核桃蛋白水-空氣界面性質的影響，本試驗中采用濃度為0～10 mmol/L 的丙二醛溶液和核桃蛋白建立氧化模擬體系，研究核桃蛋白氧化后羰基值、粒徑分布、Zeta 電位、表面張力、表面疏水性和起泡性質的變化，氧化后核桃蛋白分散體系的特征以及與蛋白泡沫體系有關的界面性質，從而為利用蛋白質起泡性等功能性質，提高核桃蛋白產品質量品質以及工藝設計和改進提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新疆紙皮核桃，石河子市農貿市場；1，1，3，3-四乙氧基丙烷，美國Reanta 公司；所有試劑均為分析純級。

1.2 儀器與設備

JYW-200A 表面張力儀，承德優(yōu)特檢測儀器有限公司；LGJ-18S 冷凍干燥機，北京松源華興科技有限公司；NavoPlus 粒徑分析儀，麥克默瑞提克（上海）儀器有限公司；SHZ-B 水浴恒溫振蕩器，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；高速冷凍離心機，費默飛世爾科技（中國）有限公司；NanoPlus Zeta 電位及納米粒度分析儀，英國Malvern 公司；ELE 高速均質剪切機，上海易勒機電設備有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 核桃分離蛋白的制備 核桃分離蛋白的制備參照毛曉英[10]的方法。

1.3.2 氧化核桃蛋白的制備 參照Adams等[15]的方法制備丙二醛，在波長267 nm 處測定丙二醛的濃度。將一定濃度的蛋白質溶液與已知濃度的丙二醛溶液混合，使得核桃蛋白溶液中丙二醛的濃度分別為 0，0.01，0.1，1，10 mmol/L。將制備好的氧化蛋白溶液在恒溫水浴振蕩器中振蕩24 h，保證其充分反應。反應結束后在去離子水中透析72 h 除去未反應的丙二醛，透析過程中注意及時更換去離子水。通過冷凍干燥得到粉狀的丙二醛氧化核桃蛋白。

1.3.3 羰基值的測定 采用2，4-二硝基苯肼法，試驗操作參照Wu等[18]的方法。

1.3.4 粒徑的分布 將核桃蛋白樣品用0.01 mmol/L pH 8.0 磷酸鹽緩沖溶液溶解，室溫攪拌2 h 以8 000×g 離心30 min，通過稀釋使得上清液最終質量濃度為1 mg/mL，采用粒徑分析儀測定粒徑分布。

1.3.5 相對分子質量的測定 參照Wu等[16]的方法，采用LC-20A 高效液相色譜儀檢測核桃蛋白樣品的分子質量分布情況。

1.3.6 Zeta 電位的測定 將樣品用0.01 mmol/L pH 8.0 磷酸鹽緩沖溶液按照1：200 的比例稀釋，采用Zeta 電位及納米粒度分析儀測定溶液電位[19]。

1.3.7 表面張力的測定 將蛋白質樣品分散于去離子水中，配制成0.01 kg/L 的蛋白質溶液，采用JYW-200A 表面張力儀測定表面張力。

1.3.8 表面疏水性的測定 參照Huang等[20]的方法，測定核桃蛋白的表面疏水性。

1.3.9 起泡性的測定[21]取50 mL 1%蛋白質溶液于燒杯中，用高速均質剪切機以10 000 r/min 的轉速攪拌2 min 后迅速倒入100 mL 量筒中，記錄體積，計算起泡能力（FC）；靜置30 min 后，再次記錄體積，計算泡沫穩(wěn)定性（FS）。

式中，V——攪拌停止時泡沫與溶液的總體積，mL；50——原溶液的體積，mL

式中，VE——靜置30 min 后泡沫與溶液的總體積，mL。

1.4 數據處理與統(tǒng)計分析

試驗結果用平均數±標準誤差表示，樣本重復數n=3。顯著性分析采用SPSS statisics 23.0 的Dukeny 檢驗，繪圖采用Origin 8.5 軟件。

2 結果與分析

2.1 蛋白質氧化對核桃蛋白羰基值的影響

作為目前應用最為廣泛的蛋白質氧化生物標記，蛋白質羰基值用于表征蛋白質氧化的程度。由圖1可知，未氧化核桃蛋白的羰基值為3.12 nmol/mg；隨著丙二醛濃度的增加，核桃蛋白的羰基值顯著增加（P＜0.05）；丙二醛含量為10 mmol/L時，核桃蛋白羰基值是未氧化蛋白羰基值的7 倍，表明核桃蛋白發(fā)生了顯著氧化。Wu等[16]研究發(fā)現(xiàn)大豆分離蛋白隨著丙二醛濃度增加而增大；Burcham等[22]用不同濃度的丙二醛處理牛血清蛋白時得到類似的結果。由于丙二醛分子含有2 個羰基，當其中1 個羰基與伯胺發(fā)生加成反應時會為蛋白質引入另1 個羰基[15]；同時，丙二醛分子還能通過與蛋白質分子中的半胱氨酸、組氨酸和賴氨酸等親和側鏈基團反應生成西佛堿從而導致蛋白質羰基化[23]。

2.2 蛋白質氧化對核桃蛋白粒徑分布的影響

分子大小與蛋白質高分子在溶液體系中的穩(wěn)定性密切相關[24]，蛋白質粒徑的變化會影響其表面性質[25]。丙二醛氧化對核桃蛋白粒徑分布的影響如圖2所示。由圖2可知，未經氧化處理的核桃蛋白粒徑主要分布在0～1 000 nm 范圍內，峰值出現(xiàn)在300 nm 左右；隨著丙二醛濃度從0 mmol/L 增加至0.1 mmol/L，粒徑分布向小粒徑方向偏移，說明分子粒徑減?。浑S著丙二醛濃度的進一步增加，粒徑分布明顯向大粒徑方向偏移，粒徑分布范圍變寬，粒徑較大的蛋白分子所占體積比持續(xù)增加；這與王丹丹等[26]的研究結果相一致。低濃度的氧化使蛋白質分子解離，小的可溶性聚集體斷裂成更小的小分子多肽，導致粒徑較小的蛋白質顆粒所占體積比增加；過度的氧化使核桃蛋白分子結構展開，暴露出分子內部巰基和疏水基團，并與核桃蛋白結合形成氧化聚集體，導致蛋白質粒徑增加[27]。Liu等[28]認為游離巰基氧化形成氧化聚集體可使大豆分離蛋白粒徑增加。本試驗結果表明蛋白質氧化使核桃蛋白的分子結構發(fā)生改變，進而影響蛋白質的界面性質。

圖1 氧化對核桃蛋白樣品羰基值的影響Fig.1 Effects of carbonyl content of walnut protein oxidized by malondialdehyde

圖2 核桃蛋白樣品溶液粒徑分布Fig.2 Droplet size distribution of walnut protein samples

2.3 蛋白質氧化對核桃蛋白相對分子質量分布的影響

高效液相分子排阻色譜（HPSEC）是一種反映分子分布和蛋白質聚集程度的重要方法。核桃蛋白樣品的HPSEC 結果如圖3 和表1所示。相同條件下測定的標準蛋白質校準曲線如圖3a所示。由圖3b可知，未氧化的核桃蛋白分子呈多元分散分布，3 個主要峰保留時間分別為6.0 mim（峰面積為1.89%，分子質量大于1 000 ku）；9.82 min（峰面積為34.71% ，分子質量為282 ku）和11.77 min（峰面積為63.41%，分子量為69 ku）。相對分子質量的連續(xù)分布表明，核桃蛋白是由一系列分子質量不同的蛋白質組成的。當丙二醛濃度由0 mmol/L 增加至0.1 mmol/L 時，3 個主峰的峰面積百分比減小。當丙二醛濃度達到0.1 mmol/L 時，出現(xiàn)了新的分子質量為50 ku 的峰（峰面積64.18%），這可能是由于低濃度的丙二醛氧化誘導核桃蛋白產生了低分子質量的多肽。當丙二醛濃度由0.1 mmol/L 增加到10 mmol/L 時，分子質量高于1 000 ku、282 ku 和69 ku 的峰所占面積的百分比逐漸增加，分子量為50 ku 的峰消失（圖3d～f。這一現(xiàn)象說明，隨著丙二醛濃度增加，核桃蛋白分子逐漸聚集。上述結果表明較低（≤0.1 mmol/L）濃度的丙二醛能氧化誘導核桃蛋白質形成小的多肽鏈；而隨著丙二醛濃度增加至10 mmol/L，斷開的小多肽鏈重新聚合，并且蛋白質分子發(fā)生交聯(lián)形成了更大的聚集體[16]。此結果與核桃蛋白粒徑分布結果相一致。

表1 蛋白質氧化對核桃蛋白分子質量分布的影響Table 1 Effects of molecular weight distribution of walnut protein samples oxidized by malondialdehyde

圖3 蛋白質氧化對核桃蛋白分子質量分布的影響Fig.3 Effects of molecular weight distribution of walnut protein samples oxidized by malondialdehyde

2.4 蛋白質氧化對核桃蛋白溶液Zeta 電位的影響

一般用溶液Zeta 電位反映蛋白質表面的帶電情況。蛋白質分子的界面的吸附行為與其表面電荷有很大關系，分子間存在適當斥力使它們呈現(xiàn)的分散狀態(tài)有利于界面吸附從而獲得良好的界面性質[29]。圖4 為蛋白質氧化對核桃蛋白溶液Zeta電位的影響。由圖4可知，隨著氧化程度增加，核桃蛋白溶液的Zeta 電位絕對值呈先增加后減小的趨勢。當丙二醛濃度為0.1 mmol/L 時，蛋白質溶液Zeta 電位的絕對值最大，為10.38 mV。氧化能夠改變核桃蛋白的分子結構，較低濃度的氧化使得蛋白質分子構象發(fā)生解折疊，原本包埋在分子內部的氨基酸被暴露，蛋白質表面帶電氨基酸增加，分子間的靜電排斥力增加，導致Zeta 電位的絕對值增加；過度氧化能夠改變蛋質白氨基酸殘基或空間結構，導致核桃蛋白顆粒界面性質發(fā)生變化[29]。當丙二醛濃度由0.1 mmol/L 增加至10 mmol/L 時，Zeta 電位的絕對值逐漸減小，最終導致體系穩(wěn)定性降低，這與粒徑分布的變化一致。蛋白質溶液Zeta 電位越高，分子間的靜電排斥力越大，蛋白分子越不易聚集，蛋白質分子粒徑越小。當分子之間的排斥力小于吸附力時，會導致蛋白聚集成大分子，從而影響體系穩(wěn)定性[30]。

2.5 蛋白質氧化對核桃蛋白表面張力的影響

表面張力指增加單位表面積時表面位能的增量。表面張力下降是泡沫產生和乳化的前提，下降的程度是起泡力和乳化力大小的決定因素[31]。利用表面張力儀測定核桃蛋白樣品的表面張力，結果如圖4所示，未氧化核桃蛋白的表面張力為60.47 mN/m。隨著氧化程度增加，核桃蛋白的表面張力先下降后上升。當丙二醛濃度為0.1 mmol/L時，核桃蛋白的表面張力最小，為55.64 mN/m。這是由于低濃度的氧化使蛋白分子去折疊，蛋白質分子多肽鏈展開，更多疏水基團延伸至氣相，親水基團延伸至水相，更有利于蛋白質在界面處發(fā)生變性，導致蛋白質分子的表面張力降低；過度氧化導致粒徑更大的分子聚集體形成，分子柔性降低，蛋白質表面積減小，不利于蛋白質在水-空氣界面上的吸附，導致蛋白質表面張力增加[32]。闞建全等[33]的研究發(fā)現(xiàn)蛋白質起泡力和泡沫穩(wěn)定性與表面張力減弱的速率有關，而低濃度蛋白質的乳化力和乳化穩(wěn)定性與表面張力有關。

圖4 蛋白質氧化對核桃蛋白溶液Zeta 電位的影響Fig.4 Effects of malondialdehyde oxidation on Zeta potential of walnut protein samples

圖5 蛋白質氧化對核桃蛋白樣品表面張力的影響Fig.5 Effects of malondialdehyde oxidation on surface tension of walnut protein samples

2.6 蛋白質氧化對核桃蛋白表面疏水性的影響

蛋白質分子表面疏水氨基酸殘基的分布情況，是影響蛋白質界面性質的主要因素。分子表面無疏水性氨基酸殘基或未形成較連續(xù)的疏水區(qū)域，蛋白質在界面不吸附或者吸附能力較差[1]。蛋白質分子表面疏水性氨基酸殘基的分布情況一般用表面疏水性表示。蛋白質氧化對核桃蛋白表面疏水性的影響如圖6所示。未氧化核桃蛋白的表面疏水性為453，隨著氧化程度增加，核桃蛋白表面疏水性呈先增加后降低的趨勢。當丙二醛濃度為0.1 mmol/L 時，核桃蛋白的疏水性達到最大，為476；而隨著丙二醛濃度的進一步增加，核桃蛋白的表面疏水性從476 下降至422（P＜0.05）。葉林[19]的研究表明適度氧化可使大豆蛋白的表面疏水性增加。這是由于氧化導致蛋白質分子空間結構發(fā)生改變，三級結構被打開，更多的疏水區(qū)域暴露，導致蛋白質疏水性增加[19]。然而暴露出的疏水基團隨著丙二醛濃度的增加進一步發(fā)生氧化修飾，通過疏水相互作用締合形成的蛋白分子聚集體[34]和蛋白質分子羰基化形成的羰基衍生物[35]共同作用使得核桃蛋白的表面疏水性下降。

2.7 蛋白質氧化對核桃蛋白起泡性和泡沫穩(wěn)定性的影響

作為主要的蛋白質界面性質，起泡性質一般用起泡性和泡沫穩(wěn)定性評價。起泡性是指蛋白質能降低氣液界面表面張力而幫助形成泡沫的能力[36]；泡沫穩(wěn)定性是指泡沫生成以后的持久性，即泡沫的壽命[1]。蛋白質氧化對核桃蛋白起泡性和泡沫穩(wěn)定的影響如圖7所示。未氧化核桃蛋白的起泡性和泡沫穩(wěn)定性分別為8.73%和6.30%，隨著氧化程度增加，起泡性和泡沫穩(wěn)定性均呈先增加后降低的趨勢。當丙二醛濃度為0.1 mmol/L 時，核桃蛋白的起泡性和泡沫穩(wěn)定達到最大值，分別為21.43%和17.80%。這一結果與表面張力的變化一致。蛋白質巰基氧化破壞了蛋白質分子之間的非共價鍵相互作用力，導致核桃蛋白質分子部分展開，更多內部疏水性基團遷移至蛋白表面，有利于蛋白質在水-空氣界面的快速吸附，降低表面張力，從而增強蛋白質的起泡性。并且伸入氣相的疏水性基團通過相互作用形成了更為穩(wěn)定的二維網絡結構和界面膜[37]，而伸入水相的極性基團通過水合作用減少液膜液體流失，從而增強蛋白質的泡沫穩(wěn)定性[38]。當氧化程度進一步增加，被暴露出來的疏水基團和巰基通過疏水相互作用、二硫鍵、靜電相互作用及氫鍵等重新形成更大的不溶性蛋白質分子聚集體，不利于水-空氣界面的形成以及界面膜穩(wěn)定性的維持[39]，導致蛋白質的起泡性和起泡穩(wěn)定性減弱。Wang等[40]人的研究也表明氧化會誘導大豆蛋白起泡性和起泡穩(wěn)定性發(fā)生變化。

圖6 丙二醛氧化修飾對核桃蛋白表面疏水性的影響Fig.6 Effects of malondialdehyde oxidation on hydrophobic surface of walnut protein

圖7 氧化對核桃蛋白起泡性和泡沫穩(wěn)定性的影響Fig.7 Effects of malondialdehyde oxidative on foam capacity and foam stability of walnut protein samples

3 結論

為探究蛋白質氧化對核桃蛋白界面性質的影響，本試驗采用不同濃度（0～10 mmol/L）的丙二醛替代脂質過氧化產生的活性醛氧化處理核桃蛋白，結果表明，丙二醛氧化導致核桃蛋白羰基衍生物形成，羰基含量顯著增加（P＜0.05）；低濃度（≤0.1 mmol/L）的丙二醛導致核桃蛋白粒徑、相對分子質量和表面張力減小，溶液Zeta 電位和表面疏水性增加，并使得蛋白質起泡性和起泡穩(wěn)定性增加；高濃度（＞0.1 mmol/L）的丙二醛誘導蛋白聚集體形成和蛋白質交聯(lián)，導致蛋白粒徑、相對分子質量和表面張力增加，表面疏水性和溶液Zeta 電位減小，蛋白質起泡性和泡沫穩(wěn)定性顯著下降。試驗結果說明蛋白質氧化會誘導核桃蛋白分子構象和表面活性發(fā)生改變，適當的氧化（丙二醛濃度≤0.1 mmol/L）可以改善核桃分離蛋白的界面性質；而過度氧化則會對核桃蛋白的泡沫性質等界面性質產生負面影響。因此通過控制核桃蛋白的氧化程度可以改善其乳液體系的界面特性。本研究結果為利用蛋白質起泡性等界面性質提高核桃蛋白產品質量品質以及進行工藝設計和改進提供了理論依據，但關于蛋白質氧化對油-水界面性質的影響還有待進一步研究。