微泡菌ALW1昆布多糖酶的酶學(xué)性質(zhì)及其酶解產(chǎn)物的抗氧化活性

銀小倩 梁梅芳 李鶴賓 姜澤東，2，3 倪 輝，2，3 朱艷冰，2，3*

（1 集美大學(xué)食品與生物工程學(xué)院 福建廈門361021 2 福建省食品微生物與酶工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 福建廈門361021 3 廈門南方海洋研究中心經(jīng)濟(jì)海藻資源化利用與深加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 福建廈門361021 4 廈門醫(yī)學(xué)院 福建廈門361023）

昆布多糖又稱海帶多糖、褐藻淀粉，為海洋褐藻的重要貯藏多糖，約占褐藻干重35%[1-2]。昆布多糖是一種水溶性多糖，是自然界常見的β-1，3-葡聚糖之一，含有部分β-1，6 支鏈[3]。昆布多糖及其衍生物具有廣泛的生物學(xué)活性，是一種功能性多糖，在抗腫瘤，改善血脂濃度，早中期腎衰竭防治等方面均有研究報(bào)道[4-5]。

β-1，3-葡寡糖可以提高機(jī)體免疫力[6]，調(diào)節(jié)腸道菌群[7]，用于糖尿病治療[8]，具有抗腫瘤活性[9]。酶解法生產(chǎn)β-1，3-葡寡糖特異性強(qiáng)，無副產(chǎn)物生成，被認(rèn)為是有效、安全的低聚寡糖生產(chǎn)方法。昆布多糖酶（EC 3.2.1.39）是一種專一性水解β-1，3-葡聚糖中的β-1，3 糖苷鍵的酶類[10]，它能夠?qū)⒕厶撬馍晒烟?。除了用于制備寡糖，?1，3-葡聚糖酶還可作為添加劑或生物活性多糖的改良劑應(yīng)用于飼料和釀酒工業(yè)中[11-13]。作為處理酵母細(xì)胞的工具酶，應(yīng)用于原生質(zhì)體制備、細(xì)胞融合、基因?qū)牒偷鞍踪|(zhì)提取等方面[14-15]。β-1，3-葡聚糖酶可有效提高植物的抗病能力[16]。除此之外，β-1，3-葡聚糖酶在植物生物質(zhì)降解中發(fā)揮重要作用[17]。

昆布多糖酶來源于廣泛，包括細(xì)菌、真菌、植物等，其中微生物是該酶的重要來源。目前報(bào)道的產(chǎn)昆布多糖酶的微生物主要包括強(qiáng)烈熾熱球菌（Pyrococcus furiosus）[18]、擬諾卡氏菌屬（Nocardiopsis sp.）[19]、海洋紅嗜熱菌（Rhodothermus marinus）[20]、鹽屋鏈霉菌（Streptomyces sioyaensis）[21]、海棲熱袍菌（Thermotoga maritima）[22]、食半乳聚糖卓貝爾氏黃桿菌（Zobellia galactanivorans）[2]、馬氏鏈霉菌（Streptomyces matensis）[23]、米黑根毛霉（Rhizomucor miehei）[24]等。作者以腐爛海帶為樣品，從中篩選分離出1 株微泡菌（Microbulbifer sp.ALW1）[25]，該菌株為產(chǎn)昆布多糖酶微生物。本文研究微泡菌ALW1 昆布多糖酶粗酶的酶學(xué)性質(zhì)及酶解產(chǎn)物的抗氧化活性，為昆布多糖酶和昆布低聚糖的進(jìn)一步開發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

細(xì)菌學(xué)蛋白胨、LB 瓊脂，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；酵母粉，生工生物工程（上海）股份有限公司；昆布多糖，源葉生物；其它試劑均為分析純產(chǎn)品。

培養(yǎng)基：（1）種子培養(yǎng)基：0.5% 蛋白胨，0.1%酵母粉，0.2% K2HPO4·3H2O，0.1% MgSO4·7H2O，3% NaCl，0.5%（NH4）2SO4，0.001% FeSO4·7H2O，pH 7.5；（2）發(fā)酵培養(yǎng)基：0.5% 昆布多糖，0.2%K2HPO4·3H2O，0.1% MgSO4·7H2O，3% NaCl，0.5%（NH4）2SO4，0.001% FeSO4·7H2O，pH 7.5。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-2FD 型雙人單面凈化工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司；ALP 全自動(dòng)滅菌鍋，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；ZHWY-2102/ZWY-200D雙層全溫度培養(yǎng)搖床，上海智城分析儀器制造有限公司；冷凍高速離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf 公司；FE20 pH 計(jì)，梅特勒-托利多稱重設(shè)備系統(tǒng)有限公司；恒溫水浴鍋，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；PS301F 電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器；Epoch2T 微量酶標(biāo)儀，美國(guó)伯騰公司；MLX201 小型臺(tái)式高速離心機(jī)，美國(guó)精騏公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 昆布多糖酶粗酶液的制備 菌株接種于種子培養(yǎng)基，25 ℃、180 r/min 搖動(dòng)培養(yǎng)30 h。以2%的接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，25 ℃、180 r/min 發(fā)酵72 h。發(fā)酵液于4 ℃、6 000 r/min 離心10 min，取上清液，獲得昆布多糖粗酶液，用于后續(xù)的酶學(xué)性質(zhì)研究及酶解產(chǎn)物制備。

1.3.2 昆布多糖酶的活力測(cè)定 取5 μL 含0.5%昆布多糖的50 mmol/L Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液（pH 8.0），加入395 μL 昆布多糖酶，35 ℃反應(yīng)15 min 后，沸水浴中滅活2 min，加入400 μL DNS 試劑，沸水浴10 min，流水冷卻至室溫后于波長(zhǎng)540 nm 處測(cè)定反應(yīng)液的吸光值。通過制作葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線確定還原糖含量，由此計(jì)算昆布多糖酶的活力。昆布多糖酶活力定義為：在上述條件下，每分鐘水解底物產(chǎn)生1 μmol 還原糖（以葡萄糖計(jì)）所需的酶量為1 個(gè)酶活力單位（U）。

1.3.3 昆布多糖酶的酶學(xué)性質(zhì)研究

1.3.3.1 溫度對(duì)昆布多糖酶活性的影響 分別在不同溫度下測(cè)定昆布多糖酶酶活力，將最高酶活力定義為100%，研究酶的最適反應(yīng)溫度。將昆布多糖酶分別在不同溫度中溫浴1 h 后，測(cè)定酶的殘余活力，以未經(jīng)處理的酶活力為100%，研究酶的溫度穩(wěn)定性。

1.3.3.2 pH 對(duì)昆布多糖酶活性的影響 在不同pH 緩沖液中測(cè)定昆布多糖酶的活力，將最高酶活力定義為100%，研究酶的最適反應(yīng)pH。所用緩沖液為50 mmol/L Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液（pH 6.0～8.0），50 mmol/L Tris-HCl 緩沖液（pH 8.0～9.0），50 mmol/L Gly-NaOH 緩沖液（pH 9.0～11.0）。將昆布多糖酶分別置于不同pH 緩沖液中25 ℃溫浴1 h 后，測(cè)定酶的殘余活力，以未經(jīng)處理的酶活力為100%，研究酶的pH 穩(wěn)定性。

1.3.3.3 金屬離子對(duì)昆布多糖酶活性的影響 分別添加終濃度為1 mmol/L 和10 mmol/L 的不同金屬離子，25 ℃溫浴1 h 后，測(cè)定昆布多糖酶的活力，以不加金屬離子的酶活力為100%，研究金屬離子對(duì)酶活性的影響。

1.3.3.4 昆布多糖酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定 分別配制質(zhì)量濃度為0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mg/mL 的昆布多糖溶液，將5 μL 的酶液與395 μL 不同底物濃度的昆布多糖溶液混合，分別于最適溫度35 ℃下溫浴15 min 后取出，于沸水浴滅活2 min，加400 μL DNS，沸水浴10 min，測(cè)定酶活力。

1.3.4 昆布多糖酶酶解產(chǎn)物的制備 在50 mmol/L Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液（pH 8.0）中配制含2 mg/mL 昆布多糖的底物溶液，每100 mL 底物溶液中加入650 U 昆布多糖酶，混勻，在35 ℃條件下進(jìn)行反應(yīng)，每隔1 h 取樣一次，測(cè)定其還原糖的釋放量，反應(yīng)10 h 后，將100 U 昆布多糖酶加入到反應(yīng)混合物中，并在相同溫度下反應(yīng)2 h，經(jīng)測(cè)定，此時(shí)還原糖的含量沒有改變。沸水浴加熱10 min 滅活酶蛋白，完全冷卻沉降，10 000 r/min 離心15 min，除去不溶物，將酶解產(chǎn)物冷凍干燥至粉末后備用。

1.3.5 酶解產(chǎn)物的抗氧化活性 參考Wu等[26]的方法，對(duì)酶解產(chǎn)物清除ABTS 自由基、·OH 自由基的能力以及酶解產(chǎn)物的還原能力進(jìn)行測(cè)定。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

每組試驗(yàn)數(shù)據(jù)設(shè)置3 次平行試驗(yàn)，應(yīng)用Excel軟件計(jì)算平均值，SPSS Statistics17.0 軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行差異顯著性分析（P<0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度對(duì)昆布多糖酶活性的影響

在不同溫度下測(cè)定菌株ALW1 昆布多糖酶的活力，結(jié)果（圖1a）顯示，昆布多糖酶的最適反應(yīng)溫度為45 ℃。酶的溫度穩(wěn)定性分析（圖1b）顯示，昆布多糖酶在35 ℃下較為穩(wěn)定，溫浴1 h 仍具有約80%的相對(duì)酶活力；在40 ℃下溫浴1 h，酶仍具有70%以上的相對(duì)酶活力；在50 ℃下處理1 h，酶活力基本喪失，說明高溫對(duì)該酶的穩(wěn)定性影響較大。

圖1 溫度對(duì)昆布多糖酶活性（a）及熱穩(wěn)定性（b）的影響Fig.1 Effects of temperature on activity（a）and thermostability（b）of laminarinase

2.2 pH 對(duì)昆布多糖酶活性的影響

圖2 pH 對(duì)昆布多糖酶活性（a）及pH 穩(wěn)定性（b）的影響Fig.2 Effects of pH on activity（a）and thermostability（b）of laminarinase

在不同pH 條件下測(cè)定昆布多糖酶的活力，結(jié)果（圖2a）顯示，昆布多糖酶在pH=5.5 時(shí)，酶的活性最高，因此昆布多糖酶的最適pH 為5.5。酶的pH 穩(wěn)定性分析（圖2b）顯示，昆布多糖酶在pH 6.0～8.0 條件下較為穩(wěn)定，處理1 h 仍然具有60%以上的相對(duì)酶活力；當(dāng)pH<6.0，以及pH>8.0 時(shí)，酶活力損失較大，較不穩(wěn)定；當(dāng)pH<4.0，以及pH>10.0 時(shí)，酶幾乎完全失活，說明偏酸或偏堿的環(huán)境都不利于酶活力的保持。

2.3 金屬離子對(duì)昆布多糖酶活性的影響

金屬離子對(duì)昆布多糖酶活性的影響結(jié)果如表1所示，Na+對(duì)酶活力起促進(jìn)作用；K+，F(xiàn)e2+，Cu2+，Co2+，Mn2+，Ba2+，Cd2+和Zn2+對(duì)昆布多糖酶具有不同程度的抑制作用，其中Zn2+的抑制作用最強(qiáng)；Ca2+和Mg2+在低濃度（1 mmol/L）時(shí)對(duì)酶活力沒有影響，在高濃度（10 mmol/L）時(shí)對(duì)酶有抑制作用。

表1 金屬離子對(duì)昆布多糖酶活性的影響Table 1 Effects of metal ions on the activity of laminarinase

2.4 昆布多糖酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)

通過測(cè)定不同底物濃度下的反應(yīng)速度，可以確定酶催化最大反應(yīng)速率Vmax、米氏方程底物親和常數(shù)Km。如圖3所示，以1/V 為縱坐標(biāo)，1/[S]為橫坐標(biāo)，采用Linewaeaver-Burk 作圖法，可得：酶的Km為0.612 mg/mL，Vmax為4.902 U/mg。

圖3 昆布多糖酶Linewaeaver-Burk 雙倒數(shù)擬合曲線Fig.3 Linewaeaver-Burk plot of laminarinase

2.5 昆布多糖酶酶解產(chǎn)物的抗氧化活性

2.5.1 酶解產(chǎn)物對(duì)ABTS 自由基的清除能力 菌株ALW1 昆布多糖酶的酶解產(chǎn)物對(duì)ABTS 自由基的清除結(jié)果如圖4所示，在分析的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，酶解產(chǎn)物對(duì)ABTS 自由基的清除能力隨其質(zhì)量濃度的增加而增強(qiáng)，當(dāng)質(zhì)量濃度為15 mg/mL時(shí)，其清除率約為50%。由此可見，菌株ALW1 昆布多糖酶的酶解產(chǎn)物對(duì)ABTS 自由基具有一定的清除能力，對(duì)該自由基的半抑制劑量IC50為15.2 mg/mL。

圖4 酶解產(chǎn)物對(duì)ABTS 自由基的清除作用Fig.4 ABTS radical scavenging activity of enzymatic hydrolysates

2.5.2 酶解產(chǎn)物對(duì)·OH 自由基的清除能力 菌株ALW1 昆布多糖酶的酶解產(chǎn)物對(duì)·OH 自由基的清除結(jié)果如圖5所示，酶解產(chǎn)物對(duì)·OH 自由基的清除能力隨著其質(zhì)量濃度的增大而增強(qiáng)。當(dāng)質(zhì)量濃度大于3 mg/mL 時(shí)，清除能力增強(qiáng)變緩，當(dāng)質(zhì)量濃度為5 mg/mL 時(shí)，清除率達(dá)到了80%。由此可見，菌株ALW1 昆布多糖酶的酶解產(chǎn)物對(duì)·OH 自由基具有一定的清除能力，對(duì)該自由基的半抑制劑量IC50為1.7 mg/mL。

2.5.3 酶解產(chǎn)物的還原能力 菌株ALW1 昆布多糖酶的酶解產(chǎn)物的還原能力如圖6所示，在分析的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，酶解產(chǎn)物的還原能力隨其質(zhì)量濃度的增大而增強(qiáng)，其還原能力與質(zhì)量濃度基本成正比關(guān)系，表明菌株ALW1 昆布多糖酶的酶解產(chǎn)物具有一定的還原能力。

圖5 酶解產(chǎn)物對(duì)·OH 自由基的清除作用Fig.5 ·OH radical scavenging activity of enzymatic hydrolysates

圖6 酶解產(chǎn)物的還原能力Fig.6 Reducing capacity of enzymatic hydrolysates

3 結(jié)論

通過對(duì)微泡菌ALW1 昆布多糖酶一系列酶學(xué)性質(zhì)的研究可得：昆布多糖酶的最適反應(yīng)溫度為45 ℃，在35 ℃下較為穩(wěn)定；酶的最適反應(yīng)pH 為5.5，在pH 6.0～8.0 范圍內(nèi)較為穩(wěn)定。金屬離子Na+對(duì)酶活力起促進(jìn)作用，隨著Na+濃度的增大，對(duì)酶活力的促進(jìn)作用增強(qiáng)；Fe2+，Cd2+和Zn2+對(duì)昆布多糖酶有強(qiáng)烈的抑制作用。昆布多糖酶的酶解產(chǎn)物對(duì)ABTS 自由基和·OH 自由基的半抑制劑量IC50分別為15.2 mg/mL 和1.7 mg/mL，此外酶解產(chǎn)物具有較強(qiáng)的還原能力。因此，海洋細(xì)菌ALW1 昆布多糖酶的酶解產(chǎn)物具有抗氧化活性。