降解嗜水氣單胞菌群體感應(yīng)AHLs信號分子的乳酸菌篩選及淬滅作用

崔天琦 呂欣然 孫夢桐 馬國涵 白鳳翎 杜 宏 勵建榮

（渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心遼寧省高等學(xué)校生鮮食品產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院 遼寧錦州121013）

細(xì)菌性疾病是阻礙水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)發(fā)展的關(guān)鍵性問題之一，應(yīng)用抗生素控制細(xì)菌性感染是許多國家防治水產(chǎn)養(yǎng)殖動物疾病的主要方法[1]，然而大量使用抗生素導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性，與抗生素使用劑量和頻率之間形成惡性循環(huán)[2]。引起水產(chǎn)養(yǎng)殖經(jīng)濟魚類細(xì)菌性感染的病原體多為水體生態(tài)環(huán)境中的革蘭氏陰性菌，通常通過群體感應(yīng)（Quorum sensing，QS）現(xiàn)象如形成生物膜、毒力因子和遷移能力發(fā)揮致病作用[3]。嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）是一種導(dǎo)致人-獸-水生動物共患病的革蘭氏陰性條件致病菌，可引起鯉魚、金錢魚、黃鱔和大菱鲆等多種水生動物出現(xiàn)敗血癥[4-5]。應(yīng)用群體感應(yīng)抑制劑（Quorum sensing inhibitor，QSIs）和群體感應(yīng)淬滅作用控制細(xì)菌性疾病是目前一種生態(tài)友好型策略[6]。

大多革蘭氏陰性菌QS是由AHLs 信號分子介導(dǎo)的。阻斷、干擾和破壞QS 的機制主要由2種[7]：一是利用干擾AHLs 信號分子的化合物，即QSIs阻斷細(xì)胞間分子信息傳遞，例如紅海藻（Delisea pulchra）合成的鹵代呋喃酮[8]；二是利用群體感應(yīng)淬滅酶降解或轉(zhuǎn)化AHLs 信號分子，使其失去信息傳遞功能，稱為群體感應(yīng)淬滅作用（Quorum quenching，QQ）[9]。群體感應(yīng)淬滅酶主要包括AHLs-內(nèi)酯酶、AHLs-?；D(zhuǎn)移酶和氧化還原酶3種類型[10-11]。研究表明海洋生態(tài)環(huán)境中放線菌（Actino bacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、厚壁菌門（Firmicutes）和變形菌門（Proteobacteria）的微生物類群可以產(chǎn)生對AHLs 具有淬滅作用的酶[12]。Romero等[13]證明海洋細(xì)菌 黃桿菌屬（Tenacibaculum sp.）20J 的粗提物對魚類病原性弧菌遲緩愛德華氏菌（Edwardsiella tarda）AHLs 信號分子具有淬滅活性；Kiymaci等[14]從新生兒糞便中分離出潛在的益生菌菌株乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）M7 中的乳酸，檢測其對 銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）QS 信號分子和某些毒力因子的抑制作用，結(jié)果顯示乳酸對短鏈HSL的產(chǎn)生、群集泳動、蛋白酶、綠膿菌素和生物膜形成具有一定的抑制作用；Pattnaik等[15]利用真菌大豆莖潰瘍病菌（Diaporthe phaseolorum）SSP12 抑制了銅綠假單胞菌PAO1 群體感應(yīng)調(diào)控的毒力因子及生物膜的形成。Torres等[16]從雙殼貝類孵化場分離的450種菌株中篩選出具有QQ 活性的菌株——極地寡營養(yǎng)細(xì)菌（Alteromonas stellipolaris）PQQ-42，其能降解多種AHLs，在體外共培養(yǎng)試驗中抑制了4種病原性弧菌AHLs 的積累，并抑制弧菌種類中蛋白酶和幾丁質(zhì)酶的產(chǎn)生以及群集泳動性。

乳酸菌是一類具有拮抗作用和益生功能的生態(tài)友好型細(xì)菌，主要存在于傳統(tǒng)發(fā)酵食品、動物腸道及土壤淤泥等自然環(huán)境中[17]。以乳酸鏈球菌素為代表的乳酸菌生物制劑具有安全高效、綠色無殘留等特點，已廣泛應(yīng)用于乳制品、肉制品和水產(chǎn)品等的防腐保鮮[18]。乳酸菌是否具有淬滅革蘭氏陰性菌群體感應(yīng)的作用，以及其能否作為微生物源性QSIs 應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖致病菌的防控，在國內(nèi)外研究中鮮見報道。

本文從傳統(tǒng)發(fā)酵食品以及海水魚腸道中分離的乳酸菌中篩選對嗜水氣單胞菌群體感應(yīng)AHLs信號分子具有降解作用的菌株，探究乳酸菌對革蘭氏陰性菌群體感應(yīng)的淬滅作用機制，對利用活性乳酸菌制劑防控水產(chǎn)養(yǎng)殖病原菌的感染具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株及培養(yǎng)條件 乳酸菌菌株：傳統(tǒng)發(fā)酵食品和海水魚腸道中篩選得到156 株乳酸菌菌株，其中，來源于遼寧錦州酵頭、遼寧朝陽咸菜等傳統(tǒng)發(fā)酵食品的乳酸菌菌株有124 株，來源于牙鲆、帶魚等魚類腸道的乳酸菌32 株。

指示菌株：紫色桿菌（Chromobacterium violaceum）CV026 為紫色桿菌ATCC 31532 的mini-Tn5 突變體，自身不產(chǎn)生N-?；?高絲氨酸內(nèi)酯類信號分子（AHLs），僅當(dāng)外源 AHLs 存在時，菌株可產(chǎn)生紫色菌素，可檢測到C4-HSL，C8-HSL的信號分子。

目標(biāo)菌株：嗜水氣單胞菌LY-2，分離自腐敗大菱鲆體表。

以上菌株均為本實驗室保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基和試劑 MRS 培養(yǎng)基、LB 培養(yǎng)基、DNA 酶培養(yǎng)基、酪蛋白培養(yǎng)基、血瓊脂基本培養(yǎng)基、無菌脫纖維羊血，北京奧博星生物技術(shù)有限公司；乳酸菌生化鑒定管，杭州天和微生物試劑有限公司；卡那霉素、細(xì)菌基因組DNA 快速抽提試劑盒、DNA marker-D、Taq PCR Master mix，上海生工生物工程有限公司；C4-HSL、C6-HSL 信號分子標(biāo)品，美國Sigma 公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DL-CJ-2N 超級潔凈工作臺，北京市東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；SPX-250 生化培養(yǎng)箱，寧波海曙賽福實驗儀器廠；IKA Vortex GENIUS 3 振蕩器，德國IKA 公司；5804R 高速冷凍離心機、ABI stepone plus PCR 儀，德國Eppendorf 公司；DYY-8C 電泳儀，北京市六一儀器廠；Quantity One 凝膠成像系統(tǒng)，美國Bio-Rad 公司；MS105UD電子分析天平，瑞士梅特勒-托利多有限公司；Imark 酶標(biāo)儀，美國BIO-RAD；GI54DS 立式高壓蒸汽滅菌鍋，致微（廈門）儀器有限公司；RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠；Labconco Free Zone 2.5 臺式真空冷凍干燥機，美國LABCONCO；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀7890A-5975C，美國安捷倫公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌種活化及嗜水氣單胞菌AHLs 粗提物的制備 乳酸菌接種于MRS 液體培養(yǎng)基中，以2.0%的接種量傳代培養(yǎng)2 次后于37 ℃培養(yǎng)12 h。嗜水氣單胞菌和紫色桿菌分別接種于LB 液體培養(yǎng)基中，傳代培養(yǎng)2 次后于30 ℃培養(yǎng)12 h；取4 mL 2 代紫色桿菌以及200 μL 卡那霉素于200 mL LB培養(yǎng)基中，于30 ℃培養(yǎng)24 h，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

將活化后的嗜水氣單胞菌于4 ℃，10 000 r/min 條件下離心5 min 得上清液，用0.45 μm 濾膜過濾獲得嗜水氣單胞菌無細(xì)胞上清液（Cell free supernatants，CFS），4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。取嗜水氣單胞菌CFS 100 mL 置于250 mL 分液漏斗中，將含有0.01%冰醋酸的等量乙酸乙酯分5 次加入萃取，加入溶劑后沿同一方向緩慢震蕩后靜置，待分層明顯時收集乳化層置于三角瓶中。將5 次萃取液合并，在45 ℃，120 r/min 條件下真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至有機溶劑氣味消失，將殘留液轉(zhuǎn)存至無菌1.5 mL 離心管中，用體積分?jǐn)?shù)為70%的甲醇懸浮，置于-18 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 降解嗜水氣單胞菌AHLs 乳酸菌的初篩采用96 孔微量板法測定乳酸菌菌株對嗜水氣單胞菌AHLs 的降解活性。取10.0 μL 嗜水氣單胞菌AHLs 粗提物加入到乳酸菌2 代培養(yǎng)物中（調(diào)節(jié)pH 7.0），30 ℃條件下培養(yǎng)24 h。取24 h 培養(yǎng)物調(diào)節(jié)pH 至7.0，于4 ℃，10 000 r/min 條件下離心5 min 后取培養(yǎng)物上清液，備用。

將LB 瓊脂加到96 微孔板的孔中并使其干燥，將培養(yǎng)物上清液在軟瓊脂表面上點樣，頂層用100 μL 含有紫色桿菌（體積比5∶1）的LB 軟瓊脂覆蓋，30 ℃條件下培養(yǎng)24 h。將相同量的嗜水氣單胞菌AHLs 加入到無細(xì)胞MRS 液體培養(yǎng)基中，并按相同條件培養(yǎng)并點樣在微孔板上，作為陰性對照。

1.3.3 降解嗜水氣單胞菌AHLs 乳酸菌的復(fù)篩采用瓊脂平板擴散法對具有降解活性的初篩菌株復(fù)篩。取10.0 μL 嗜水氣單胞菌AHLs 粗提物添加到2 代乳酸菌培養(yǎng)物中（調(diào)節(jié)pH 7.0），30 ℃條件下培養(yǎng)24 h。將培養(yǎng)物于4 ℃，10 000 r/min 條件下離心5 min，獲得培養(yǎng)物上清液，備用。

取2.0 mL 紫色桿菌與25.0 mL LB 瓊脂混勻，倒入底層鋪有素瓊脂的平板中，用牛津杯打孔，在孔內(nèi)加入180 μL 培養(yǎng)物上清液，于30 ℃條件下旋轉(zhuǎn)振蕩培養(yǎng)24 h，測量孔周圍出現(xiàn)的紫色暈圈直徑。將相同量嗜水氣單胞菌AHLs 加入到1.0 mL 無細(xì)胞MRS 液體培養(yǎng)基中，與按相同條件培養(yǎng)并加入到牛津杯孔內(nèi)，作為陰性對照。乳酸菌對嗜水氣單胞菌AHLs 降解率按式（1）計算：

式中，D（對照）——對照組紫色圈直徑，mm；D（QSI）——乳酸菌處理組紫色圈直徑，mm。

1.3.4 乳酸菌粗提物的制備 取乳酸菌CFS 100 mL 于250 mL 分液漏斗中，將等量乙酸乙酯分5次加入萃取，加入溶劑后沿同一方向緩慢振蕩后靜置，待分層明顯時收集乳化層置于三角瓶中。將5 次萃取液合并，于45 ℃，120 r/min 條件下真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至有機溶劑氣味消失，殘留液轉(zhuǎn)存至無菌錐形瓶中，真空冷凍干燥制成粉末，置于-18 ℃冰箱備用。

1.3.5 AHLs 降解活性的測定

1.3.5.1 樣品制備 采用體積分?jǐn)?shù)為70%的甲醇將C4-HSL 和C6-HSL 信號分子標(biāo)品配制成200 μg/L 的溶液，備用。

乳酸菌粗提物和嗜水氣單胞菌上清液的共培養(yǎng)物按1.3.1 節(jié)步驟萃取AHLs 信號分子，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)的殘留液轉(zhuǎn)存至無菌1.5 mL 離心管中，用體積分?jǐn)?shù)為70%的甲醇懸浮，置于-18 ℃冰箱保存。樣品及溶劑均經(jīng)0.45 μm 有機濾膜過濾處理。

1.3.5.2 乳酸菌降解AHLs 活性的分析 采用安捷倫Agilent 7890A/5975C 進(jìn)行GC-MS 分析，氣相色譜條件：色譜柱為Agilent HP-5MS 石英毛細(xì)管柱（30 μm×250 μm×0.25μm）；載氣為高純氦氣，流速為1.0 mL/min；進(jìn)樣口溫度為200 ℃；傳輸線溫度為280 ℃。升溫程序采用3 階段升溫，第1階段：初溫150 ℃，溶劑保留時間為3 min，以10℃/min 的升溫速率升到220 ℃，運行時間7 min；第2 階段：以5 ℃/min 的升溫速率升到250 ℃，運行時間6 min；第3 階段：以0.5 ℃/min 的升溫速率升到252.5 ℃，運行時間5 min。進(jìn)樣量為1.0 μL，分流進(jìn)樣，分流比50：1，運行總時間18 min。質(zhì)譜條件：電子能量為70 eV，離子源溫度為230 ℃，四極桿溫度為150 ℃。掃描方式為全掃描模式m/z 15～800 和選擇離子檢測（SIM）模式m/z 143。

1.3.6 乳酸菌QQ 酶的鑒定 參照Romero等[13]的方法稍作修改。將嗜水氣單胞菌AHLs 和乳酸菌培養(yǎng)物在4 ℃，10 000 r/min 條件下離心5 min，將上清液用1.0 mol/L HCl 調(diào)節(jié)pH 至2.0，于30 ℃條件下孵育24 h，采用瓊脂平板擴散法進(jìn)行檢測。

1.3.7 QQ 活性位置的確定 為確定乳酸菌菌株的QS AHLs 降解活性位置，參照Torres等[16]的方法稍作修改。采用具有AHLs 降解活性菌株24 h培養(yǎng)物的CFS 和粗細(xì)胞提取物（Crude cell extract，CCE）分析降解活性位置。將15.0 mL 乳酸菌的過夜培養(yǎng)物于4 ℃，10 000 r/min 條件下離心5 min，獲得培養(yǎng)物上清液，經(jīng)0.45 μm 過濾器過濾獲得CES，于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

將乳酸菌沉淀物用15.0 mL pH 6.5 的PBS洗滌，加5.0 mL 相同緩沖液重懸，在冷水浴中間歇超聲（35 kHz）處理5 min，于4 ℃，10 000 r/min條件下離心30 min，獲得的CCE 經(jīng)0.45 μm 過濾器過濾后，于4 ℃冰箱貯存。

在1.0 mL CFS 和1.0 mL CCE 中分別添加10.0 μL 嗜水氣單胞菌AHLs 粗提物，測定乳酸菌CFS 和CCE 對嗜水氣單胞菌AHLs 的降解活性。在25 ℃，150 r/min 條件下旋轉(zhuǎn)振蕩培養(yǎng)24 h，采用瓊脂擴散法測定嗜水氣單胞菌粗提物中AHLs剩余量。

1.3.8 乳酸菌粗提物對嗜水氣單胞菌和紫色桿菌的MIC 測定 采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器將乙酸乙酯萃取后的乳酸菌粗提物蒸發(fā)至無乙酸乙酯氣味，真空冷凍干燥制成粉末，于-18 ℃冰箱備用。用LB 液體培養(yǎng)基將嗜水氣單胞菌3 代培養(yǎng)物稀釋至106 CFU/mL 后，分別加入乳酸菌粗提物粉末至終質(zhì)量濃度分別為16.0，12.0，8.0，6.0，4.0，2.0，0 mg/mL。以添加5.0 mL 不同質(zhì)量濃度乳酸菌粗提物的處理組為試驗組，以不加粗提物的LB 培養(yǎng)基為對照組，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h。通過肉眼觀察無渾濁現(xiàn)象的試管確定MIC，每組重復(fù)3 次。

1.3.9 亞MIC 水平乳酸菌粗提物對嗜水氣單胞菌生長的影響 將嗜水氣單胞菌用LB 肉湯稀釋成106CFU/mL 菌懸液。將190 μL 菌懸液加入96孔板中，再分別加入10.0 μL 的0.25 MIC，0.50 MIC，0.75 MIC 乳酸菌粗提物，以LB 培養(yǎng)基作陰性對照，30 ℃培養(yǎng)24 h，每隔2 h 在波長595 nm處測定OD 值。

1.3.10 亞MIC 水平乳酸菌粗提物對紫色桿菌紫色桿菌素的降解 取0.25 MIC，0.50 MIC，0.75 MIC 乳酸菌粗提物和嗜水氣單胞菌共培養(yǎng)物的上清液，采用瓊脂擴散法初步檢測其降解活性。

參照Rahman等[20]的方法稍作修改。將紫色桿菌培養(yǎng)物分別接種到0.25 MIC，0.50 MIC，0.75 MIC 乳酸菌粗提物和嗜水氣單胞菌共培養(yǎng)物中，孵育24 h。將培養(yǎng)物在13 000 r/min 下離心10 min 沉淀不溶性紫色桿菌素。取沉淀物重懸于二甲基亞砜中，震蕩30 s 使紫色桿菌素完全溶解，13 000 r/min 離心10 min 除去細(xì)菌細(xì)胞。利用酶標(biāo)儀在波長585 nm 處測量上清液吸光度。以紫色桿菌和嗜水氣單胞菌培養(yǎng)物作為陰性對照。按式（2）計算降解率：

式 中，ODcontrol——對照組在OD585nm值；ODQSI——乳酸菌處理組OD585nm值。

1.3.11 乳酸菌粗提物對嗜水氣單胞菌群體感應(yīng)表型的影響 將0.25 MIC，0.50 MIC，0.75 MIC 乳酸菌粗提物和嗜水氣單胞菌的共培養(yǎng)物上清液分別點樣到酪蛋白培養(yǎng)基、DNA 酶瓊脂培養(yǎng)基、含體積分?jǐn)?shù)1.0%吐溫80 的LB 瓊脂、含質(zhì)量比1.0%淀粉的LB 瓊脂、血液瓊脂培養(yǎng)基、群集和泳動培養(yǎng)基表面的濾紙片上，30 ℃培養(yǎng)24 h 后觀察乳酸菌粗提物對嗜水氣單胞菌中蛋白酶、DNA 酶、脂肪酶、淀粉酶、溶血性、群集和泳動現(xiàn)象的作用結(jié)果。同時MRS 液體培養(yǎng)基加入相同量的嗜水氣單胞菌上清液作陰性對照。

1.3.12 乳酸菌菌株鑒定

1.3.12.1 生理生化反應(yīng) 挑選對嗜水氣單胞菌群體感應(yīng)AHLs 信號分子具有降解作用的乳酸菌菌株，參照文獻(xiàn)[21-23]進(jìn)行菌株生理生化反應(yīng)。

1.3.12.2 16S rRNA 序列分析 吸取1.0 mL 乳酸菌菌株12 h 培養(yǎng)物上清液加到1.5 mL EP 管中，12 000 r/min 離心5 min，采用DNA 快速抽提試劑盒提取菌株DNA，以16S rDNA 通用引物進(jìn)行PCR 擴增。正向引物為27F（5’-AGAGTTTGATC CTGGCTCAG-3’），反向引物為1492R（5’-TACG GYTACCTTTGTTACGACTT-3’），引物由上海生工生物技術(shù)公司合成。

PCR 擴增反應(yīng)體系為DNA 模板1.0 μL，Taq PCR Master mix 12.5 μL，ddH2O 9.5 μL，上游引物1.0 μL，下游引物1.0 μL，總體積25 μL。PCR擴增反應(yīng)程序：94 ℃，預(yù)變性2 min；94 ℃，變性1 min；60 ℃，退火1 min；72 ℃，延伸90 s；72 ℃，保持10 min；循環(huán)30 次，4 ℃保溫。

PCR 產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳，觀察凝膠成像系統(tǒng)的擴增效果并照相。將擴增成功的PCR產(chǎn)物送至上海生物工程股份有限公司測序。測序結(jié)果經(jīng)校對后與NCBI 上Genebank 數(shù)據(jù)庫中己有序列進(jìn)行 BLAST 比對分析，運用MEGA 5.0軟件構(gòu)建乳酸菌菌株系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

1.3.13 數(shù)據(jù)處理 采用SPSS 22.0 對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，數(shù)據(jù)平行3 次，采用Origin 7.5制圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 降解嗜水氣單胞菌AHLs 乳酸菌的初篩

以紫色桿菌為生物傳感器，采用96 孔微量板法篩選降解嗜水氣單胞菌AHLs 的結(jié)果如圖1所示，156 株乳酸菌中有56 株不產(chǎn)生紫色或產(chǎn)生量遠(yuǎn)小于對照組，表明這些菌株具有降解AHLs 活性，初篩率為35.90%。

圖1 降解嗜水氣單胞菌AHLs 乳酸菌菌株的初篩結(jié)果Fig.1 Primary screening of lactic acid bacteria strains degrading A.hydrophila AHLs

2.2 降解嗜水氣單胞菌AHLs 乳酸菌的復(fù)篩

采用瓊脂擴散法從初篩菌株中復(fù)篩降解活性較強的乳酸菌。由表1可知，來源于內(nèi)蒙古寧城酸辣椒和安徽績溪酸菜的菌株NNL 2-5 和AJS 3-4 的降解率分別為43.71%和46.19%；來源于遼寧大連腌黃瓜的菌株DLH 513 和遼寧沈陽酸湯面的菌株STM 1-5-4 的降解率分別為 53.12%和71.11%；來源于遼寧錦州渤海牙鲆腸道的菌株YP 4-1-1 幾乎無紫色暈圈產(chǎn)生，表明其降解活性最強，接近100%。從結(jié)果可以看出不同來源的乳酸菌降解AHLs 活性差異性很大，選擇菌株YP 4-1-1 進(jìn)行后續(xù)的淬滅作用研究。

表1 降解嗜水氣單胞菌AHLs 乳酸菌菌株的復(fù)篩結(jié)果Table 1 Re-screening of lactic acid bacteria strains degrading A.hydrophila AHLs

2.3 YP 4-1-1 降解嗜水氣單胞菌AHLs 活性

采用GC-MS 測定菌株YP 4-1-1 粗提物對嗜水氣單胞菌AHLs 信號分子降解活性。由表2可知，YP 4-1-1 粗提物對C4-HSL 和C6-HSL2類分子的降解率分別為98.31%和81.81%，說明其對C4-HSL 的降解活性顯著高C6-HSL。介導(dǎo)嗜水氣單胞菌群體感應(yīng)的AHLs 信號分子由多種成分構(gòu)成，而對C4-HSL 和C6-HSL2類主要分子的降解作用基本可反映菌株YP 4-1-1 的降解作用，該結(jié)果與瓊脂擴散法基本一致，后續(xù)試驗均選擇YP 4-1-1 進(jìn)行。

表2 YP 4-1-1 粗提物對嗜水氣單胞菌AHLs 信號分子的降解作用Table 2 Degradation of A.hydrophila AHLs signaling molecules by YP 4-1-1 crude extracts

2.4 YP 4-1-1 群體感應(yīng)淬滅酶及其活性位置分析

YP 4-1-1 群體感應(yīng)淬滅酶及其活性位置分析結(jié)果見圖2。酸性條件將會導(dǎo)致AHLs 內(nèi)酯環(huán)在其先前被內(nèi)酯酶打開的情況下發(fā)生自身重組，其中由圖2a可知，在pH 7.0 和pH 2.0 下，與對照組相比，YP 4-1-1 處理組皆無紫色暈圈產(chǎn)生，并且培養(yǎng)物酸化后AHLs 濃度沒有恢復(fù)即無紫色圈產(chǎn)生，說明pH 2.0 時酶的活性沒有恢復(fù)，表明具有降解作用的不是AHLs-內(nèi)酯酶，可能是AHLs-?；D(zhuǎn)移酶或氧化還原酶。由圖2b可知，菌株YP 4-1-1 的CCE 對嗜水氣單胞菌AHLs 具有降解活性，而菌株YP 4-1-1 的CFS 和陰性對照MRS 培養(yǎng)基相比，具有一定降解活性，但不顯著，表明在CCE可溶性部分中存在具有QQ 活性的酶。

圖2 YP 4-1-1 的群體感應(yīng)淬滅酶及其活性位置分析Fig.2 Quorum quenching enzyme and its active position of YP 4-1-1 analysis

2.5 YP 4-1-1 粗提物對嗜水氣單胞菌和紫色桿菌的MIC

菌株YP 4-1-1 粗提物對嗜水氣單胞菌和紫色桿菌的MIC 分別為2.0 mg/mL 和4.0 mg/mL。為了不影響菌株生長，菌株YP 4-1-1 粗提物選擇3個亞MIC 即0.25 MIC，0.50 MIC，0.75 MIC 進(jìn)行后續(xù)研究。

2.6 嗜水氣單胞菌和紫色桿菌的生長曲線分析

由圖3可知，與MRS 培養(yǎng)基相比，經(jīng)0.25 MIC，0.50 MIC，0.75 MIC3 個亞MIC 的YP 4-1-1粗提物處理后的嗜水氣單胞菌和紫色桿菌的生長曲線處于同一生長水平，表明亞MIC 的YP 4-1-1 粗提物對嗜水氣單胞菌和紫色桿菌生長沒有抑制作用。

圖3 YP 4-1-1 粗提物對紫色桿菌CV026（a）和嗜水氣單胞菌LY-2（b）生長曲線的影響Fig.3 Effects of YP 4-1-1 crude extraction on growth curves of C.violaceum CV026（a）and A.hydrophila LY-2（b）

2.7 YP 4-1-1 粗提物對紫色桿菌素的降解作用

YP 4-1-1 粗提物對紫色桿菌素降解作用的瓊脂擴散結(jié)果如圖4a所示。由圖4a可知，隨著YP 4-1-1 粗提物質(zhì)量濃度升高，紫色暈圈的直徑逐漸減小，說明其對紫色桿菌素的降解作用越強。YP 4-1-1 粗提物對液體培養(yǎng)基中紫色桿菌素降解結(jié)果如圖4b所示。由圖4b可知，YP 4-1-1 粗提物的質(zhì)量濃度越高對紫色桿菌素的降解作用越強，并且具有質(zhì)量濃度依賴性。說明YP 4-1-1 粗提物在亞MIC 條件下對紫色桿菌QS 介導(dǎo)的紫色桿菌素有較好的降解作用。

圖4 YP 4-1-1 對紫色桿菌素的降解作用Fig.4 Degradation of purple bacillus by YP 4-1-1

2.8 YP 4-1-1 粗提物對嗜水氣單胞菌群體感應(yīng)表型的影響

采用0.0，1.0，2.0，3.0 mg/mL 的菌株YP 4-1-1 粗提物對嗜水氣單胞菌部分生物表型的作用結(jié)果如圖5所示。圖5a～d是YP 4-1-1 粗提物對淀粉酶、脂肪酶、蛋白酶和DNA 酶水解活性影響，當(dāng)質(zhì)量濃度為3.0 mg/mL 時，幾乎均不產(chǎn)生水解圈，其余2 個質(zhì)量濃度對其活性影響不顯著，由此看出，乳酸菌粗提物可抑制嗜水氣單胞菌4種酶的產(chǎn)生。

YP 4-1-1 粗提物對嗜水氣單胞菌溶血性的影響如圖5e所示，溶血圈的大小隨著YP 4-1-1粗提物質(zhì)量濃度的增大而減小，由此看出，乳酸菌粗提物可顯著抑制嗜水氣單胞菌溶血性的產(chǎn)生，降低其致病性。

由圖5f可知，與對照組相比乳酸菌粗提物處理組嗜鐵素的生成量顯著降低。乳酸菌粗提物處理組的黃色圈明顯小于空白組，隨著乳酸菌粗提質(zhì)量物濃度的增大，黃色圈的直徑逐漸減小，說明乳酸菌粗提物能夠有效抑制嗜水氣單胞菌嗜鐵素的產(chǎn)生進(jìn)而使其致病能力減弱。

乳酸菌粗提物對嗜水氣單胞菌泳動和群集的影響如圖5g～h所示。隨著乳酸菌粗提物質(zhì)量濃度的增加，嗜水氣單胞菌遷移直徑均呈逐漸下降的趨勢。

圖5 YP 4-1-1 粗提物對嗜水氣單胞菌部分表型的影響Fig.5 Effects of YP 4-1-1 crude extraction on virulent factor of A.hydrophila LY-2

2.9 乳酸菌菌株鑒定

菌株YP 4-1-1 的生理生化反應(yīng)結(jié)果如表3所示，依照文獻(xiàn)[22-23]可初步斷定菌株YP 4-1-1為清酒乳桿菌（Lactobacillus sakei）。

表3 菌株YP 4-1-1 的生理生化鑒定結(jié)果Table 3 Physiological and biochemical test results of strain YP 4-1-1

圖6 菌株YP 4-1-1 的16S rRNA 基因擴增電泳圖Fig.6 PCR amplification of 16S rRNA gene of strain YP 4-1-1

圖6是菌株YP 4-1-1 的16S rRNA 基因擴增電泳圖。由圖6可知可以看出菌株YP 4-1-1核酸序列在1 400 bp 左右出現(xiàn)特異性亮帶，表明目標(biāo)片段被成功擴增，擴增產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序。將菌株測序結(jié)果與NCBI 數(shù)據(jù)庫中已知序列比對，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，結(jié)果如圖7所示。由圖7可知，菌株YP 4-1-1與清酒乳桿菌MG669329.1 在同一個分支上，置信度為99%，因此菌株YP 4-1-1 被鑒定為清酒乳桿菌，該結(jié)果與生理生化鑒定結(jié)果相同。

3 結(jié)論

本文從傳統(tǒng)發(fā)酵食品以及海水魚腸道中篩選出一株對嗜水氣單胞菌AHLs 信號分子具有降解作用的菌株YP 4-1-1，對嗜水氣單胞菌C4-HSL，C6-HSL 信號分子的降解活性接近100%，YP 4-1-1 酶解AHLs 活性初步鑒定不是AHLs-內(nèi)酯酶的作用，可能是AHLs-酰基轉(zhuǎn)移酶或氧化還原酶的作用。經(jīng)生理生化反應(yīng)和16S rRNA 序列分析確定菌株YP 4-1-1 為清酒乳桿菌。在體外共培養(yǎng)試驗中，菌株YP 4-1-1可減弱嗜水氣單胞菌多種毒力因子的表達(dá)。本文從傳統(tǒng)發(fā)酵食品以及海水魚腸道中獲得對革蘭氏陰性菌AHLs 具有降解活性的乳酸菌菌株，為控制由AHLs 介導(dǎo)的革蘭氏陰性菌群體感應(yīng)機制研究提供借鑒與參考，也為實現(xiàn)通過群體感應(yīng)淬滅作用控制革蘭氏陰性菌導(dǎo)致的疾病提出一條新的思路。

圖7 菌株YP 4-1-1 的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹Fig.7 The phylogenetic tree for sequences of strain YP 4-1-1