響應(yīng)面法優(yōu)化籽瓜皮瓤飼料發(fā)酵工藝的研究

■買爾哈巴·艾合買提 楊新平 龍宣杞 楊 蓉 張日俊

（1.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物應(yīng)用研究所新疆特殊環(huán)境微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆烏魯木齊830091；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)飼料生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室 動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100193）

籽瓜屬葫蘆科(Cucurbitaceae)西瓜屬(Citrullus)西 瓜種(Lanatas)栽培西瓜亞種(ssp.vulgaris)的一個(gè)變種(var.megalasperms Linet Chao)，是“籽用西瓜”的簡(jiǎn)稱[1]，又名打瓜，一年生草本植物，喜生長(zhǎng)在沙壤土中，耐瘠薄，耐旱怕澇，喜溫耐熱，具有很高的食用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值[2]。籽瓜分黑籽瓜和紅籽瓜2 種，黑籽瓜盛產(chǎn)于新疆、甘肅、內(nèi)蒙古、寧夏、青海五省區(qū)，紅籽瓜主要分布在廣西、安徽、江西、湖南、黑龍江及廣東等省區(qū)，呈現(xiàn)出南“紅”北“黑”的生產(chǎn)格局[3]。

目前籽瓜已成為新疆的特色產(chǎn)業(yè)，尤其是北疆的塔城和阿勒泰兩地區(qū)，2018 年籽瓜生產(chǎn)面積就達(dá)21 萬(wàn)公頃以上，產(chǎn)量達(dá)30萬(wàn)噸[4]。隨著種植范圍的擴(kuò)大，隨之而來(lái)的是農(nóng)副產(chǎn)物的后處理問(wèn)題。籽瓜主要是以取籽加工為主，瓜皮瓜瓤丟棄在田間，造成巨大的資源浪費(fèi)和環(huán)境污染。籽瓜取籽加工后的副產(chǎn)物籽瓜汁、籽瓜瓤和籽瓜皮的再利用，不僅能提高籽瓜的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，還能減少環(huán)境污染。因此，亟需對(duì)此進(jìn)行資源的開發(fā)與應(yīng)用。

目前國(guó)內(nèi)對(duì)于籽瓜的研究多為籽瓜皮和瓤中有效活性成分的提取和利用等[5-9]，還未有研究作為飼料使用。針對(duì)目前籽瓜瓜瓤、瓜皮部分因無(wú)法得到及時(shí)有效地加工利用造成的資源浪費(fèi)現(xiàn)狀，可利用微生物發(fā)酵技術(shù)對(duì)籽瓜皮瓤進(jìn)行發(fā)酵制作飼料，不僅提高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，還可以緩解發(fā)展現(xiàn)代畜牧業(yè)與飼料來(lái)源不足的矛盾，且技術(shù)簡(jiǎn)單易行、便于推廣，發(fā)展前景十分廣闊，也是畜禽飼料資源開發(fā)的安全高效方法。

1 材料與方法

1.1 發(fā)酵原料

籽瓜、干麥草和豆粕粉，均由新疆烏魯木齊五家渠103團(tuán)團(tuán)場(chǎng)提供。

菌種：嗜酸乳桿菌、釀酒酵母和枯草芽孢桿菌，由新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物應(yīng)用研究所菌種保藏中心保藏。

發(fā)酵袋：具有單向排氣閥裝置，規(guī)格50 cm×80 cm，袋裝容量30 kg。

培養(yǎng)基：濃度為5 g/l 的葡萄糖活化溶液，用于活化凍干菌粉。

1.2 籽瓜發(fā)酵飼料制備

1.2.1 原料預(yù)處理

選取新鮮無(wú)腐爛籽瓜皮瓤，將籽瓜皮粉碎為顆粒，籽瓜瓤勻漿，混合后瀝干水分6～8 h，備用；干麥草和豆粕粉碎備用。

1.2.2 菌劑制備

將嗜酸乳桿菌、釀酒酵母和枯草芽孢桿菌經(jīng)培養(yǎng)基活化并配置成活菌數(shù)分別為105、106、107cfu/g 的凍干菌粉，以1∶1∶1混合制備復(fù)合菌發(fā)酵菌劑。

1.2.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及發(fā)酵

試驗(yàn)將復(fù)合菌發(fā)酵籽瓜皮瓤飼料設(shè)計(jì)4個(gè)處理，CK處理(不添加任何菌)；處理1(添加105cfu/g的復(fù)合菌)；處理2(添加106cfu/g的復(fù)合菌)；處理3(添加107cfu/g的復(fù)合菌)。將準(zhǔn)備好的籽瓜皮瓤、干麥草和豆粕按7∶2∶1比例混合，按照3%重量比分別添加復(fù)合菌發(fā)酵菌劑，充分?jǐn)嚢杌旌暇鶆虬l(fā)酵原料后以30 kg/袋的量裝入發(fā)酵袋中，每裝20 cm高度做一次踩實(shí)壓緊，密封；發(fā)酵初始溫度為37 ℃，發(fā)酵時(shí)溫度不高于42 ℃，發(fā)酵30 d后取樣進(jìn)行感官評(píng)價(jià)(見表1)、發(fā)酵品質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)成分測(cè)定。

表1 感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)(滿分30分)

1.2.4 發(fā)酵工藝參數(shù)的優(yōu)化

①單因素試驗(yàn)。在復(fù)合菌發(fā)酵籽瓜皮瓤飼料中，很多因素影響發(fā)酵效果，選定復(fù)合菌接種量、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時(shí)間為因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)，以確定主要影響因素。②響應(yīng)面法分析。根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，確定影響發(fā)酵的主要因素，根據(jù)Box-Benhnken 中心組合設(shè)計(jì)原理進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)[10-12]，然后通過(guò)采用Design Expert 8.0.6軟件分析，確定響應(yīng)面分析的因素水平，獲得優(yōu)化分析表，通過(guò)試驗(yàn)結(jié)果得出理論最佳條件，并進(jìn)一步進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)以檢驗(yàn)?zāi)Ｐ偷挠行浴?/p>

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理發(fā)酵后各項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果

2.1.1 感官評(píng)價(jià)(見表2)

根據(jù)感官評(píng)定結(jié)果所示，相對(duì)于CK組，其他處理組的色澤都是黃綠色，呈酸香味，發(fā)酵原料質(zhì)地結(jié)構(gòu)良好、分布均勻，未出現(xiàn)霉菌污染或腐敗的現(xiàn)象；三個(gè)處理組的評(píng)分在26～28分之間，均高于25分，屬于1級(jí)優(yōu)良；CK組呈現(xiàn)出棕黃色、酸味，質(zhì)地結(jié)構(gòu)較差，并有輕度霉菌污染的情況，總評(píng)分為10分，屬于3級(jí)腐敗。

表2 籽瓜皮瓤發(fā)酵型復(fù)合飼料感官評(píng)價(jià)

2.1.2 不同處理對(duì)發(fā)酵品質(zhì)及營(yíng)養(yǎng)成分的影響(見表3)

從表3中可以看出，與CK組相比，不同處理組對(duì)籽瓜皮瓤發(fā)酵型復(fù)合飼料的總能、粗蛋白和粗脂肪均存在顯著影響(P＜0.05)；三個(gè)處理組粗灰分含量均顯著低于對(duì)照組(P＜0.05)；pH 值、半纖維素和纖維素含量在各組之間差異未達(dá)到顯著水平(P＞0.05)；不同復(fù)合菌處理組對(duì)有機(jī)酸含量存在顯著(P＜0.05)或極顯著(P＜0.01)的影響，各處理組中乳酸和乙酸含量表現(xiàn)為處理3＞處理2＞CK＞處理1，其中處理3 組的乳酸含量較CK 組提高了63.95%，較處理2 組提高了30.76%；其乙酸含量分別是CK、處理1和處理2組的3.04、3.07和1.51倍，差異均表現(xiàn)出極顯著水平(P＜0.01)；各處理組中丙酸含量表現(xiàn)為處理2＞處理3＞處理1＞CK，其中處理2和處理3顯著高于處理1和CK組；各組丁酸含量呈現(xiàn)出CK＞處理1＞處理2＞處理3，其中三個(gè)處理的丁酸含量極顯著低于CK組(P＜0.01)；這說(shuō)明發(fā)酵飼料中有機(jī)酸的含量和種類與添加的復(fù)合菌活菌數(shù)呈現(xiàn)一定的劑量依賴性。

2.1.3 不同處理對(duì)氨基酸含量的影響(見表4)

表4中列出了飼料發(fā)酵前后的氨基酸含量變化，可以看出，經(jīng)發(fā)酵后原料中Asp、Thr、Gly、Ala、Met、Tyr、His、Trp 的含量增加了10.21%～12.31%，Ser、Glu、Val、Leu、Phe、Lys、Pro、Arg、Cys 的含量增加了5.12%～9.26%；這說(shuō)明復(fù)合菌混合發(fā)酵增加了飼料中的氨基酸含量，提高了籽瓜皮瓤型復(fù)合飼料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。

表3 不同處理組籽瓜皮瓤發(fā)酵型復(fù)合飼料發(fā)酵品質(zhì)及營(yíng)養(yǎng)成分(鮮樣基礎(chǔ)，%)

表4 不同處理組氨基酸含量

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 接種量對(duì)籽瓜皮瓤發(fā)酵型復(fù)合飼料乳酸含量的影響

以30 kg/袋的量準(zhǔn)備發(fā)酵原料，分別以接種量為1%、2%、3%、4%、5%的比例添加復(fù)合菌劑充分混勻，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，發(fā)酵溫度為37 ℃，發(fā)酵30 d后取適量樣品測(cè)定乳酸含量，結(jié)果如圖1。

由圖1可知，籽瓜皮瓤復(fù)合型發(fā)酵飼料中的乳酸含量隨著接種量的增加出現(xiàn)了先升高后降低的趨勢(shì)，且30 kg 發(fā)酵底物接種量為3%時(shí)的乳酸含量達(dá)到最高，為20.11%，之后又有所降低。接種量是影響發(fā)酵效果的重要因素之一，接種量低，微生物生長(zhǎng)量不足，發(fā)酵周期延長(zhǎng)，發(fā)酵不徹底，影響產(chǎn)物合成；接種量過(guò)高則微生物生長(zhǎng)過(guò)度，容易造成底物缺氧，導(dǎo)致微生物活性產(chǎn)物的分泌受到抑制，發(fā)酵效果較差。另外，隨著乳酸含量的增加，pH逐漸降低，過(guò)酸的環(huán)境抑制菌體的生長(zhǎng)，因而發(fā)酵底物中乳酸含量會(huì)出現(xiàn)先升高后降低的現(xiàn)象。由單因素方差分析的結(jié)果可知，接種量對(duì)復(fù)合發(fā)酵飼料的乳酸含量有顯著的影響。

圖1 接種量對(duì)籽瓜皮瓤發(fā)酵飼料乳酸含量的影響

2.2.2 發(fā)酵初始溫度對(duì)籽瓜皮瓤發(fā)酵型復(fù)合飼料乳酸含量的影響

以30 kg/袋的量準(zhǔn)備發(fā)酵原料，以3%的接種量添加復(fù)合菌劑攪拌混勻，分別置于22、27、32、37、42 ℃發(fā)酵，每個(gè)處理3 個(gè)重復(fù)，發(fā)酵30 d 后取適量樣品測(cè)定乳酸含量，結(jié)果如圖2。

圖2 發(fā)酵初始溫度對(duì)籽瓜皮瓤發(fā)酵飼料乳酸含量的影響

圖2中的結(jié)果表明，復(fù)合發(fā)酵飼料中的乳酸含量隨著初始溫度的升高出現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，溫度為37 ℃時(shí)乳酸含量達(dá)到最高，為19.79%，之后逐漸降低。微生物生長(zhǎng)都有各自的最適生長(zhǎng)溫度，溫度變化對(duì)每種類型微生物的代謝生長(zhǎng)過(guò)程都會(huì)產(chǎn)生影響，從而改變它們的生長(zhǎng)速率，以適應(yīng)溫度的變化而生存，溫度過(guò)高或過(guò)低均不利于微生物的代謝活動(dòng)，從而影響發(fā)酵效果。試驗(yàn)中控制適當(dāng)?shù)陌l(fā)酵溫度顯得尤為重要。由單因素方差分析可知，溫度對(duì)發(fā)酵籽瓜復(fù)合型飼料中的乳酸含量有顯著影響。

2.2.3 發(fā)酵時(shí)間對(duì)籽瓜皮瓤發(fā)酵型復(fù)合飼料乳酸含量的影響

以30 kg/袋的量準(zhǔn)備發(fā)酵原料，以3%的接種量添加復(fù)合菌劑攪拌混勻，置于37 ℃分別發(fā)酵10、20、30、40、50 d，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，發(fā)酵結(jié)束后取適量樣品測(cè)定乳酸含量，結(jié)果如圖3。

圖3 發(fā)酵時(shí)間對(duì)籽瓜皮瓤發(fā)酵飼料乳酸含量的影響

由圖3可知，籽瓜皮瓤發(fā)酵復(fù)合型飼料中的乳酸含量在10～30 d內(nèi)呈現(xiàn)增加的趨勢(shì)，發(fā)酵30 d時(shí)乳酸含量達(dá)到最高，為20.03%，之后逐漸降低。由單因素方差分析可知，發(fā)酵時(shí)間對(duì)籽瓜皮瓤發(fā)酵飼料中乳酸含量有顯著影響。

2.3 響應(yīng)面法分析

通過(guò)單因素試驗(yàn)可知接種量、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時(shí)間對(duì)籽瓜皮瓤發(fā)酵飼料中的乳酸含量具有顯著的影響，針對(duì)響應(yīng)面分析的試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素及水平見表5。采用Design Expert 8.0.6 軟件進(jìn)行分析，響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果見表6。

采用Design Expert 8.0.6 軟件分析后得出優(yōu)化的響應(yīng)值的動(dòng)態(tài)參數(shù)方程。

表5 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平及編碼

以籽瓜皮瓤發(fā)酵型復(fù)合飼料中乳酸含量為優(yōu)化指標(biāo)，三因素兩兩組合的響應(yīng)面立體圖見圖4。

通過(guò)軟件分析可知，決定系數(shù)R2=0.974 6,說(shuō)明三個(gè)因素及二次項(xiàng)能很好地解析Y的變化，Y的變異系數(shù)為0.34%，說(shuō)明模型擬合程度很好?；貧w模型存在穩(wěn)定點(diǎn)，穩(wěn)定點(diǎn)是極大值點(diǎn)，得到極大值時(shí)所對(duì)應(yīng)的各主要因素的編碼(A，B，C)分別為(0.074，-0.026，-0.146)。其對(duì)應(yīng)的實(shí)際值(3.15，36.87，28.53)最佳發(fā)酵條件：接種量為3.15%，發(fā)酵溫度為36.87 ℃，發(fā)酵時(shí)間為28.53 d。

圖4 接種量、發(fā)酵溫度與發(fā)酵時(shí)間的響應(yīng)面圖和等高線圖

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

以最佳發(fā)酵條件參數(shù)進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，測(cè)得籽瓜皮瓤發(fā)酵飼料中乳酸含量19.71%，模型預(yù)測(cè)的乳酸含量理論結(jié)果為19.69%，理論值與試驗(yàn)值之間良好的擬合性證實(shí)了模型的有效性，說(shuō)明該模型能很好地反映實(shí)際的發(fā)酵情況。

3 討論

籽瓜是一種營(yíng)養(yǎng)含量豐富的食品,其富含鉀、鈣、鎂、鐵、鋅、硒等微量元素，瓜籽中的維生素D、B6、E、B2含量相對(duì)較高，瓜皮和瓜瓤中的維生素C含量相對(duì)較高[13-14]。此外，籽瓜籽是一種優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)來(lái)源，蛋白質(zhì)含量為35%左右[15]。本研究中籽瓜與干麥草和豆粕粉混合復(fù)合菌發(fā)酵處理后，顯著提高了飼料的總蛋白和氨基酸含量。發(fā)酵產(chǎn)物與對(duì)照組相比，在感官評(píng)價(jià)上具有較強(qiáng)的芳香味或酸香味，可使皮瓤結(jié)構(gòu)保持良好，提高了發(fā)酵飼料的適口性，同時(shí)具有較高的干物質(zhì)和多糖含量，較低的灰分，在一定程度上減少了籽瓜皮瓤飼料的營(yíng)養(yǎng)損失，提高其可消化性。

籽瓜皮瓤原料中的水分含量較高，處理前的晾曬和水分的控制是比較關(guān)鍵的一步，因此本研究中原料的水分控制在70%，以避免水分太高而導(dǎo)致霉變。選擇合適的發(fā)酵菌劑是提高發(fā)酵品質(zhì)的質(zhì)量保障，我們選擇了發(fā)酵飼料常用的三種微生物菌種。乳酸菌被認(rèn)為是發(fā)酵飼料中最重要的因素之一，它能夠迅速產(chǎn)生乳酸降低飼料pH值，抑制霉菌和梭狀芽孢桿菌等有害菌的生長(zhǎng)從而使發(fā)酵飼料得以保存[16-18]。釀酒酵母是最為常見的發(fā)酵菌株，其不但富含齊全的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，且經(jīng)酵母菌發(fā)酵過(guò)的飼料也具有獨(dú)特的色、香、味，飼料適口性得到顯著改善[19]。枯草芽孢桿菌作為一種常用于固態(tài)發(fā)酵飼料的菌種，自身蛋白含量較高，可以分泌蛋白酶、纖維素酶、淀粉酶、脂肪酶等多種酶類，提高發(fā)酵飼料中粗蛋白、小肽、維生素和異黃酮苷的含量，從而增強(qiáng)抗氧化能力[20]。因此，對(duì)于從未研究過(guò)制作發(fā)酵飼料的籽瓜原料來(lái)說(shuō)，選擇適當(dāng)?shù)奈⑸锾砑觿┮约敖臃N量是具有挑戰(zhàn)性的嘗試。

發(fā)酵飼料中有機(jī)酸的含量也是評(píng)價(jià)其品質(zhì)優(yōu)劣的標(biāo)準(zhǔn)之一。本研究結(jié)果顯示，復(fù)合微生物處理組有效增加了乳酸、乙酸和丙酸在總有機(jī)酸中所占比例，而減少了丁酸所占比例，達(dá)到了差異顯著水平。除了復(fù)合菌活菌數(shù)不同的影響以外，其他發(fā)酵工藝條件也會(huì)影響發(fā)酵產(chǎn)物的品質(zhì)，尤其影響乳酸含量。考慮到眾多因素中影響發(fā)酵品質(zhì)的最關(guān)鍵的幾個(gè)因素，我們利用單因素試驗(yàn)考察了接種量、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時(shí)間對(duì)乳酸含量的影響，再通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化了籽瓜發(fā)酵飼料的發(fā)酵工藝，以此進(jìn)一步提高發(fā)酵品質(zhì)。

利用現(xiàn)代飼料生物技術(shù)手段能及時(shí)有效地對(duì)籽瓜瓜瓤、瓜皮加工利用，節(jié)約資源，保護(hù)農(nóng)田的生態(tài)平衡，有利于提高籽瓜生產(chǎn)基地的競(jìng)爭(zhēng)力，同時(shí)利用微生物發(fā)酵技術(shù)獲得的安全高效的籽瓜皮瓤發(fā)酵型復(fù)合飼料，是緩解當(dāng)前人畜爭(zhēng)糧矛盾的重要途徑。

4 結(jié)論

表6 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

利用響應(yīng)面分析法中的Box-Behnken design中心復(fù)合試驗(yàn)，以接種量3%、發(fā)酵溫度37 ℃、發(fā)酵時(shí)間30 d為水平中心點(diǎn)進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)，優(yōu)化了籽瓜皮瓤發(fā)酵型復(fù)合飼料的最佳發(fā)酵工藝。單因素試驗(yàn)結(jié)果表明，接種量、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時(shí)間對(duì)試驗(yàn)結(jié)果具有顯著性影響。通過(guò)響應(yīng)面優(yōu)化籽瓜皮瓤復(fù)合飼料發(fā)酵工藝，最佳發(fā)酵條件：接種量為3.15%，發(fā)酵溫度為36.87 ℃，發(fā)酵時(shí)間為28.53 d。在此條件下測(cè)得發(fā)酵產(chǎn)物中的乳酸含量為19.71%。驗(yàn)證試驗(yàn)證明該參數(shù)可行。

因此，本研究結(jié)果為實(shí)際生產(chǎn)籽瓜復(fù)合發(fā)酵飼料的工藝提供試驗(yàn)與理論支撐，但是仍需要進(jìn)行放大試驗(yàn)、中試等進(jìn)一步研究，以更好地應(yīng)用實(shí)際生產(chǎn)。